枯草芽孢桿菌蛋白酶結(jié)構(gòu)與表達(dá)載體分析

張榮宗，江丁文，陳錦香

（1.惠安縣鄉(xiāng)鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，福建 泉州 362100；2.惠安縣螺城鎮(zhèn)經(jīng)濟(jì)發(fā)展服務(wù)中心，福建 泉州 362100）

枯草芽孢桿菌能分泌多種酶，具有多種功能，能夠促進(jìn)腸道消化、體表消毒、消滅蚊蟲蜱蚤和寄生物、降解養(yǎng)殖水體有機(jī)質(zhì)、適應(yīng)高溫密閉環(huán)境、有較強(qiáng)的免疫原性、抑制有毒有害物質(zhì)生成和減少面源污染等；大腸桿菌、芽孢桿菌、酵母、昆蟲、哺乳動(dòng)物、線蟲動(dòng)物等生物細(xì)胞可以作為克隆、重組雜交、突變基因、轉(zhuǎn)基因的表達(dá)載體，它們的基因密碼子表達(dá)上存在偏好性，一般蛋白酶基因密碼子表達(dá)也存在偏好性[1-13]。本文擬分析枯草芽孢桿菌蛋白酶結(jié)構(gòu)，并比較其基因密碼子和生物細(xì)胞載體基因密碼子偏好性，以便選擇合適的宿主表達(dá)系統(tǒng)；所引用的序列數(shù)據(jù)為公開數(shù)據(jù)，用以了解與動(dòng)物生產(chǎn)科學(xué)、種質(zhì)資源和產(chǎn)品質(zhì)量、病蟲鼠害預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)、蠶絲和毛皮凈化、化學(xué)消毒和菌蟲殘留、良種基因細(xì)胞和胚胎保護(hù)、小微動(dòng)物藥用和療養(yǎng)、動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)肉、動(dòng)物飲水飼料飼草和食果食蔬、動(dòng)物屠宰加工、畜牧養(yǎng)殖設(shè)施保養(yǎng)、抗菌噴淋安全防護(hù)、生理生長(zhǎng)發(fā)育、色素發(fā)酵、營(yíng)養(yǎng)代謝、生態(tài)平衡、無(wú)害化處理和污染控制等有關(guān)的生物細(xì)胞表達(dá)，不負(fù)責(zé)侵權(quán)責(zé)任，其中選取的編碼基因?yàn)槌墒祀牡目莶菅挎邨U菌蛋白酶基因。

1 枯草芽孢桿菌蛋白酶結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

根據(jù)SWISS-MODEL的同源建模（homology modeling），對(duì)成熟肽的枯草芽孢桿菌蛋白酶氨基酸序列進(jìn)行三維空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖1所示。根據(jù)同源模型結(jié)果，模型和模板的序列同源性為98.91%，GMQE評(píng)估值為0.94，屬于可靠的模型[20]。

圖1 枯草芽孢桿菌蛋白酶預(yù)測(cè)模型Fig.1 Bacillus subtilisprotease prediction model

根據(jù)SAVES服務(wù)器的PROCHECK檢測(cè)，對(duì)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果的質(zhì)量進(jìn)行檢查，結(jié)果如圖2所示。圖中通過分析氨基酸殘基二面角ψ（psi）和φ（phi）是否分布在合理區(qū)域，揭示蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確性。由圖2可知，枯草芽孢桿菌蛋白酶三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型100%氨基酸殘基落在允許區(qū)，其中90.3%落在最適區(qū)，9.7%落在附加區(qū)，沒有落在寬容區(qū)，這表明預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)模型準(zhǔn)確度高，符合立體化學(xué)幾何結(jié)構(gòu)，具有較高的合理性，超過90%氨基酸殘基落在最適區(qū)，屬于高質(zhì)量的預(yù)測(cè)模型[14]。

圖2 枯草芽孢桿菌蛋白酶氨基酸殘基二面角分布Fig.2 Dihedral angledistribution of amino acid residues of Bacillus subtilis protease

RaptorX property在線預(yù)測(cè)成熟肽的枯草芽孢桿菌蛋白酶二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果表明，按照3類結(jié)構(gòu)劃分，枯草芽孢桿菌蛋白酶含有7個(gè)α-螺旋（H）結(jié)構(gòu)，由70個(gè)氨基酸組成；9個(gè)β-折疊（E）結(jié)構(gòu)，由35個(gè)氨基酸組成；17個(gè)不規(guī)則卷曲（C）結(jié)構(gòu)，由170個(gè)氨基酸組成。按照8類結(jié)構(gòu)劃分，枯草芽孢桿菌蛋白酶含有7個(gè)α-螺旋（H）結(jié)構(gòu)，由73個(gè)氨基酸組成；3個(gè)310-螺旋（G）結(jié)構(gòu)，由8個(gè)氨基酸組成；10個(gè)β-折疊（E）結(jié)構(gòu)，由49個(gè)氨基酸組成；2個(gè)β-橋（B）結(jié)構(gòu)，由2個(gè)氨基酸組成；19個(gè)β-轉(zhuǎn)角（T）結(jié)構(gòu)，由39個(gè)氨基酸組成；14個(gè)高度彎曲環(huán)（S）結(jié)構(gòu)，由19個(gè)氨基酸組成；34個(gè)不規(guī)則（L）結(jié)構(gòu)，由85個(gè)氨基酸組成。這說明，枯草芽孢桿菌蛋白酶主要結(jié)構(gòu)是α-螺旋和不規(guī)則結(jié)構(gòu)[15-20]。

2 編碼基因密碼子與生物載體基因比較分析

密碼子使用頻率（Codon Usage，CUSP）是指編碼基因密碼子的使用頻率。在進(jìn)行基因宿主細(xì)胞表達(dá)時(shí)，要使表達(dá)基因與宿主細(xì)胞的密碼子用法盡可能一致，以提高表達(dá)效率。目前常用的表達(dá)載體有大腸桿菌、酵母、枯草芽孢桿菌、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、線蟲動(dòng)物細(xì)胞等，大腸桿菌發(fā)酵底物和畢赤酵母碳源分別有糖類、甲醇等，枯草芽孢桿菌的表達(dá)系統(tǒng)安全、表達(dá)量高，昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)常用桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞，哺乳動(dòng)物細(xì)胞和線蟲動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)主要用病毒顆粒感染宿主細(xì)胞和顯微注射法等非病毒載體的方式將基因?qū)氲郊?xì)胞中，經(jīng)過成功轉(zhuǎn)化的重組菌可能更為安全有效[21-22]。

根據(jù)genebank（登錄號(hào)：MK673996.1）的芽孢桿菌蛋白酶編碼基因序列，比較了其成熟編碼基因密碼子與候選生物載體基因組密碼子使用偏性，選擇合適的生物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。由表1可知，枯草芽孢桿菌密碼子使用頻率與黑腹果蠅細(xì)胞基因組相比，使用偏性差異較大的有30個(gè)；與黑線倉(cāng)鼠CHO細(xì)胞基因組相比，使用偏性差異較大的有29個(gè)；與大腸桿菌基因組相比，使用偏性差異較大的有23個(gè)；與巴斯德畢赤酵母基因組相比，使用偏性差異較大的有19個(gè)。據(jù)此說明，枯草芽孢桿菌蛋白酶基因與黑腹果蠅細(xì)胞基因組密碼子使用偏性差異最大，而與巴斯德畢赤酵母基因組密碼子使用偏性差異最小，巴斯德畢赤酵母是枯草芽孢桿菌蛋白酶最適合的表達(dá)載體。

表1 枯草芽孢桿菌蛋白酶編碼基因與生物載體基因比較Tab.1 Comparison of Bacillus subtilis protease coding genes and biological carrier genes

3 結(jié)論

在基因表達(dá)中選擇合適的細(xì)胞表達(dá)載體系統(tǒng)，將有助于基因高效準(zhǔn)確表達(dá)，進(jìn)而提高表達(dá)的整體質(zhì)量。經(jīng)過對(duì)枯草芽孢桿菌蛋白酶同源建模的三維預(yù)測(cè)模型檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該模型超過90%氨基酸殘基落在最適區(qū)，屬于高質(zhì)量的預(yù)測(cè)模型，枯草芽孢桿菌蛋白酶主要結(jié)構(gòu)是α-螺旋和不規(guī)則結(jié)構(gòu)；對(duì)枯草芽孢桿菌蛋白酶基因與候選生物載體細(xì)胞基因組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌密碼子使用頻率與黑腹果蠅細(xì)胞基因組相比，使用偏性差異較大的有30個(gè)，差異最大；與巴斯德畢赤酵母基因組相比，使用偏性差異較大的有19個(gè)，差異最小；與其他細(xì)胞基因組相比，使用偏性差異居中。這表明，巴斯德畢赤酵母是枯草芽孢桿菌蛋白酶最適合的表達(dá)載體。