超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定甘蔗中3-硝基丙酸的不確定度評定

羅志榮，龐揚海，黃敏興*，曾秋霞，高裕鋒

(1廣東省科學(xué)院生物與醫(yī)學(xué)工程研究所，廣東廣州510316；2中國輕工業(yè)甘蔗制糖工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510316)

0 前言

甘蔗富含糖分，是我國最主要的制糖原料，也是人們喜愛食用的水果之一[1-4]。甘蔗的收成季節(jié)正值冬春季，尤其是在春季，雨水多，濕度大，甘蔗儲存不當(dāng)容易霉變，產(chǎn)生3-硝基丙酸(3-NPA)。3-硝基丙酸是一種神經(jīng)性毒素，可損害人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)，低劑量攝入人體后，即可致嘔吐、暈眩、抽搐、昏迷，甚至死亡[5-7]，因此對甘蔗中3-硝基丙酸的準確測定要求較高。目前3-硝基丙酸的檢測方法有液相色譜法[8]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[9]，相對于色譜法，質(zhì)譜法靈敏度更好，準確性更高。為檢查分析結(jié)果質(zhì)量、度量分析結(jié)果可信性，有必要對甘蔗中3-硝基丙酸進行不確定度評定。通過不確定度評定，可以有效分析檢驗過程中影響結(jié)果準確性的因素，提出降低結(jié)果不確定性的方法[10]。

本文參照胡重怡等[11]建立的甘蔗中3-硝基丙酸的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，對甘蔗樣品中3-硝基丙酸進行檢測。根據(jù)國家計量技術(shù)規(guī)范JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[12]的要求對測量結(jié)果的不確定度進行評定，通過建立數(shù)學(xué)模型對各個不確定度分量進行計算，找出影響甘蔗中3-硝基丙酸檢測準確性的主要因素。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

主要儀器：AB 5500 Q-Trap超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司)；Multi Reax多位渦旋振蕩器(德國Heidolph公司)；N-EVAP112氮吹儀(美國Organomation公司)；CL5R大容量冷凍離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司)；SB25-12 DTD超聲清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；UPC-I-60L型超純水機(成都超純科技有限公司)。

主要試劑：甲醇、乙腈、丙酮(色譜純，德國默克公司)；甲酸(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；氨水、氯化鈉(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；3-硝基丙酸(99.99%，上海安譜實驗科技股份有限公司)；PSA固相萃取柱(6 mL，500 mg，美國Waters公司)。

1.2 測定方法

稱取2 g甘蔗試樣于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，渦旋混勻，超聲20 min，加入5 g氯化鈉，混合均勻后，超聲10 min，10000 r/min離心5 min，收集上清液；用6 mL乙腈活化PSA固相萃取柱，將10 mL上清液過柱，用10 mL 1%氨水甲醇洗脫，收集洗脫液，氮吹至近干，用0.5%甲酸水溶液定容至5.0 mL，過濾膜，用于UPLC-MS/MS分析。

2 建立數(shù)學(xué)模型

通過對一系列已知濃度的3-硝基丙酸標準溶液的測定，根據(jù)測定的一系列響應(yīng)峰面積，儀器自動以最小二乘回歸法作出濃度-峰面積標準曲線，見公式⑴和公式⑵。

式中：A-峰面積；c-濃度；b-斜率；a-截距。

式中：w-樣品中3-硝基丙酸的質(zhì)量分數(shù)，μg/kg；ci-待測溶液中3-硝基丙酸的質(zhì)量濃度，μg/L；V-樣品定容體積，mL；m-樣品質(zhì)量，g；n-重復(fù)測定次數(shù)。

3 測量甘蔗中3-硝基丙酸的不確定度來源分析

測量不確定度是與測量結(jié)果緊密關(guān)聯(lián)的參數(shù)，能夠合理地賦予被測值的分散性，而該分散性主要包括A類不確定度、B類不確定度和合成不確定度。根據(jù)數(shù)學(xué)模型和測量過程，甘蔗中3-硝基丙酸的不確定度來源包括(如圖1所示)：①稱樣過程引入的不確定度urel(m1)，來源于電子天平的精度；②樣品定容過程引入的不確定度urel(V)，來源于定容容器的體積誤差和讀數(shù)誤差；③3-硝基丙酸標準物質(zhì)稱量引入的不確定度urel(m2)，來源于電子天平的精度；④3-硝基丙酸標準物質(zhì)純度引入的不確定度urel(c)；⑤標準溶液引入的不確定度urel(b)，來源于稀釋過程溶液移取器皿和定容容器的體積誤差和讀數(shù)誤差； ⑥標準曲線擬合的不確定度urel(l)；⑦測量甘蔗中3-硝基丙酸產(chǎn)生的不確定度urel(n)，來源于重復(fù)性測量引入的不確定度。

圖1 測定甘蔗中3-硝基丙酸含量的不確定度來源

4 不確定度分量評定

4.1 樣品稱量的不確定度urel(m1)

樣品稱量使用精度為0.01 g的電子天平，稱樣量為2.00 g，查天平檢定證書，U=0.02，k=2，相對不確定度為urel(m1)=0.02/2.00/2=5.00×10-3。

4.2 樣品定容引入的不確定度urel(V)

按照JJG 196-2006《常規(guī)玻璃量器檢定規(guī)程》[13]的規(guī)定，5 mL A級單標線吸量管容量允差為±0.0015 mL，按照矩形分布，不確定度為0.0015/=8.66×10-3；定容時估讀誤差±0.005 mL，引起的不確定度0.005/=2.89×10-3，其相對不確定度為：

4.3 3-硝基丙酸標準物質(zhì)稱量引入的不確定度urel(m2)

3-硝基丙酸標準物質(zhì)稱量使用精度為0.00001 g的電子天平，稱樣量為0.01000 g，查天平檢定證書，U=0.00003，k=2，其相對不確定度為urel(m2)=0.00003/2/0.01000=1.50×10-3。

4.4 3-硝基丙酸標準物質(zhì)純度引入的不確定度urel(c)

3-硝基丙酸標準物質(zhì)證書中給出的純度為99.30%，標準不確定度為±0.05%，k=2，因此相對不確定度為：urel(c)=0.05/2/99.30=2.52×10-4。

4.5 標準溶液引入不確定度urel(b)

⑴配制3-硝基丙酸標準儲備液產(chǎn)生的不確定度：稱量0.01000 g 3-硝基丙酸標準物質(zhì)，用甲醇溶解，并用10 mL(V0)容量瓶定容，得到1000 μg/mL的標準儲備液。

⑵配置標準使用液產(chǎn)生的不確定度：在本實驗中，標準工作曲線的濃度分別為20、10、5、1、0.5、0.1 μg/L。以10 μg/L標準溶液配制過程為例：用1 mL移液管準確吸取 3-硝基丙酸標準儲備液(1000 μg/mL)1 mL于10 mL容量瓶中，定容至刻度，得到100 μg/mL標準溶液；再用1 mL移液管準確吸取3-硝基丙酸標準溶液(100 μg/mL)1 mL于10 mL容量瓶中，定容至刻度，得到10 μg/mL標準溶液；再用1 mL移液管準確吸取3-硝基丙酸標準溶液(10 μg/mL)1 mL于10 mL容量瓶中，定容至刻度，得到1 μg/mL標準溶液；再用1 mL移液管準確吸取3-硝基丙酸標準溶液(1 μg/mL)1 mL于10 mL容量瓶中，定容至刻度，得到100 μg/L標準溶液；再用1 mL移液管準確吸取3-硝基丙酸標準溶液(100 μg/L)1 mL于10 mL容量瓶中，定容至刻度，得到10 μg/L標準溶液。3-硝基丙酸標準溶液濃度計算公式如式⑷所示。

其中：c1-3-硝基丙酸標準溶液濃度(10 μg/L)；c-3-硝基丙酸標準儲備液濃度(1000 μg/mL)；V移1-1 mL移液管的體積；V移2-1 mL移液管的體積；V移3-1 mL移液管的體積；V移4-1 mL移液管的體積；V移5-1 mL移液管的體積；V容1-10 mL容量瓶的體積；V容2-10 mL容量瓶的體積；V容3-10 mL容量瓶的體積；V容4-10 mL容量瓶的體積；V容5-10 mL容量瓶的體積；1 mL移液管和10 mL容量瓶的相對標準不確定度urel(V3)計算結(jié)果見表1，其相對不確定度見式⑸。

表1 移液管、容量瓶的相對標準不確定度分量

4.6 標準曲線最小二乘法擬合引入的不確定度urel(l)

制備3-硝基丙酸標準曲線，配制的6個標準濃度，分別平行進樣測定2次，峰面積見表2，擬合曲線方程為y=5954.1x+1898.6，因此a=1898.6，b=5954.1。發(fā)霉甘蔗樣品中3-硝基丙酸含量重復(fù)測 定數(shù)據(jù)見表3(n=10)。

表2 標準曲線峰面積-濃度值

表3 某發(fā)霉甘蔗樣品中3-硝基丙酸含量測定結(jié)果(n=10)

樣品中3-硝基丙酸平均濃度c0,=30.44 μg/L，計算得到甘蔗中3-硝基丙酸含量為152.20 μg/kg。標準溶液平均濃度為ˉc=(1+5+10+20+50+100)/6=31.0 μg/kg。urel(l)的計算公式為式⑹，殘差標準差S計算公式為式⑺，x的離差平方和Sxx計算公式為式⑻。

其中：n-測試標準溶液的次數(shù)，n=12；p-測試樣品的次數(shù)，p=10；c-各個標準溶液濃度的平均值，c=31.0 μg/kg；c0,-樣品濃度的平均值，c0,=30.44 μg/L；b-標準曲線斜率，b=593.7；a-標準曲線截距，a=217.7；i-下標，第幾個標準溶液；j-下標，獲得標準曲線的測量次數(shù)。代入數(shù)值計算得到urel(l)=4.59×10-3。

4.7 重復(fù)測量引入的不確定度urel(n)

單次測量標準不確定度為：

實際測量時在重復(fù)性試驗條件下獨立測定樣品10次(2個平行)的平均值作為檢測結(jié)果，平均值為30.44 μg/L，因此測量重復(fù)性引入的標準不確定度為：

因此相對標準不確定度為：

4.8 計算合成相對標準不確定度

各個不確定度分量計算值見表4，樣品標準溶液配制和重復(fù)性測定引入的不確定度是不確定度的主要來源。合成相對標準不確定度為：

表4 甘蔗中3-硝基丙酸測定相對不確定度分量評定結(jié)果

4.9 擴展不確定度表示方法

合成標準不確定度為uc=uc,rel×w=3.82×10-2×152.20=5.81 μg/kg。在95%置信水平下，包含因子取k=2，擴展不確定度為U=k×uc=2×5.81=11.62 μg/kg。實際甘蔗樣品的測定結(jié)果可表示為(152.20±11.62) μg/kg，k=2。

5 結(jié)論

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定甘蔗中3-硝基丙酸含量的過程中，影響3-硝基丙酸測定結(jié)果的不確定度主要來源為標準工作曲線的配制和重復(fù)性測定。因此優(yōu)化標準曲線配制的步驟和規(guī)范前處理減少重復(fù)誤差是減小不確定度的有效方法。