大球蓋菇液體菌種培養(yǎng)基的優(yōu)化*

劉克芳，于國榮，王華麗，程顯好，蓋宇鵬，李維煥**

（1.魯東大學農學院山東省食用菌技術重點實驗室，山東 煙臺 264025；2.山東藥品食品職業(yè)學院，山東 威海 264210）

大球蓋菇（Stropharia rugosoannulata） 別稱酒紅球蓋菇、皺環(huán)球蓋菇、赤松茸，屬擔子菌門（Basidomycota） 層菌綱 （Hymenomycetes） 傘菌目（Agaricales） 球蓋菇屬 （Stropharia）[1]，是聯(lián)合國糧農組織向發(fā)展中國家推薦栽培的食用菌品種之一[2]。其色澤艷麗，美味爽口[3]，營養(yǎng)豐富，具有“素中之葷”的美稱，很受消費者喜愛。

大球蓋菇具有很高的食用價值與藥用價值，子實體中含有豐富的蛋白質、多糖、甾醇、黃酮等營養(yǎng)成分[4]。研究發(fā)現(xiàn)，每100克大球蓋菇子實體中粗蛋白含量為29.1 g，富含人體必需的8種氨基酸[5]。據(jù)報道，大球蓋菇多糖可以有效預防冠心病，還可以助消化、軟化血管，緩解精神疲勞，增強免疫力，而且對小白鼠S180肉瘤及艾氏腹水癌的抑制率均達70%以上[6]，逐步用于抗癌藥物篩選。隨著經(jīng)濟的發(fā)展及生活水平的提高，消費者越來越重視食品健康問題。大球蓋菇是高蛋白，高鈣鉀鎂、低脂肪的綠色健康食品[7]，且栽培成本低，產(chǎn)量高，具有廣闊的發(fā)展前景[8]。

液體菌種是指采用液體培養(yǎng)基生產(chǎn)的菌絲體純培養(yǎng)物，菌絲體在培養(yǎng)基中呈絮狀或球狀[9]。相對于固體菌種，食用菌液體菌種生產(chǎn)技術具有周期短、產(chǎn)量高、接種方便、菌種用量少等優(yōu)點[10]，可顯著提高生物轉化率和生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，十分適合作為配套技術用于食用菌的工廠化生產(chǎn)[11]。當前，越來越多的專家、學者參與液體菌種和培養(yǎng)等相關研究[12]。

目前大球蓋菇的栽培仍沿用傳統(tǒng)的固體菌種接種方法，采用常規(guī)PDA培養(yǎng)基，菌絲不僅長速慢，而且生長狀態(tài)差，菌絲細弱[13]。制備原種或栽培種時，一般需要2個～3個月甚至更長時間才能完成菌絲萌發(fā)，極大地限制了大球蓋菇的生產(chǎn)。目前對大球蓋菇液體培養(yǎng)的研究少見報道[9]。

不同培養(yǎng)料配方對大球蓋菇菌絲生長有重要影響，通過探討稻殼浸出液、玉米面、黃豆面等不同組分對大球蓋菇液體菌絲生長的影響，對大球蓋菇液體培養(yǎng)基進行優(yōu)化，旨在獲得能夠降低生產(chǎn)成本、縮短生長周期、提高菌種質量的液體培養(yǎng)基配方，為工業(yè)化生產(chǎn)大球蓋菇液體菌種提供經(jīng)濟、適用、高效的培養(yǎng)基配方。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基與試劑

大球蓋菇菌種由魯東大學農學院山東省食用菌技術重點實驗室提供。

PDA固體培養(yǎng)基[14]：馬鈴薯（煮汁） 200 g、葡萄糖20 g、酵母浸膏3 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂1 g、瓊脂15 g，加水定容至1 L。121℃滅菌20 min。

設計母種液體培養(yǎng)基配方見表1。

表1 液體培養(yǎng)基配方Tab.1 The liquid components of mother culture

由表1所示，通過多種配方組合，以期從中篩選出優(yōu)良液體培養(yǎng)基配方。以1 L液體培養(yǎng)基為例，稱量100 g或200 g的稻殼，提前1 d用純水浸水過夜，取稻殼浸出液。稱取去皮馬鈴薯200 g切成小丁或者條狀放入不銹鋼鍋或鋁鍋中，加稻殼浸出液1 000 mL。煮沸15 min～20 min至馬鈴薯熟而不爛，用4層～6層紗布過濾，取濾液，補純水至1 L，加熱至沸。依次加入葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂1 g、酵母浸膏3 g以及占稻殼干料總重量10%～20%的玉米面或黃豆面。定容液體培養(yǎng)基為1 L，121℃滅菌 20 min。

麥粒培養(yǎng)基[15]：新鮮麥粒篩選干凈，浸泡24 h～48 h，放入鍋中煮至無硬心，撈出冷卻拌入麥粒干重0.1%的碳酸鈣，裝瓶，121℃滅菌2.5 h～3.0 h，出鍋冷卻至20℃。

1.2 儀器與設備

HZQ-Q全溫振蕩器，中國良友儀器；HPS-400生化培養(yǎng)箱，中國精達儀器制造有限公司；OHAUS分析天平，美國奧豪斯公司；超凈工作臺，中國亞泰科隆儀器技術有限公司；LZDX-50KB立式壓力蒸氣滅菌鍋，德國Systec公司；游標卡尺，中國雪鋒量具有限公司；AWL-1002-U艾科浦超純水系統(tǒng)，中國科瑞環(huán)保設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 母種活化

將供試菌種轉接到PDA斜面培養(yǎng)基，于25℃培養(yǎng)至滿管，備用[16]。

1.3.2 液體菌種制備及發(fā)酵

用直徑為5 mm的無菌打孔器取4塊生長最旺盛的平板菌落邊緣菌絲塊[17]。無菌條件下接入500 mL三角瓶中，瓶中裝液量為200 mL，液體菌種培養(yǎng)基按表1分別設置對照組（配方1） 和試驗組，每個配方接種5瓶。將三角瓶置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中 150 r·min-1、23℃、避光發(fā)酵培養(yǎng)[9]，每隔 24 h稱量液體發(fā)酵搖瓶質量，觀察菌絲球形狀。

培養(yǎng)8 d后，取10 mL培養(yǎng)液，倒入培養(yǎng)皿中，用游標卡尺測量10個菌絲球直徑，取平均值。測量完成后，將培養(yǎng)液用二層紗布過濾，把水擠壓干，用1/100電子天平（精度0.01 g）稱重菌絲球濕重，最后計算每100毫升培養(yǎng)液中菌絲球濕重。培養(yǎng)8 d后，將菌液過濾，菌絲體用蒸餾水充分洗滌，置于80℃干燥箱中烘干至恒重，用電子天平稱重測量菌絲球干重。

1.3.3 原種制備及培養(yǎng)

用移液槍取培養(yǎng)8 d的液體培養(yǎng)基菌液10 mL，接種于麥粒培養(yǎng)基（麥粒99.9%、碳酸鈣0.1%）中，每個配方接種5瓶。將原種置于培養(yǎng)室中，24℃～28℃黑暗條件下培養(yǎng)。

每天觀察玻璃瓶中菌絲顏色、菌絲長勢；每隔72 h測量菌絲長度，計算菌絲生長速度及平均滿瓶時間。

2 結果與分析

2.1 液體菌種生長情況

各配方培養(yǎng)8 d后，液體培養(yǎng)基大球蓋菇菌絲球生長情況見圖1及表2。

表2 液體菌種生長情況Tab.2 The measurement results of liquid spawn

由圖1可知，培養(yǎng)基配方對大球蓋菇液體菌絲球的生長狀態(tài)影響很大。配方4～配方9培養(yǎng)基所得菌絲球大小均勻且表面光滑；而配方1～配方3培養(yǎng)基所得菌絲球大小不均且表面有刺狀突起。配方1～配方3菌球直徑大小不一；配方4～配方9培養(yǎng)基所得菌絲球直徑明顯小于配方1～配方3的菌絲球；而配方5菌絲球平均直徑最小。

圖1 各配方菌絲球生長情況Fig.1 Growth of mycelium pellets in each formula

配方5、配方6、配方9菌絲球濕重較高，均大于15.00 g·100-1mL-1；配方5菌絲球濕重最大，為18.47 g·100-1mL-1；配方4、配方8菌絲球濕重較大，為10.00 g·100-1mL-1以上；而配方2、配方3、配方8菌絲球濕重較小，均小于7.00 g·100-1mL-1；配方2菌球濕重最小，為5.13 g·100-1mL-1。

配方4、配方5、配方6菌絲球干重較高，均大于1.50 g·100-1mL-1；配方5菌絲球干重最重，為2.01 g·100-1mL-1；配方2菌絲球干重最小，為0.33 g·100-1mL-1。

2.2 原種生長情況

在所有供試培養(yǎng)基上，大球蓋菇菌絲均呈灰白色或純白色，但其他生長狀況不同。不同配方原種大球蓋菇生長情況統(tǒng)計見表3。

由表3可知，配方3、配方5、配方7原種滿瓶時間較短，均不超過20 d，其中配方3所需時間最短，為16 d；配方1、配方4、配方6、配方8、配方9原種滿瓶時間較長，配方1滿瓶時間最長為27 d。

表3 原種生長情況Tab.3 The growth situation of mother spawn

配方4、配方5、配方7、配方8、配方9原種長勢最好，菌絲極濃密；菌絲平均生長速度均大于3 mm·d-1，配方 8生長速度最快，為 3.93 mm·d-1。配方1、配方2、配方6、配方9所得原種生長速度較快，菌絲生長速度均大于2 mm·d-1。配方3原種長勢較好，菌絲濃密；而配方1、配方2、配方6培養(yǎng)基所得原種長勢最弱，菌絲稀疏；配方2生長速度最慢，為1.33 mm·d-1。

根據(jù)滿瓶時間，菌絲長勢和生長速度，最終篩選出了2種較優(yōu)培養(yǎng)基，即配方5、配方7，其滿瓶時間短，菌絲純白、濃密，生長速度較快。

3 討論與結論

從菌絲球直徑的角度分析，添加200 g稻殼浸出液的培養(yǎng)基（配方3）菌絲球密度比添加100 g稻殼浸出液培養(yǎng)基（配方1）菌絲球直徑更小，說明在一定濃度范圍內，稻殼浸出液濃度越大，菌絲球直徑越??；添加不同濃度梯度的玉米面或黃豆面等固體不溶物的培養(yǎng)基（配方4～配方9） 比未添加固體不溶物的培養(yǎng)基（配方1～配方3） 菌絲球直徑更小，說明添加固體不溶物有助于減小菌絲球直徑，原因是在菌絲搖床培養(yǎng)過程中，固體不溶物吸附菌絲片段，導致菌絲球直徑變小，菌球直徑大小差異較小，密度更大，更有利于生產(chǎn)。針對一般市面價格，玉米面比黃豆面成本更低，因此結合成本考量，配方5為優(yōu)選培養(yǎng)基配方。

從菌絲球濕重和干重的角度分析，添加200 g稻殼浸出液的培養(yǎng)基（配方3）菌絲球干濕重比添加100 g稻殼浸出液培養(yǎng)基（配方2）菌絲球干濕重更大，說明在一定濃度范圍內，稻殼浸出液濃度越大，菌絲球干濕和濕重越大；添加不同濃度梯度的玉米面或黃豆面等固體不溶物的培養(yǎng)基（配方4～配方9）比未添加固體不溶物的培養(yǎng)基（配方1～配方3）平均干濕重更大，說明添加固體不溶物有助于增大菌絲球生物量，更有利于生產(chǎn)。在添加200 g稻殼浸出液的基礎上，添加玉米面的培養(yǎng)基（配方5）比添加黃豆面的培養(yǎng)基（配方7、配方9）平均菌絲球干濕和濕重更大，說明玉米面更有利于增大菌絲球生物量；結合成本考量，配方5為優(yōu)選培養(yǎng)基配方。

從菌絲長勢的角度分析，添加200 g稻殼浸出液的培養(yǎng)基（配方3） 長勢優(yōu)于PDA液體培養(yǎng)基（配方1） 及添加100 g稻殼浸出液培養(yǎng)基（配方2），說明在一定濃度范圍內，稻殼浸出液濃度越大，菌絲長勢越好；添加不同濃度梯度的玉米面或黃豆面等固體不溶物的培養(yǎng)基（配方4～配方9） 比未添加固體不溶物的培養(yǎng)基（配方1～配方3）長勢明顯更好，說明添加固體不溶物有助于菌絲長勢，更有利于生產(chǎn)。

從滿瓶時間和菌絲生長速度的角度分析，添加200 g稻殼浸出液的培養(yǎng)基（配方3）滿瓶時間及生長速度均優(yōu)于PDA液體培養(yǎng)基（配方1） 及添加100 g稻殼浸出液培養(yǎng)基（配方2）。說明在一定濃度范圍內，稻殼浸出液濃度越大，菌絲生長速度越快，所需生長周期越短，大大縮短生長周期，有利于實際生產(chǎn)。在添加200 g稻殼浸出液的基礎上，添加黃豆面的培養(yǎng)基（配方7、配方9）比添加玉米面的培養(yǎng)基（配方5）平均滿瓶時間及菌絲球生長速度更優(yōu)。但試驗顯示，添加玉米面的培養(yǎng)基（配方5）生長速度更均勻，菌絲長勢更整齊，添加20 g玉米面的培養(yǎng)基（配方5）比添加10 g玉米面的培養(yǎng)基（配方4）滿瓶時間更優(yōu)，說明在一定濃度范圍內，玉米面濃度越大，越有利于促進菌絲生長。

樊玉萍等[20]在研究平菇液體菌種配方時，用玉米粉部分代替了麩皮，也得出了加入玉米粉會使菌絲球大小均勻、干重大的結論。查磊等[21]在進行雙孢菇液體培養(yǎng)基優(yōu)化時也發(fā)現(xiàn)，利用玉米粉和黃豆粉來替代麩皮作為氮源，得到的菌絲球外觀、形態(tài)更好。

本研究在前人的基礎上，優(yōu)化了玉米面和黃豆面的添加量，并進一步加入了稻殼浸出液，最終篩選出配方5：200 g稻殼浸出液、馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、酵母浸膏3 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂1 g、玉米面20 g，加水定容至1 L為最佳配方。