二次玻璃化凍融囊胚對(duì)臨床結(jié)局和新生兒結(jié)局的影響

韓瀟，畢鋇鋇，黃鮮菊，胡琳莉

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，鄭州 450052)

數(shù)十年來(lái)，盡管有數(shù)百萬(wàn)夫妻從體外受精(IVF)中受益，但輔助生殖技術(shù)(ART)對(duì)不孕女性的安全性一直備受關(guān)注[1]。隨著ART領(lǐng)域的重大進(jìn)步，每個(gè)周期可轉(zhuǎn)移的可用胚胎數(shù)量也在增加，導(dǎo)致大量多余的胚胎冷凍保存[2]，以備將來(lái)進(jìn)行凍融胚胎移植(freeze-thaw embryo transfer，F(xiàn)ET)。既往的研究表明，F(xiàn)ET可降低中重度卵巢過(guò)度刺激綜合征(OHSS)的風(fēng)險(xiǎn)[3]，也可減少控制性卵巢過(guò)度刺激(COH)引起的其他副作用[4]，同時(shí)也可改善子宮內(nèi)膜的容受性[5]。通常，我們中心的冷凍周期中，一個(gè)冷凍管中保存的胚胎數(shù)量不超過(guò)兩個(gè)。多胎妊娠是輔助生殖技術(shù)的一個(gè)嚴(yán)重并發(fā)癥，可引起妊娠期高血壓、貧血、胎膜早破、早產(chǎn)及產(chǎn)后出血等。而隨著我國(guó)計(jì)劃生育政策的變化，傾向于單胚胎移植的夫婦數(shù)量在增加，因此，需要再次冷凍保存于同一冷凍管內(nèi)的胚胎。如果患者的身體狀況在胚胎解凍后的移植日不適合進(jìn)行移植，也需要將胚胎再次冷凍。此外，在胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)(preimplantation genetic testing，PGT)周期中再次活檢也可能導(dǎo)致胚胎再次冷凍保存。基于胚胎二次冷凍的發(fā)生率在逐漸增加，我們有必要評(píng)估反復(fù)凍融對(duì)妊娠結(jié)局及新生兒結(jié)局的影響。

目前，關(guān)于胚胎二次凍融對(duì)妊娠結(jié)局及新生兒結(jié)局的影響研究較少。以往的研究表明，二次凍融胚胎的發(fā)育潛能及其對(duì)孕產(chǎn)結(jié)局的影響仍存在爭(zhēng)議[5]。本研究旨在分析二次玻璃化凍融胚胎對(duì)凍融單囊胚移植妊娠和新生兒結(jié)局的影響，以便為臨床醫(yī)生和患者選擇二次玻璃化凍融胚胎提供參考。

資料和方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2017年1月至2020年4月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行FET的患者病例資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≤40歲；(2)BMI≤30 kg/m2；(3)行單囊胚移植；(4)輸卵管或男方因素不孕癥女性；(5)抗苗勒管激素(AMH)>1.1 ng/ml。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)女方供卵、胚胎植入前遺傳學(xué)診斷(preimplantation genetic diagnosis，PGD)、染色體異常、單基因?。?2)子宮畸形(單角子宮、縱膈子宮、殘角子宮、鞍狀子宮等)及子宮器質(zhì)性疾病如宮腔粘連、子宮內(nèi)膜增生、子宮內(nèi)膜息肉、≥4 cm的子宮肌瘤、Ⅲ期或IV期子宮內(nèi)膜異位癥；(3)卵巢相關(guān)異常如多囊卵巢綜合征、卵巢功能不全、卵巢早衰等；(4)任何可能與不良妊娠結(jié)局相關(guān)的嚴(yán)重合并癥，如糖尿病、先天性心臟病、垂體瘤、甲狀腺疾病等。行二次凍融及單次凍融囊胚移植的患者均簽訂了知情同意書(shū)。

二、研究方法

1.分組：共納入1 201例行單囊胚凍融周期移植的患者，根據(jù)胚胎經(jīng)歷的冷凍次數(shù)，分為雙凍組(49例)和單凍組(1 152例)。每個(gè)患者均只有一個(gè)周期被納入研究。通過(guò)傾向性評(píng)分匹配對(duì)兩組患者進(jìn)行1∶3匹配，匹配變量包括年齡、基礎(chǔ)FSH、不孕類型、治療方案。匹配后產(chǎn)生雙凍組(n=49)和單凍組(n=147)。

2.囊胚培養(yǎng)及評(píng)分：取卵16～18 h后根據(jù)兩個(gè)原核的形成來(lái)確定受精方式(IVF/ICSI)。第3天將胚胎轉(zhuǎn)至囊胚培養(yǎng)液G2(Vitrolife)中進(jìn)行囊胚培養(yǎng)。第5天，至少有兩名胚胎學(xué)工作人員根據(jù)Gardner評(píng)分系統(tǒng)[6]對(duì)囊胚進(jìn)行評(píng)分，在本中心，細(xì)胞數(shù)為6～10、囊胚評(píng)分≥3BB的視為優(yōu)質(zhì)囊胚。

3.囊胚的凍融：囊胚的冷凍及解凍分別采用玻璃化快速冷凍、解凍方法。在玻璃化冷凍前，用激光脈沖(OCTAX laser shot，MTG)人工收縮囊胚腔。根據(jù)Vit試劑盒(Kitazato公司，日本)的說(shuō)明，按照傳統(tǒng)方法[7]進(jìn)行玻璃化冷凍和加溫。復(fù)蘇后的囊胚在囊胚培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h，如果一半以上的細(xì)胞完整，囊胚腔再次擴(kuò)張，則視為囊胚存活。

4.內(nèi)膜準(zhǔn)備及囊胚移植：(1)自然周期：對(duì)于月經(jīng)周期和排卵規(guī)律的患者采用自然周期方案。在月經(jīng)周期的第8～11天，使用經(jīng)陰道超聲監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育及子宮內(nèi)膜情況。當(dāng)優(yōu)勢(shì)卵泡直徑>14 mm時(shí)，測(cè)定尿LH水平，當(dāng)出現(xiàn)尿LH峰值時(shí)，測(cè)定血清E2、LH和孕酮(P)水平，以確定排卵時(shí)間。若優(yōu)勢(shì)卵泡直徑在18～20 mm之間，但未出現(xiàn)LH激增，則于當(dāng)日上午給予人絨毛膜促性腺激素(HCG，珠海麗珠)10 000 U肌肉注射誘導(dǎo)排卵。排卵后，口服達(dá)芙通(蘇威制藥，荷蘭)，10 mg/次，每天2次及肌肉注射黃體酮(浙江仙琚)40 mg，于第6天在B超引導(dǎo)下進(jìn)行單個(gè)優(yōu)質(zhì)囊胚移植，移植后繼續(xù)按原劑量進(jìn)行黃體支持。(2)人工周期：在月經(jīng)期或黃體酮撤退性出血的第2～3天開(kāi)始給予補(bǔ)佳樂(lè)(拜耳，德國(guó))2～4 mg/d，通過(guò)超聲監(jiān)測(cè)子宮內(nèi)膜厚度，根據(jù)血清雌激素水平和子宮內(nèi)膜情況調(diào)整補(bǔ)佳樂(lè)的用量，當(dāng)子宮內(nèi)膜厚度≥8 mm時(shí)，促排卵用藥同自然周期，于第6天在B超引導(dǎo)下進(jìn)行單個(gè)優(yōu)質(zhì)囊胚移植，移植后繼續(xù)按原劑量進(jìn)行黃體支持。

5.妊娠判斷：移植術(shù)后4～6周，行陰道超聲檢測(cè)見(jiàn)孕囊及胎心搏動(dòng)，為臨床妊娠；若β-HCG陽(yáng)性(血清β-HCG>5 U/L)而子宮內(nèi)未見(jiàn)孕囊，但宮腔外可見(jiàn)孕囊者為異位妊娠。

6.分析指標(biāo)：著床率=孕囊數(shù)/胚胎種植數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；異位妊娠率=異位妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；活產(chǎn)率=活產(chǎn)周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；多胎妊娠率=多胎妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%。小于37周分娩為早產(chǎn)，出生體重低于2 500 g為低出生體重兒。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、雙凍胚胎基本情況

雙凍組共解凍50枚囊胚，其中1枚未存活，故其解凍存活率為98.0%。在雙凍組的49個(gè)移植周期中，其中43個(gè)周期為之前的移植周期中同時(shí)解凍了同一凍存管內(nèi)共同保存的兩枚胚胎，因患者為瘢痕子宮選擇單囊胚移植，二次冷凍剩余囊胚，本次為二次凍融單囊胚移植；5個(gè)周期為之前的移植周期中同時(shí)解凍了同一凍存管內(nèi)共同保存的兩枚胚胎，因患者宮頸機(jī)能不全選擇單囊胚移植，二次冷凍剩余囊胚，本次為二次凍融單囊胚移植；1個(gè)周期為之前的移植周期中因患者個(gè)人原因，術(shù)前臨時(shí)要求取消移植，二次冷凍囊胚，本周期為二次凍融單囊胚移植。

二、兩組患者的基本資料

兩組患者的年齡、不孕年限、BMI、基礎(chǔ)FSH水平、AMH水平、不孕類型、內(nèi)膜準(zhǔn)備方案、移植日子宮內(nèi)膜厚度均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者一般資料及內(nèi)膜情況比較

三、兩組患者的妊娠結(jié)局

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，雙凍組與單凍組之間的著床率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率、異位妊娠率以及活產(chǎn)率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

表2 兩組患者臨床妊娠結(jié)局比較[%]

四、兩組患者的新生兒結(jié)局

本研究入組患者共有82例活產(chǎn)單胎，其中64例來(lái)自單凍組、18例來(lái)自雙凍組。對(duì)比兩組活產(chǎn)單胎的新生兒結(jié)局，新生兒的男女比例、早產(chǎn)率、出生體重、低出生體重率、新生兒疾病發(fā)生率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與單凍組相比，雙凍組的孕周顯著減少(P<0.05)，剖宮產(chǎn)率顯著升高(P<0.05)(表3)。另外，單凍組內(nèi)有一例新生兒疝氣患者，兩組均無(wú)死產(chǎn)或新生兒死亡的報(bào)道。

表3 兩組患者活產(chǎn)單胎的新生兒結(jié)局

討 論

由于ART的巨大進(jìn)步，胚胎冷凍保存已成為IVF臨床治療中廣泛使用的有效方法，成功的胚胎冷凍保存方法將增加單個(gè)卵巢刺激周期中的累積妊娠率。為了減少多胎妊娠的發(fā)生率，臨床醫(yī)生及患者對(duì)單囊胚移植的選擇增加。在本研究中，我們?cè)u(píng)估了二次玻璃化凍融胚胎對(duì)凍融單囊胚移植妊娠和新生兒結(jié)局的影響，結(jié)果顯示：二次玻璃化冷凍組(雙凍組)與單次玻璃化冷凍組(單凍組)之間的著床率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率、異位妊娠率、多胎妊娠無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，兩組間新生兒的性別比例、早產(chǎn)率、新生兒出生體重、低出生體重率、新生兒疾病發(fā)生率也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；雙凍組的剖宮產(chǎn)率顯著高于單凍組，雙凍組的孕周顯著低于單凍組(P<0.05)。

胚胎的質(zhì)量被認(rèn)為是影響胚胎發(fā)育潛力的重要因素，并且在胚胎著床中起著至關(guān)重要的作用[8]。早期對(duì)于胚胎重復(fù)冷凍影響的評(píng)估主要集中于小鼠胚胎。Fathi等[9]發(fā)現(xiàn)，小鼠胚胎的重新玻璃化冷凍不影響胚胎的存活率和囊胚形成率，但會(huì)顯著減少內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)量和囊胚直徑。Vitale等[10]的結(jié)果顯示，小鼠胚胎經(jīng)歷三次凍融后的細(xì)胞數(shù)量顯著少于未經(jīng)冷凍的胚胎，但凍融胚胎仍能存活三個(gè)連續(xù)的凍融周期，并且可以在體外發(fā)育。Ling等[11]認(rèn)為，胚胎細(xì)胞數(shù)目的減少并不意味著隨后胚胎體外或體內(nèi)發(fā)育能力的下降。同樣地，Sheehan等[12]的研究也表明，再次玻璃化冷凍對(duì)小鼠胚胎著床前發(fā)育及著床潛能影響不大。

隨后的一些研究評(píng)估了人類胚胎經(jīng)歷二次冷凍后對(duì)于胚胎發(fā)育潛能及妊娠結(jié)局的影響。Murakami等[13]和Zheng等[14]比較了重新玻璃化冷凍胚胎移植與初次凍融胚胎移植的臨床結(jié)局，結(jié)果表明，兩次冷凍保存組的流產(chǎn)率顯著高于對(duì)照組。而Kumasako等[15]的研究指出，重復(fù)玻璃化冷凍組和對(duì)照組孕婦的著床率、臨床妊娠率及流產(chǎn)率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；Cobo等[16]的研究也發(fā)現(xiàn)，二次玻璃化冷凍胚胎移植周期的胚胎存活率、著床率和臨床妊娠率與新鮮周期相當(dāng)；Check等[17]的研究也表明，使用二次冷凍的胚胎不會(huì)降低植入率，我們的結(jié)果與其研究一致。我們發(fā)現(xiàn)，Murakami等[13]和Zheng等[14]的研究均使用了兩種冷凍保存方法，即緩慢冷凍然后玻璃化冷凍，而Kumasako等[15]和Cobo等[16]及我們的研究的兩次冷凍方法均為玻璃化冷凍。不同的冷凍保存方法可能是造成結(jié)果之間差異的原因。學(xué)者柏海燕等[18]發(fā)表的一篇關(guān)于中途胚胎植入前遺傳學(xué)診斷/篩查(Midway PGD/PGS)病例報(bào)道中報(bào)道了一名因行Midway PGD/PGS而接受二次凍融囊胚移植患者的妊娠結(jié)局，該患者獲臨床妊娠，孕39周剖宮產(chǎn)一男嬰，體重3 000 g，發(fā)育正常。2018年中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的關(guān)于冷凍胚胎保存時(shí)限的中國(guó)專家共識(shí)指出[19]，胚胎冷凍保存對(duì)FET妊娠率以及子代出生缺陷率沒(méi)有顯著影響。Nagy等[20]的研究表明，與慢速冷凍相比，玻璃化冷凍對(duì)胚胎的損傷更小，可以顯著地提高胚胎的存活率，從而提高累積妊娠率及輔助生殖的安全性，并且玻璃化冷凍技術(shù)的實(shí)施，也促進(jìn)了患者對(duì)選擇性單囊胚移植的接受。

有研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于不分質(zhì)量的雙囊胚移植，移植單個(gè)優(yōu)質(zhì)囊胚可顯著改善種植率，并極大地降低多胎率[21]。在患者條件及胚胎質(zhì)量適合的情況下，單囊胚移植是一個(gè)更優(yōu)選擇。評(píng)估胚胎經(jīng)歷二次冷凍后進(jìn)行單囊胚移植對(duì)臨床妊娠及孕產(chǎn)結(jié)局的影響，提供患者對(duì)先前儲(chǔ)存的胚胎進(jìn)行再冷凍保存的選擇可能會(huì)鼓勵(lì)更多患者對(duì)移植的胚胎數(shù)量采取更謹(jǐn)慎的態(tài)度。此外，并非所有的二次冷凍胚胎均會(huì)被移植，在我們中心，從2017年1月到2020年4月，根據(jù)上述納入和排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行選擇，共有189例患者進(jìn)行了二次胚胎冷凍，其中135例患者(71.43%)的胚胎仍在保存中，僅有54例患者(28.57%)進(jìn)行了二次冷凍胚胎移植。

胚胎二次凍融周期中新生兒的健康也是患者非常關(guān)心的問(wèn)題。本研究的49例雙凍組患者，其不孕類型均為繼發(fā)不孕，且有43例因瘢痕子宮行單囊胚移植而二次冷凍了囊胚。研究顯示，瘢痕子宮再妊娠選擇剖宮產(chǎn)分娩方式的比例高于自然分娩[22]，這也解釋了本研究中雙凍組的剖宮產(chǎn)率顯著高于單凍組這一結(jié)果。與自然分娩的分娩時(shí)機(jī)的不確定性相比，剖宮產(chǎn)可由于母嬰因素及母親的個(gè)人選擇而人為地確定分娩時(shí)機(jī)，本研究的結(jié)果顯示，雙凍組的孕周顯著小于單凍組的孕周，但雙凍組均為剖宮產(chǎn)，故此結(jié)果并不能說(shuō)明二次冷凍胚胎對(duì)孕周有不良影響。Murakami等[13]的研究分析了二次冷凍胚胎移植的圍產(chǎn)期結(jié)局，結(jié)果顯示，雙凍組的平均體重有下降趨勢(shì)，但其在分析中合并了單胎和雙胎。而本研究在分析圍產(chǎn)期結(jié)局時(shí)僅納入了活產(chǎn)單胎的數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，二次冷凍組與單次冷凍組相比，新生兒出生體重、性別比、先天性缺陷之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，與Zheng等[14]的研究結(jié)果一致。

本研究所納入的周期均為單囊胚移植周期，并且對(duì)年齡、基礎(chǔ)FSH、不孕類型、內(nèi)膜準(zhǔn)備方案進(jìn)行匹配，兩組患者匹配后的一般資料均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這更有利于明確胚胎冷凍次數(shù)對(duì)于妊娠結(jié)局的影響。然而，當(dāng)前的研究也有一些局限性：這是在單個(gè)中心進(jìn)行的回顧性隊(duì)列研究，并且樣本量有限。但該研究仍在一定程度上顯示了二次冷凍保存胚胎的妊娠結(jié)局及新生兒結(jié)局的安全性，為臨床決策和患者咨詢提供了有價(jià)值的信息。

重新冷凍多余的胚胎可以避免患者面臨卵巢過(guò)度刺激和反復(fù)失敗的風(fēng)險(xiǎn)。但是，迄今為止，胚胎二次凍融的安全性尚未完全確定。我們的結(jié)果顯示，胚胎二次玻璃化凍融在一定程度上會(huì)縮短孕周，但對(duì)著床率、臨床妊娠率、新生兒出生體重沒(méi)有明顯的不利影響，并且不增加流產(chǎn)、異位妊娠、多胎妊娠、早產(chǎn)、低出生體重兒、新生兒疾病等不良孕產(chǎn)結(jié)局的發(fā)生幾率，對(duì)于因瘢痕子宮及宮頸機(jī)能不全而進(jìn)行二次凍融囊胚移植的患者來(lái)講，是一種較為安全有效的選擇。在臨床中，要充分告知夫婦二次凍融胚胎的益處及風(fēng)險(xiǎn)，包括對(duì)未出生孩子健康的影響。未來(lái)研究需要納入更多的患者并進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪，來(lái)確認(rèn)二次玻璃化冷凍保存程序的安全性。