DON通過TNF信號通路誘導(dǎo)驢睪丸支持細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制

張孝忠，徐艷，劉藝丹，孫瀟，孫玉江，張國梁

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島266109；2.榮成市崖頭畜牧獸醫(yī)站，山東榮成264300)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)是一種由禾谷鐮刀菌產(chǎn)生的霉菌毒素，也被稱為嘔吐毒素(Vomitoxin)[1]。2017年，我國出臺國標(biāo)規(guī)定飼料原料中DON含量不得超過5 mg·kg-1，犢牛、羔羊、泌乳期精料補(bǔ)充料以及豬配合飼料中DON含量不得超過1 mg·kg-1[2]。但關(guān)于驢飼草料中DON含量標(biāo)準(zhǔn)一直沒有明確規(guī)定。江蘇奧邁生物科技有限公司2020年9月檢測報告表明，全國范圍內(nèi)飼料原料中玉米及玉米副產(chǎn)品DON含量較高，達(dá)到1 564.24 μg·kg-1。動物攝入DON后會出現(xiàn)腹瀉、嘔吐、食欲廢絕、腸道出血、代謝紊亂、繁殖性能降低、發(fā)育受阻等癥狀[3]。有報道表明，驢誤食霉菌毒素后會發(fā)生肺水腫、肝出血、腎水腫、脾淤血、腸道積液等病變，嚴(yán)重時則會導(dǎo)致驢死亡[4-6]。DON具有胚胎毒性，可導(dǎo)致動物母體流產(chǎn)，出現(xiàn)畸胎或死胎[7-8]。DON能抑制蛋白質(zhì)合成、DNA復(fù)制和RNA轉(zhuǎn)錄，同時干擾核糖體循環(huán)[9]。LAN等[10]的研究表明，DON能通過提高細(xì)胞內(nèi)活性氧誘導(dǎo)小鼠卵母細(xì)胞凋亡。最為嚴(yán)重的是，DON具有致癌、致畸、致突變的“三致”作用[9]。1993年國際癌癥研究中心將DON列為第三類致癌物質(zhì)。

根據(jù)國家統(tǒng)計局2019年發(fā)布數(shù)據(jù)顯示，我國現(xiàn)有驢品種24個，存欄量約260.07萬頭[11]。隨著社會發(fā)展，我國驢存欄量逐年大幅下降[12]。目前我國驢的養(yǎng)殖由散養(yǎng)逐漸向集約化飼養(yǎng)轉(zhuǎn)型。我國集約化飼養(yǎng)起步較晚，還有許多技術(shù)問題有待解決，而霉菌毒素尤其是DON在飼草料中污染，是驢集約化飼養(yǎng)所面臨的主要問題之一。

睪丸支持細(xì)胞(Sustentacular cell,Sertoli cell,SC)具有支持、營養(yǎng)、釋放、分泌、吞噬等多種功能，是組成血-睪屏障和生精上皮的重要組成部分[13-15]，為精子發(fā)生和成熟提供了必要環(huán)境和營養(yǎng)，同時分泌多種物質(zhì)確保精子發(fā)生[16]。任何影響支持細(xì)胞發(fā)育、損傷支持細(xì)胞功能的因素都會對精子發(fā)生產(chǎn)生嚴(yán)重影響[17]。已知DON對雄性動物生殖系統(tǒng)具有毒性作用，但DON毒性機(jī)制尚不完全清楚[18-21]。本研究利用RNA-seq分析評估10 μmol·L-1和30 μmol·L-1DON在驢睪丸支持細(xì)胞體外培養(yǎng)的毒性反應(yīng)，為進(jìn)一步研究DON毒性作用，為國家制定驢飼草料DON含量標(biāo)準(zhǔn)和研究DON對馬屬動物睪丸發(fā)育影響提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與試劑

DON (A606587-0001)購自生工生物工程股份有限公司；DMSO (D8371)、青-鏈霉素混合液(PS,P1400)、丙酮酸鈉(SP,SP0100)、非必需氨基酸(NEAA,N1250)、透明質(zhì)酸酶(H8030)、膠原酶Ⅳ (C8160)、Dnase Ⅰ (D8071)均購自索萊寶科技有限公司；FBS (ST30-3302)購自PAN；DMEM/HIGH GLUCOSE (SH30022.01)、0.25 mL·L-1胰酶(SH30042.01)購自Hyclone；TUNEL BrightRed Apoptosis Detection Kit (A113)購自諾唯贊生物科技有限公司；Annexin V-FITC/7-AAD凋亡試劑盒(APK10448-F)購自義翹神州生物技術(shù)有限公司；RNAex Pro Reagent (AG21101)購自艾科瑞生物工程有限公司。

1.2 驢睪丸收集與睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)處理

取屠宰公驢的睪丸，置于37 ℃含雙抗的生理鹽水中，30 min內(nèi)運(yùn)回實驗室。生理鹽水沖洗驢睪丸2～3次，無水乙醇中浸泡30 s，無菌磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate buffer saline,PBS)沖洗3遍，除去白膜，剪取一塊睪丸實質(zhì)，去除可見血管和結(jié)締組織，用含雙抗的PBS沖洗后將組織塊兒剪碎成1～3 mm2碎塊，移入50 mL離心管中，加入3倍體積膠原酶IV與0.2 mL·L-1透明質(zhì)酸酶混合消化液，37 ℃消化15 min，隨時觀察曲細(xì)精管分散情況；將消化液移入50 mL離心管，加入等體積DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基，1 200 r·min-1離心5 min，棄上清，重復(fù)2次；加入5倍體積37 ℃預(yù)熱的10 μg·mL-1DNase I與 0.25 mL·L-1胰酶混合消化液，37 ℃培養(yǎng)箱消化5 min，期間每分鐘震蕩一次，隨時觀察消化情況；加入等體積含10 mL·L-1FBS的培養(yǎng)液終止消化；通過200目和300目不銹鋼細(xì)胞篩過濾得到細(xì)胞懸液；將得到的細(xì)胞懸液1 200 r·min-1離心5 min，使用含10 mL·L-1FBS的DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)8 h后換液。使用10 μmol·L-1和30 μmol·L-1DON連續(xù)處理細(xì)胞72 h。

1.3 TUNEL檢測

收集細(xì)胞，使用4 mL·L-1多聚甲醛室溫固定30 min，取懸液于APES處理載玻片上，并涂抹均勻，置于42 ℃熱臺烤干。1 × PBS洗2次，每次5 min。去除多余液體，0.5 mL·L-1Triton X-100通透10 min。1×PBS洗3次，每次5 min。去除多余液體，置于濕盒中保持濕潤。按照TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行TUNEL標(biāo)記，使用Hoechst 33342復(fù)染，最后滴加100 μL抗熒光淬滅封片劑，加蓋玻片，4 ℃避光保存。620 nm ± 20 nm熒光下觀察BrightRed紅色熒光，在460 nm熒光下觀察Hoechst 33342。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

收集細(xì)胞，用4 ℃預(yù)冷的1×PBS洗細(xì)胞2次，300 r·min-1離心5 min棄上清，1×Binding Buffer重懸細(xì)胞至細(xì)胞密度為1 × 106個·mL-1。設(shè)置陰性對照組、單染對照組、試驗對照組和試驗處理組。取100 μL細(xì)胞懸液，加入5 μL Annexin V-FITC及5 μL 7-AAD，輕輕混勻，25 ℃避光孵育15 min。加入400 μL 1×Binding Buffer終止反應(yīng)，上機(jī)檢測。

1.5 RNA提取和轉(zhuǎn)錄組分析

1 mL RNAex Pro Reagent裂解并收集樣本，7 500 r·min-14 ℃離心5 min。取上清加同體積異丙醇，上下顛倒混勻后室溫放置10 min。12 000 r·min-14 ℃離心10 min，棄上清。加1 mL 75 % DEPC水配置酒精。短暫渦旋后7 500 r·min-14 ℃離心5 min，棄上清，風(fēng)干10 min。加30 μL DEPC水溶解RNA。RNA測序由Novogene(中國北京)使用Hiseq 4 000平臺進(jìn)行，每組有3個生物學(xué)重復(fù)。

1.6 差異表達(dá)基因的數(shù)據(jù)預(yù)處理和鑒定

測序數(shù)據(jù)分組為對照(CTRL)組、10 μmol·L-1處理組、30 μmol·L-1處理組，使用NovoMagic平臺對驢睪丸支持細(xì)胞進(jìn)行分析、鑒定差異表達(dá)基因(Differential expression gene,DEGs)。使用DEseq2檢測差異表達(dá)基因。測序時每組有3個生物學(xué)重復(fù)，設(shè)置參數(shù)|log 2 FoldChange|>1，Padj<0.05。使用NovoMagic平臺對DEGs進(jìn)行差異表達(dá)分析和功能富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DON暴露誘導(dǎo)驢睪丸支持細(xì)胞的凋亡

使用10 μmol·L-1和30 μmol·L-1濃度DON處理體外培養(yǎng)的驢睪丸支持細(xì)胞72 h (圖1)。TUNEL結(jié)果(圖1A，圖1C)顯示DON暴露可導(dǎo)致驢睪丸支持細(xì)胞凋亡，其凋亡率：CTRL組為0.7 %±0.1%；10 μmol·L-1DON處理組為11.1 %±0.4%；30 μmol·L-1DON處理組為19.5 %±0.3%，與DON濃度呈正相關(guān)。利用流式細(xì)胞儀檢測凋亡顯示DON處理72 h后，10 μmol·L-1DON處理組凋亡率達(dá)到2.75%±0.06%，30 μmol·L-1DON處理組凋亡率達(dá)到4.22%±0.07%(圖1B)。這一結(jié)果同樣說明DON誘導(dǎo)驢睪丸支持細(xì)胞凋亡比例隨濃度增加逐漸升高。

2.2 DON暴露改變了驢睪丸支持細(xì)胞基因表達(dá)

為探究DON對驢睪丸支持細(xì)胞中基因表達(dá)的影響，我們利用RNA-seq的方法篩選DEGs。與CTRL組相比較，在10 μmol·L-1處理組檢測到7 190個DEGs，其中上調(diào)DEGs共3 742個，下調(diào)DEGs共3 466個；30 μmol · L-1處理組檢測到9 336個差異表達(dá)基因，其中上調(diào)DEGs共5 393個，下調(diào)DEGs共3 943個。與10 μmol·L-1DON處理組相比較，在30 μmol·L-1DON處理組中共檢測到2 259個DEGs，其中上調(diào)DEGs共1 608個，下調(diào)DEGs共651個(圖2A，2D)。主成分分析(PCA)顯示30 μmol·L-1DON處理組比10 μmol·L-1DON處理組距離CTRL組更遠(yuǎn)(圖2B)，DEGs熱圖結(jié)果顯示30 μmol·L-1DON處理組基因表達(dá)差異比10 μmol·L-1DON處理組更顯著(圖2C)，VENN分析結(jié)果顯示30 μmol·L-1DON處理組差異基因、與10 μmol·L-1DON處理組差異基因存在明顯差異(圖2D)。因此，30 μmol·L-1DON處理組比10 μmol·L-1DON處理組差異更顯著。

2.3 差異表達(dá)基因功能分析

為闡明差異表達(dá)基因的功能，我們將30 μmol·L-1DON處理組中上調(diào)的5 393個DEGs和3 943個下調(diào)的DEGs分別進(jìn)行KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信號通路富集分析(表1，表2)，根據(jù)padj<0.05的標(biāo)準(zhǔn)篩選顯著性高的信號通路(圖3)，上調(diào)的KEGG信號通路包括TNF信號通路(Padj=0.000 000 251，計數(shù)：47)、核因子-κB(Nuclear factor κB,NF-κB)信號通路(padj=0.002 053 236，計數(shù)：35)、白介素-17 (IL-17)信號通路(padj=0.000 156 991，計數(shù)：35)等信號通路，對KEGG分析結(jié)果繪制氣泡圖(圖3A)。下調(diào)的信號通路包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)合成(padj=0.000 506 098，計數(shù)：46)、磷酸戊糖途徑(padj=0.010 584 056，計數(shù)：12)、類固醇生物合成(padj=0.003 737 77，計數(shù)：10)、細(xì)胞周期(padj=0.030 698 793，計數(shù)：31)等38條信號通路，對前20條信號通路繪制氣泡圖(圖3B)。對TNF信號通路相關(guān)基因：TNF，NF-κB信號通路相關(guān)基因：NF-κB，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)合成通路相關(guān)基因：二烷基二磷酸低聚糖蛋白糖基轉(zhuǎn)移酶(Dolichyl-Diphosphooligosaccharide-Protein Glycosyltransferase,DDOST)、蛋白二硫化物異構(gòu)酶A4(Protein disulfide isomerase A4,PDIA4)，磷酸戊糖途徑相關(guān)基因：葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(Glucose 6-phosphate dehydrogenase,G6PD)，類固醇合成通路相關(guān)基因：24-脫氫膽固醇還原酶 (24-dehydrocholesterol reductase,DHCR24)。細(xì)胞周期相關(guān)基因：細(xì)胞周期依賴蛋白CDK2，睪丸癌標(biāo)志物L(fēng)IN28A、生長停滯DNA損傷可誘導(dǎo)蛋白Β(growth arrest and DNA damage-inducible geneβ,GADD45B)繪制熱圖(圖4)，結(jié)果顯示30 μmol·L-1DON處理組基因表達(dá)差異顯著。

表2 KEGG富集分析下調(diào)差異表達(dá)基因信號通路表Table 2 Differentially expressed gene signaling pathway of KEGG down-regulated enrichment analysis

(A)30 μmol·L-1 DON處理組上調(diào)DEGs KEGG信號通路富集分析氣泡圖；(B)30 μmol·L-1 DON處理組下調(diào)DEGs KEGG信號通路富集分析氣泡圖(A)Up-regulated DEGs KEGG signal pathway enrichment analysis bubble map in 30 μmol·L-1 DON processing group;(B)Down-regulated DEGs KEGG signal pathway enrichment analysis bubble map in 30 μmol·L-1 DON processing group圖3 對 30 μmol·L-1 DON處理組驢睪丸支持細(xì)胞差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG信號通路富集分析結(jié)果Fig.3 The results of KEGG signal pathway enrichment analysis on the differential genes expression of donkey sertoli cells in 30 μmol·L-1 DON treatment group

3 討論

我國是世界上唯一集驢養(yǎng)殖、屠宰、精加工及銷售消費(fèi)于一體的全產(chǎn)業(yè)鏈國家[22]。隨著社會發(fā)展，驢使役作用降低，全國驢存欄總量迅速下降，飼養(yǎng)方式由散戶養(yǎng)驢向集約化飼養(yǎng)迅速轉(zhuǎn)變。集約化養(yǎng)驢為驢養(yǎng)殖業(yè)減少成本，提高養(yǎng)驢效率，使得我國養(yǎng)驢業(yè)具有較高經(jīng)濟(jì)價值與扶貧價值，為我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展作出貢獻(xiàn)[23]。同時，我國集約化養(yǎng)驢也伴隨著諸多缺陷，飼料中的霉菌毒素特別是 DON 污染對集約化養(yǎng)驢造成了阻礙。本研究使用10 μmol·L-1和 30 μmol·L-1濃度DON體外處理驢睪丸支持細(xì)胞72 h，利用RNA-seq分析探究DON體外誘導(dǎo)驢睪丸支持細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，并通過TUNEL檢測，流式細(xì)胞檢測驗證DON誘導(dǎo)驢睪丸支持細(xì)胞凋亡率。

TUNEL檢測結(jié)果和流失細(xì)胞檢測結(jié)果均顯示處理組驢睪丸支持細(xì)胞凋亡率與DON濃度呈正相關(guān)。這一結(jié)果與廖美芳[24]等人利用DON處理IPEC-J2細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡結(jié)果一致，也與王琨[25]利用DON處理豬巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡結(jié)果一致。這一結(jié)果說明，DON 對驢睪丸支持細(xì)胞呈劑量依賴性趨勢發(fā)揮毒性作用。流式細(xì)胞檢測結(jié)果在第1象限(即7-AAD單陽性象限)有細(xì)胞被檢測到，說明該象限應(yīng)無細(xì)胞，故推測這是由于操作不當(dāng)引起的細(xì)胞機(jī)械性死亡，與藥物處理無關(guān)，計算凋亡率應(yīng)計算第2、3象限(即Annxiv-V、7-AAD雙陽性象限和Annxiv-V單陽性象限)之和。細(xì)胞凋亡發(fā)生途徑分為：線粒體途徑、死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑[26]。TNF是激活NF-κB的主要細(xì)胞因子，同時TNF也能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死[27-28]。DDOST是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白折疊酶[29]。PDIA4屬于蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶家族，通過羥基-二硫鍵氧化還原反應(yīng)參與蛋白質(zhì)合成過程二硫鍵形成。TNF信號通路是維持組織穩(wěn)態(tài)和防止炎癥病理的關(guān)鍵，與細(xì)胞存活和凋亡相關(guān)[30]。NF-κB信號通路誘導(dǎo)抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄[27]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 (包括蛋白合成下降、錯誤折疊等)會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載或失去穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡[31]。DON能通過激活NF-κB/iNOS信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[32]。KEGG分析結(jié)果表明TNF信號通路、NF-κB信號通路顯著上調(diào)(表1，圖1)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)合成信號通路顯著下調(diào)(表2，圖2)。TNF、NF-κB相對mRNA表達(dá)量顯著升高，DDOST、PDIA4相對mRNA表達(dá)量顯著降低(圖4)。這些結(jié)果充分說明DON能通過TNF/NF-κB信號通路誘導(dǎo)驢睪丸支持細(xì)胞凋亡，也能通過降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)合成信號通路，進(jìn)而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，導(dǎo)致驢睪丸支持細(xì)胞凋亡，最終破壞血睪屏障，并影響精子發(fā)生。

睪丸支持細(xì)胞可分泌多種激素[33]。磷酸戊糖途徑能分泌供膽固醇、類固醇等激素合成所需的NADPH+H+，在睪丸中較為活躍[34]。G6PD是磷酸戊糖途徑氧化反應(yīng)階段的關(guān)鍵酶，能催化葡萄糖-6-磷酸(Glucose 6-phosphate)形成6-磷酸葡萄糖酸-δ-內(nèi)脂(6-Phosphoglucono-δ-lactonase)，進(jìn)而使NADP+還原形成NADPH+H+[35]。DHCR24催化膽固醇的合成[36]。KEGG分析結(jié)果表明，DON顯著下調(diào)磷酸戊糖途徑和類固醇生物合成通路(表2)。G6DP、DHCR24相對mRNA表達(dá)量均顯著下降(圖4)。由此可得，DON能通過抑制磷酸戊糖途徑，尤其是NADPH+H+的分泌降低驢睪丸支持細(xì)胞類固醇激素合成，抑制睪丸內(nèi)激素分泌，最終影響睪丸生殖功能。

腫瘤的發(fā)展與細(xì)胞周期相關(guān)[37-38]。KEGG分析結(jié)果中細(xì)胞周期通路在DON處理組中顯著下調(diào)(表2)，細(xì)胞周期依賴蛋白CDK2相對mRNA表達(dá)量顯著降低(圖4)。這一結(jié)果與ZHANG等[39]通過玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEA)處理小鼠卵巢顆粒細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在G1/S期，進(jìn)而引發(fā)顆粒細(xì)胞腫瘤發(fā)生結(jié)果一致。說明DON能通過干擾細(xì)胞周期通路，影響細(xì)胞周期，誘導(dǎo)驢睪丸支持細(xì)胞癌向變化，導(dǎo)致睪丸癌變風(fēng)險增加。滕鑫等[40]的研究表明LIN28A是睪丸腫瘤標(biāo)志物。GADD45B基因參與調(diào)控細(xì)胞周期停滯、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞生存與凋亡，并與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在多種腫瘤中檢測到高表達(dá)狀態(tài)[41]。LIN28A、GADD45B基因熱圖(圖4)結(jié)果表明其相對mRNA表達(dá)量均顯著升高，也證實DON能誘導(dǎo)睪丸發(fā)生癌向變化。

圖4 CTRL 組、10 μmol·L-1 DON處理組和30 μmol·L-1 DON處理組中TNF、NF-κB、DDOST、PDIA4、G6PD、DHCR24、CDK2、LIN28A、GADD45B基因熱圖Fig.4 Gene heat maps of TNF、NF-κB、DDOST、PDIA4、G6PD、DHCR24、CDK2、LIN28A、GADD45B in CTRL group,10 μmol·L-1 treatment group and 30 μmol·L-1 treatment group

KEGG分析結(jié)果得知，DON可引起IL-17信號通路、T細(xì)胞受體信號通路等炎癥相關(guān)信號通路上調(diào)。此外，KEGG結(jié)果顯示DON顯著下調(diào)細(xì)胞代謝及DNA復(fù)制相關(guān)信號通路(表2)，諸如：半胱氨酸和蛋氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、DNA復(fù)制、同源重組等。這些結(jié)果表明DON能引起驢睪丸支持細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，并干擾細(xì)胞正常代謝和DNA復(fù)制，但其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本次研究首次利用RNA-seq測序分析闡釋了DON能通過TNF/NF-κB信號通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)合成通路誘導(dǎo)驢睪丸支持細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴性發(fā)揮毒性作用。DON暴露增加驢睪丸支持細(xì)胞激素分泌異常，增加癌向變化風(fēng)險。DON還能增加睪丸炎癥發(fā)生，誘導(dǎo)基因突變。提示我們DON暴露會導(dǎo)致公驢血睪屏障破壞，引起生殖功能障礙和精子發(fā)生異常，并增加睪丸癌風(fēng)險，本研究將為后期國家制定驢飼草料DON含量標(biāo)準(zhǔn)提供理論借鑒，并對研究DON對雄性動物睪丸發(fā)育影響提供新的研究思路。