紅豆樹葉總黃酮提取工藝優(yōu)化及抗氧化性研究

全穎萱，黃冰冰，貝佳炎，鄭 威，李林海，倪 林，2*，徐會有**

（1.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建福州350002；2.自然生物資源保育利用福建省高校工程研究中心，福建福州350002）

紅豆樹（Ormosia hosieiHemsl.&E.H.Wilson）為豆科紅豆屬的植物，是我國二級保護(hù)植物，主要分布在福建、廣東、廣西等?。?］，是珍稀藥用觀賞樹種。其根、莖、葉和種子均可入藥［2-3］，可用于治療跌打損傷、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和血滯經(jīng)閉等［4］，福建部分畬族聚居區(qū)常用紅豆樹枝葉煎湯代水飲防治心血管疾?。?］。1975 年，福建省把紅豆樹作為福建省主要珍貴鄉(xiāng)土樹種進(jìn)行造林推廣，截止目前為止，紅豆樹在全省50 余個(gè)縣（市、區(qū)）、30 余個(gè)國有林場（采育場）、10 余個(gè)國有林業(yè)苗圃均有大面積種植［2］，資源比較豐富。

本課題組一直致力于紅豆樹植物資源藥用價(jià)值的開發(fā)與利用研究，前期從紅豆樹的根、莖、葉、種子中分離鑒定包括生物堿、黃酮、三萜、木脂素等多種成分［5-9］，并證實(shí)紅豆樹葉富含黃酮類成分且具有較好的抗氧化活性。

因此，在前期研究的基礎(chǔ)上，為更好地利用紅豆樹葉資源，本研究通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取紅豆樹葉總黃酮，并對提取物的抗氧化活性進(jìn)行研究，為紅豆樹葉的深入研究和開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

紅豆樹葉（標(biāo)本號20191003）于2020 年10 月采自在福建省福州市閩清縣美菰國有林場（118.5°E，26.2°N；海拔735 m）中隨機(jī)選取的多棵20 年生紅豆樹，經(jīng)福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院鄒雙全教授鑒定為豆科紅豆屬植物紅豆樹（Ormosia hosieiHemsl. & E. H.Wilson）的葉子，并將紅豆樹葉標(biāo)本保存于福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院制藥工程系。標(biāo)本采集后在陰涼處干燥，粉碎過20目篩備用。

1.2 試劑與儀器

槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品（批號：B1920061，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；紫外可見分光光度儀（島津儀器有限公司）；CPA225D 型電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；分析純乙醇等（國藥化工有限公司；TQ-400Y 高速多功能粉碎機(jī)（永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司）。

1.3 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照文獻(xiàn)［10］的研究方法繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線，配制不同濃度的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)液，以65%乙醇為原料進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的空白對照，在波長為510 nm 處測得其吸光度A值。以不同的標(biāo)準(zhǔn)液濃度作為曲線的橫坐標(biāo)（X），根據(jù)其所得出的吸光度A作為曲線的縱坐標(biāo)（Y），繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為：Y=13.655 4X－0.359 2 ，R2=0.999 9。

1.4 提取工藝

1.4.1 提取工藝的基本方法

精密稱取0.2 g 的紅豆樹葉粉末，按照所設(shè)定的液料比、乙醇濃度和超聲時(shí)間等3 個(gè)因素［11］進(jìn)行超聲輔助提取，取該溶液的上層清液定容，用同一濃度定容至10 mL，搖勻靜置。取樣后加入顯色劑，通過紫外可見分光光度儀平行測定3組數(shù)據(jù)。總黃酮提取率的計(jì)算公式為：

式中：E為總黃酮提取率（%）；c為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求出的黃酮質(zhì)量濃度（mL/g）；n為提取液的稀釋倍數(shù)；v為離心液定容的體積（mL）；m為樣品質(zhì)量（g）。

1.4.2 液料比的影響

稱取0.2 g 紅豆樹葉粉末，固定乙醇濃度為50%，超聲時(shí)間為40 min，按照1.4.1的方法測定總黃酮的提取率，分別采用液料比5∶1、10∶1、20∶1、30∶1及40∶1（mL/g）進(jìn)行超聲輔助提取。

1.4.3 乙醇濃度的影響

稱取0.2 g 紅豆樹葉粉末，固定液料比為20∶1（mL/g），超聲時(shí)間為40min，按照1.4.1的方法測定總黃酮的提取率，分別采用乙醇濃度50%、60%、70%、80%及90%進(jìn)行超聲輔助提取。

1.4.4 超聲時(shí)間的影響

稱取0.2 g 紅豆樹葉粉末，固定液料比為20∶1（mL/g），乙醇濃度為50%，按照1.4.1 的方法測定總黃酮的提取率，分別采取超聲時(shí)間20、40、60、80、90、120 min進(jìn)行超聲輔助提取。

1.5 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝

設(shè)定3個(gè)單因素試驗(yàn)，自變量分別為超聲時(shí)間、乙醇濃度和液料比。根據(jù)試驗(yàn)研究結(jié)果得到最佳提取工藝條件為液料比20∶1（mL/g），超聲時(shí)間為90 min，乙醇濃度 70%。依據(jù) Box-Benhnken［12］原理設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素與水平，采用Design Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行分析［13］，選擇乙醇濃度、液料比和超聲時(shí)間3個(gè)影響因素進(jìn)一步考察，通過響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化超聲輔助提取紅豆樹葉總黃酮的工藝。

1.6 體外抗氧化試驗(yàn)

1.6.1 DPPH自由基清除作用

對于總黃酮對DPPH 自由基的清除效果，采用不同濃度梯度的樣品溶液進(jìn)行驗(yàn)證。各取1 mL 樣品溶液和2 mL DPPH 溶液，兩種溶液搖勻混合后，靜置30 min；用無水乙醇進(jìn)行吸光度調(diào)零，設(shè)定波長為517 nm，在此條件下所測量到的吸光度值為A1。再依次取1 mL 的無水乙醇和2 mL DPPH 溶液進(jìn)行搖勻混合后，同樣靜置30 min；用無水乙醇進(jìn)行吸光度調(diào)零，同樣設(shè)定波長為517 nm，在此條件下所測量到的吸光度值為A2。各取1 mL 的樣品溶液和2 mL 的蒸餾水醇混合均勻后，同樣靜置30 min；用無水乙醇進(jìn)行吸光度調(diào)零，同樣設(shè)定波長為517 nm，在此條件下所測量到的吸光度值為A3；同時(shí)將維生素C（VC）作為抗氧化活性測定的陽性對照組。根據(jù)下列DPPH 清除率公式可以計(jì)算出總黃酮的清除效果［14-15］。

式中：A1為樣品溶液和DPPH 溶液；A2為無水乙醇和樣品溶液；A3為蒸餾水和DPPH溶液

1.6.2 ABTS自由基的清除作用

各取 5 mL ABTS 溶液（7 mmol/L）和 5 mL 過硫酸鉀溶液，按照1：1體積比充分混合均勻，黑暗靜置12 ~16 h 后留做 ABTS 工作液［16］。先取混合液，在734 nm 處測吸光度A，再加蒸餾水稀釋至在734 nm處A=0.7±0.002，即配制成ABTS工作液，應(yīng)注意該溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用。取2 mL 樣品溶液，隨后加入4 mL ABTS 工作液，使得總體積為6 mL?；靹蚝笤?7℃的溫度下反應(yīng)6 min，以無水乙醇進(jìn)行吸光度調(diào)零，設(shè)定波長為734 nm，在此條件下所測得吸光度值為A1。2 mL 的樣品溶液和4 mL 無水乙醇，混勻后在37℃的溫度下反應(yīng)6 min，以無水乙醇進(jìn)行吸光度調(diào)零，同樣波長設(shè)定為734 nm，在此條件下測得吸光度值為A2。再取2 mL 蒸餾水，加入ABTS 自由基工作液4 mL，混勻后在37℃的溫度下反應(yīng)6 min，以無水乙醇進(jìn)行吸光度調(diào)零，同樣設(shè)定波長為734 nm，在此條件下所測得吸光度值為A3。

式中：A1為樣品溶液和ABTS 自由基工作液；A2為無水乙醇和樣品溶液；A3為蒸餾水和ABTS 自由基工作液

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 液料比的影響

其他條件固定為：超聲時(shí)間40 min、乙醇濃度50%。分別采用液料比5∶1、10∶1、20∶1、30∶1 及40∶1（mL/g）進(jìn)行超聲輔助提取，測定總黃酮的提取率。由圖1（a）可知，剛開始總黃酮提取率隨著液料比的增大而有所增加，但幅度相對較?。灰毫媳葹?0∶1（mL/g）時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到最大值為15.93%；液料比繼續(xù)增大，總黃酮提取率則顯著降低。推測由于乙醇溶液用量逐步增加，使得物料和溶劑的接觸面積增大，黃酮類物質(zhì)的溶出量變大，總黃酮提取率提高；但當(dāng)乙醇溶液用量不斷增加，物料將被溶劑充分包裹，再繼續(xù)增大乙醇溶液用量達(dá)到一定限額時(shí)，可能會造成其他雜質(zhì)溶出，最終導(dǎo)致總黃酮提取率下降［17］。同時(shí)溶劑用量越大提取成本也越高。綜合提取效果與提取成本，故確定最佳液料比為 20∶1（mL/g）。

2.1.2 乙醇濃度的影響

其他條件固定為：超聲時(shí)間40 min、液料比20∶1（mL/g）。分別采用乙醇濃度50%、60%、70%、80%及90%進(jìn)行超聲輔助提取，測定總黃酮的提取率。如圖1（b）所示，乙醇濃度為70%時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到峰值為19.49%。濃度小于70%時(shí)，增大乙醇濃度，總黃酮提取率隨之升高；濃度大于70%時(shí)，增大乙醇濃度，總黃酮提取率逐漸降低。推測由于乙醇濃度的增大，使得溶劑的滲透能力增強(qiáng)，黃酮類物質(zhì)的溶出量變大，總黃酮提取率提高；但提取液中脂溶性雜質(zhì)的含量也隨著乙醇濃度的不斷增大而增加，最終致使總黃酮提取率下降［18］，故確定乙醇最佳濃度為70%。

2.1.3 超聲時(shí)間的影響

其他條件固定為：液料比20∶1（mL/g）、乙醇濃度 50%。分別采用超聲時(shí)間 20、40、60、80、90 及120 min 進(jìn)行超聲輔助提取，測定總黃酮的提取率。由圖1（c）結(jié)果可知，增大超聲時(shí)間，總黃酮提取率先降低隨后逐漸增大，當(dāng)超聲時(shí)間為90 min 時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到最大值為22.62%，之后又降低。推測由于黃酮類物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)因超聲時(shí)間過長而被破壞，使得總黃酮提取率下降［19］，故確定最佳超聲時(shí)間為90 min。

圖1 不同條件對紅豆樹總黃酮提取率的影響Fig.1 Effects of different conditions on extraction of total flavonoids from the leaves of Ormosia hosiei

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面分析

根據(jù)Box-Benhnken 中心組合設(shè)計(jì)的基本原理［20-21］，以 2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果為根據(jù)，選擇 3 個(gè)影響因素設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果如表1 所示，并利用Design Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合結(jié)果分析，建立總黃酮提取率對液料比（A）、乙醇濃度（B）和超聲時(shí)間（C）的二次多元回歸模型：

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 1 The program and experimental results of response sur?facemethodology

對上述模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2。由表2 可知，模型F回歸值=61.57 ，P＜1.00×10-4，說明該回歸模型極顯著，即各因素液料比、乙醇濃度和超聲時(shí)間之間的線性關(guān)系極顯著，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪强尚械?，具有顯著性。其中，一次項(xiàng)A極顯著（P= 3.00×10-4<0.01），B極顯著（P= 1.9×10-3<0.01），C顯著（P=4.59×10-2<0.05），說明影響總黃酮提取率的因素依次為液料比、乙醇濃度、超聲時(shí)間；二次項(xiàng)A2極顯著（P<1.00×10-4即<0.01），B2極顯著（P=1.00×10-4<0.01），C2極顯著（P<1.00×10-4即<0.01）；交互項(xiàng)AB交互作用不顯著（P=3.57×10-1>0.05），AC交互作用顯著（P=4.15×10-2<0.05），BC交互作用極顯著（P= 1.3×10-3<0.01）?？偠灾?，3 個(gè)影響因子對總黃酮提取率的影響較為復(fù)雜，不是簡單的線性關(guān)系，曲面效應(yīng)顯著［22］。模型失擬項(xiàng)顯著（F失擬值=11.63 ，P=1.91×10-2＜0.05），需要進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)。

表2 回歸方程方差分析表Table 2 Variance analysis of mathematical regression model

2.2.2 兩因素間的交互影響

液料比與乙醇濃度、液料比與超聲時(shí)間、乙醇濃度與超聲時(shí)間之間交互作用的三維空間響應(yīng)面圖和二維等高線圖如圖2 所示。曲線趨勢表明對總黃酮提取率的影響，即曲線趨勢越平滑，表示對總黃酮提取率的影響越??；曲線趨勢越陡，表示對總黃酮的提取率影響越大［23］。由圖2可知，乙醇濃度與液料比的曲線趨勢較平緩，且等高線圖呈類圓形結(jié)構(gòu)，表明乙醇濃度與液料比的交互作用不顯著，對總黃酮提取率的影響較小；液料比與超聲時(shí)間和乙醇濃度與超聲時(shí)間的曲線趨勢較陡，且等高線圖呈較明顯橢圓形，表明其交互作用顯著，對總黃酮提取率的影響較大。

圖2 兩因素交互作用對紅豆樹葉總黃酮提取率的影響Fig.2 Effects of interaction between two factors on extraction of totalflavonoids from the leaves of Ormosia hosiei

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)試驗(yàn)條件，經(jīng)軟件分析得最優(yōu)工藝條件為：液料比20.15∶1（mL/g），乙醇濃度69.45%，超聲時(shí)間90.17 min。在該條件下，總黃酮提取率可達(dá)23.85%。結(jié)合實(shí)際應(yīng)用，各工藝條件可調(diào)整為液料比20∶1（mL/g），乙醇濃度70%，超聲時(shí)間90 min，此時(shí)總黃酮提取率為23.87%，兩者的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.06%，與理論值接近，表明采用響應(yīng)面法所建立的回歸模型與真實(shí)試驗(yàn)結(jié)果的擬合程度較高，優(yōu)化的工藝條件準(zhǔn)確可靠。

2.3 抗氧化活性試驗(yàn)

2.3.1 清除DPPH自由基活性

圖3（a）反映的是DPPH 自由基在不同濃度的紅豆樹葉總黃酮提取液及陽性對照組VC中的清除率。由圖3（a）可知，紅豆樹葉總黃酮提取液和VC均有清除DPPH 自由基的效果。在其他條件均相同的情況下，隨著紅豆樹葉總黃酮提取液濃度的不斷增大，DPPH 自由基清除率也逐漸增大，兩者之間呈現(xiàn)線性關(guān)系且為正相關(guān)。當(dāng)紅豆樹葉總黃酮提取液濃度為1.5 mg/mL 時(shí)，DPPH 自由基清除率達(dá)到最大值為87.70%。從整體上看，紅豆樹葉總黃酮對DPPH自由基的清除能力要小于VC。

2.3.2 清除ABTS自由基活性

圖3（b）反映的是ABTS 自由基在不同濃度的紅豆樹葉總黃酮提取液及陽性對照組VC中的清除率。由圖3（b）可知，紅豆樹葉總黃酮提取液及VC均有清除ABTS 自由基的效果。紅豆樹葉總黃酮提取液濃度在達(dá)到0.075 mg/mL 前，隨著提取液濃度的增大，ABTS 自由基清除率的增加幅度由大變??；總黃酮提取液濃度達(dá)到0.075 mg/mL 后清除率增幅又增大；在濃度為0.125 mg/mL 時(shí)，ABTS 自由基清除率達(dá)到最大值為99.26%。從總體上看，在其他條件均相同的情況下，隨著紅豆樹葉總黃酮提取液濃度的增大，ABTS 自由基清除率也逐漸增大，兩者之間呈現(xiàn)線性關(guān)系且為正相關(guān)；而陽性對照組VC溶液在相同濃度范圍內(nèi)，ABTS 自由基清除率接近100%，表明 VC對 ABTS 自由基的清除效果更好［24］。

圖3 紅豆樹葉總黃酮對不同自由基清除率的影響Fig.3 Effects on Different free radical scavenging rates of totalflavonoids from the leaves of Ormosia hosiei

3 結(jié)論

首次采用超聲輔助法，以單因素試驗(yàn)為依據(jù)，進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析，克服了各因素之間的交互作用，彌補(bǔ)了交互效應(yīng)和其他混合效應(yīng)的缺陷。該工藝中的總黃酮提取率可達(dá)23.85%，且優(yōu)化后的提取工藝穩(wěn)定可行，為紅豆樹資源利用及開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

首次發(fā)現(xiàn)紅豆樹葉總黃酮對DPPH 自由基和ABTS自由基有較好的清除能力，清除率最高分別可達(dá)87.70%及99.26%，其抗氧化能力與陽性對照Vc相當(dāng)，這為紅豆樹葉的資源利用和開發(fā)提供新思路。