多酶催化體系在醫(yī)藥化學品合成中的應用

湯恒，韓鑫，鄒樹平，鄭裕國

（浙江工業(yè)大學生物工程學院手性生物制造國家地方聯(lián)合工程研究中心，浙江 杭州 310014）

1 多酶催化體系

多酶催化體系是指模擬體內代謝過程，在體外將幾種不同功能的酶級聯(lián)組裝成一個結構和功能整體，催化一系列連續(xù)的生化反應，將簡單底物轉化為復雜產物的生物催化反應體系。同時多酶催化體系是一種可調控的系統(tǒng)，通過級聯(lián)酶之間的緊密接觸，形成“底物通道”，避免了細胞代謝中分子無規(guī)律運動導致的中間產物擴散損失［1］。在體外可以快速實現(xiàn)胞內的各種代謝反應，克服了傳統(tǒng)發(fā)酵周期長、生產效率低、易受毒副產物抑制等缺點［2］。

天然的多酶催化體系在細胞內十分常見，如糖酵解途徑、三羧酸循環(huán)等［3-5］。在代謝過程中，經常通過形成多酶級聯(lián)的復合物，形成“底物通道效應”而實現(xiàn)特定代謝產物的高效合成?！暗孜锿ǖ佬笔嵌嗝讣壜?lián)反應的一種現(xiàn)象，即一個酶將催化完成的產物轉移到下一個鄰近酶的催化位點，作為另一個酶的催化底物的過程，這種現(xiàn)象只有兩個酶的距離足夠近時才會發(fā)生［6］。譬如，上游酶活性中心釋放的中間產物可被下游酶活性中心直接處理，從而避免中間產物的擴散，這種通過連接活性中心的蛋白質隧道被稱為“直接底物通道”［圖1（a）］；另一種可能的通道機制被稱為“鄰近底物通道”，是指兩種酶在沒有實際通道的情況下，但活性中心相距足夠近，使得上游酶產生的中間產物在擴散之前也可被下游酶捕獲并催化［圖1（b）］；此外，將上游和下游酶的多個拷貝混合組裝為功能簇，也可有效提高中間體產物被任意下游酶捕獲的概率［圖1（c）］。多酶復合物底物通道具有保護不穩(wěn)定的中間產物，調節(jié)同一底物的競爭途徑，消除有毒中間代謝物的抑制作用等功能［7］。由于細胞中代謝網絡復雜，許多代謝調控還不成熟，產物形成對細胞生長產生抑制作用，致使胞內目標產物積累受到極大限制［8］。因此，近年來體外多酶催化體系越來越受到學者們的關注［9-10］。

圖1 底物通道效應［7］Fig.1 Substrate channel in a two-step metabolic pathway［7］(Different types of intermediate channeling in a two-step metabolic pathway,where a substrate is processed by enzyme E1 and turned into intermediate,which is then processed by enzyme E2 and turned into product)

從單一酶催化反應到多酶催化體系，其發(fā)展過程不是一蹴而就的。多酶催化體系發(fā)展之初只是簡單模擬天然的代謝過程，而如今可通過改造天然代謝途徑甚至設計全新的人工途徑［11-12］來構建更高效率的多酶催化體系。不僅可利用不同宿主來源的天然酶，而且能通過酶的人工進化從而獲得催化特性和環(huán)境適應性大幅度提高的人工酶。隨著越來越多的體內多酶復合體結構和催化機制被揭示與深入研究，巨量生物學數據的不斷積累和計算機技術的飛速發(fā)展，越來越多的多酶催化體系正在被設計和組裝，并應用于化學品的合成中。本文主要對多酶催化體系的構建及在醫(yī)藥化學品合成中的應用方面進行綜述。

2 多酶催化體系的構建策略

多酶催化體系的設計通常需要對多個級聯(lián)的反應過程和合成路徑進行熱力學和動力學分析，以滿足多酶催化體系組裝的基本要求［13］：級聯(lián)的總體熱力學參數是正向可行的（?Gcascade<0），如最后一步催化為不可逆反應則可極大提高產品轉化率；酶的催化反應具有高反應特異性和官能團正交性，以避免不同底物之間不必要的交叉反應；整個動力學反應參數由酶活性控制，以保證反應通量。多酶催化體系設計的另一個重要任務是對目標產物進行逆向合成分析［14］，建立與產物合成有關的多酶工具箱，對級聯(lián)酶的選擇性、相容性及化合物耐受性進行篩選［15-16］。由于需要協(xié)調反應體系中多個酶的理化性質、動力學參數等，所以多酶的協(xié)同作用對于實現(xiàn)整個體系的催化效率和穩(wěn)定性具有影響［17］。此外，多酶催化體系還需要著重考慮體外輔酶的循環(huán)與ATP 的供給，如通過建立一個輔酶再生循環(huán)［18］或生物電池［19］等來解決輔酶循環(huán)問題。

在完成多酶催化途徑設計后，多酶的組合往往導致通量不平衡，其整體轉化效率受到特定酶的限制。瓶頸效應可能導致某種中間產物的積累，降低了整體轉化效率，還會對宿主細胞產生毒性作用。除了研究酶的內在性質以尋求更好的突變體外，設計合理的多酶組裝策略也被證明是提高整體途徑效率的有效途徑，即將多個酶催化反應按照一定層次與空間結構組裝起來，使催化連續(xù)反應的酶彼此相距更近。多酶催化體系組裝策略不僅限于酶融合技術［20］與共固定化技術［21］，還包括蛋白質和DNA 支架技術［22］（圖2），此外還有部分研究采用了RNA 支架和基于病毒結構蛋白的脂質支架［23-24］。各類支架技術已被廣泛應用，但仍需要更多的研究優(yōu)化其構型。

除了基于合成支架構建酶復合物的策略，酶的限域固定化策略是另一種將酶限制于亞細胞空間的方法［圖2（d）］，通過蛋白融合和超分子組裝區(qū)室［17，25-27］形成不同層次和空間結構。例如，模擬微區(qū)室（mimicking bacterial microcompartment，bmc）是一種與殼亞基組裝的大型蛋白質復合物［28］，羧酶體是典型的bmc，它通過對代謝途徑酶進行限域以提高易逃逸底物和有毒中間體的轉化率［29］，典型的例子包括二氧化碳固定和1，2-丙二醇降解催化體系［30-31］。部分其他類型的bmc可形成更小的多面體蛋白復合物以適應不同的多酶催化體系［28］。但對其組裝和功能化機制的有限了解，如結構蛋白過表達的細胞負擔、細胞內bmc 的物理空間擠占、中間體的選擇性滲透以及外源酶和殼蛋白之間的相互作用等問題，阻礙了bmc 在生物合成中的應用。然而，酶的限域固定化具有很大的潛力，因為它提供了一個大且相對穩(wěn)定的亞細胞空間，可容納高濃度的局部代謝物，同時最大限度地減少對宿主細胞的破壞。

圖2 多酶催化體系的組裝技術［32］Fig.2 Assembly technology of multi-enzyme catalytic system［32］

現(xiàn)階段組裝復雜的多酶催化過程仍是一項具有挑戰(zhàn)性的任務，目前化學品合成中應用較多的多酶催化體系大多采用多酶共反應或共固定化技術，如采用“一鍋法”反應，將分離純化的多酶經過載體結合或者直接于單個反應容器中與底物混合，優(yōu)化協(xié)調各酶的反應條件，最終獲得需要的高純度或單一立體選擇性的產品。相對于一般化學品，醫(yī)藥化學品對于立體選擇性和對映選擇性有著更高的要求，因此在多酶催化體系的構建和組裝策略上其精準度和嚴密性要求遠高于一般化學品［32］。同時鑒于醫(yī)藥化學品需進入人體或動物細胞內發(fā)揮作用，其在生產方面的安全性要求更高，多酶催化反應后的分離與提純的要求也更為復雜。

在一種人工多酶級聯(lián)反應中，酶可能不會共享相似的最佳溫度，最佳pH 和其他條件，在相似濃度的試劑下可能不會具有相似的反應速率。因此，需要對多酶催化反應進行測試，并進行適配性優(yōu)化［33］。如Wahl 等［34］在構建核苷酸糖多酶級聯(lián)反應體系時，通過建立核苷酸糖的高通量的多重毛細管電泳分析方法（MP-CE），實現(xiàn)了6 個不同酶模塊的產物的快速分析檢測，解決了常規(guī)分析方法耗時、效率低的難題，提高了各酶促反應適配性優(yōu)化效率。此外，可采用數學模型對每個反應的條件（例如介質、溫度、pH 和催化劑穩(wěn)定性）進行平衡與優(yōu)化，并結合快速檢測方法尋找最佳的控制條件［35］。

綜上，各種方法已被開發(fā)用于酶固定化，包括酶融合、支架基絡合和限域固定化，隨著對這些方法的進一步理解，在構建多酶催化體系時，要綜合考慮各酶促反應熱力學和動力學特性，合理設計層次結構與空間結構，以便突破反應限速步驟與合成產率瓶頸，使更復雜的組裝技術助力更多產物的生物合成。

3 多酶催化體系在醫(yī)藥化學品合成中的應用

3.1 多酶催化體系在抗生素類藥物合成中的應用

頭孢菌素類抗生素的品種數量是各類抗生素之首［36］，約占全球抗感染類藥物的50%市場份額［37］。脫?；?7-氨基頭孢烷酸（D-7-ACA）是一種重要的醫(yī)藥中間體，一般用于內酰胺類抗生素的合成［38-41］。如圖3所示，Wei等［42］采用“兩酶一鍋法”替代傳統(tǒng)的“三酶三鍋法”，通過耦合固定化頭孢菌素C ?；福–PCA）和固定化頭孢菌素C去乙?；福–AH）進行反應，最終獲得的D-7-ACA 產率為78.39%，比產率達到10.85 g/（g·h·L），比傳統(tǒng)方法的比產率提高了約4倍。

圖3 脫?；?7-氨基頭孢烷酸新舊合成路線比較［42］Fig.3 Comparison of two deacetyl-7-aminocephalosporanic acid synthetic routes［42］

D-2-氨基丁酸（D-2-aminobutyric acid）是一種非天然氨基酸，在藥物生產中起著重要的中間體的作用［43］，能夠合成抗生素［44-45］、基質金屬蛋白酶抑制劑［46-49］和抗增殖藥［50］等。目前對α-氨基酸外消旋體進行拆分是獲得光學純D-氨基酸的主要方法，由于原子經濟性低和排放量大等問題，工業(yè)上迫切需要開發(fā)出一種原料較為便宜且副產物少的生產方法。Chen等［50］在體外構建了一種新的多酶催化體系（圖4），由L-蘇氨酸脫氨酶、D-氨基酸脫氫酶和甲酸酯脫氫酶組成，以容易獲得的L-蘇氨酸為底物，通過兩步酶促反應，首先由L-蘇氨酸脫氨酶催化生成2-氧代丁酸，然后結合輔因子被D-氨基酸脫氫酶還原胺化獲得D-2-氨基丁酸，過程中無需額外添加氨，副產物只有水和二氧化碳，同時D-2-氨基丁酸的產率高于90%且純度大于99%。該系統(tǒng)能通過易獲得的L-α-氨基酸合成D-α-氨基酸，該方法原子經濟性高，具有良好的發(fā)展前景。

圖4 多酶催化合成D-2-氨基丁酸［50］Fig.4 Synthesis of D-2-aminobutyric acid catalyzed by multi-enzyme［50］［L-threonine deaminase catalyzes production of 2-oxobutyric acid,which is combined with cofactors to be reductively amination by D-amino acid dehydrogenase to obtain D-2-aminobutyric acid,and at same time combined with formate dehydrogenase(FDH)to achieve NADPH of recycling]

聚酮化合物是臨床上重要的天然產物［51］，由于其復雜的化學結構，常常需要步驟煩瑣的有機合成［52］。腸球菌素（enterococcin）作為一種關鍵的聚酮化合物，是由人或動物腸道中的腸球菌在代謝過程中合成并分泌的一類具有抑菌作用的細菌素［53］。Moore 課題組［54］首次在體外構建了Ⅱ型聚酮類化合物的酶促合成途徑，該體系利用單個反應容器及苯甲酸及丙二酰CoA 作為反應底物，設計了由酮合成酶鏈延長因子的異源二聚體（EncA-EncB），?；d體蛋白（ACP）和ACP 轉?；附M成的聚酮化合物合酶，并耦聯(lián)聚酮化合物生物合成必需的ACP 連接酶（EncN）和酮還原酶（EncD）、黃素蛋白（EncM）和甲基轉移酶（EncK），通過外源補加ATP 及NADPH 及相應輔因子（SAM），最終抗生素腸球菌素的總收率達到了25%（圖5）。

圖5 腸球菌素的體外多酶催化合成途徑［54］Fig.5 Multienzyme catalyzed synthesis pathway of enterococcin in vitro［54］

3.2 多酶催化體系在抗癌藥物合成中的應用

L-酪氨酸（L-tyrosine）衍生物是一些生化標記物和抗癌藥物的重要前體，同時還是合成生物學中重要的非標準氨基酸［55-63］，特別是3-甲氧基-L-酪氨酸，不僅是左旋多巴的前體［64］，還是人類L-氨基酸脫羧酶缺乏癥的重要生化指標［57，65］。如果通過化學法從頭合成酪氨酸衍生物，不僅需要多個步驟，而且還會產生外消旋物質，需要進行后續(xù)的分離。為了更高效地合成L-酪氨酸衍生物，Dennig 等［66］設計了一種通過一鍋兩步法進行合成的多酶級聯(lián)反應（圖6），利用了單加氧酶和C—C裂解酶的聯(lián)合活性，以有取代基的苯、丙酮酸和氨氣為起始底物，在級聯(lián)過程中成功去除了抑制性酚類反應中間體，可以獲得純度大于97%的L-酪氨酸衍生物。以含甲苯的粗芳香族汽油共混物為底物，可制得3-甲基-L-酪氨酸2 g/L，產率為97%。時空產率達到0.19 g/（L·h）。

圖6 一鍋法多酶級聯(lián)催化合成L-酪氨酸衍生物［66］Fig.6 Synthesis of L-tyrosine derivatives by one-pot multi-enzyme cascade catalysis［66］[Regioselective and chemoselective hydroxylation of aromatics(1a-f)is catalyzed by highly selective P450 BM3 mutant to generate o-phenol intermediates(3a-f)and p-phenol intermediates(2a-f).In second step,under condition of consuming NH3,tyrosine phenol lyase(TPL)catalyzes C-C coupling of 3a-f to generate pyruvate to obtain L-4a-f]

2'-脫氧鳥苷酸（deoxyguanosine-2'-monophosphate，dGMP）是合成寡脫氧核苷酸等抗病毒、抗腫瘤核酸藥物的重要原料，可直接用于制備組合脫氧核苷藥物或者作為化學試劑用于生化研究［67-68］。同時又可作為中間體用于合成一些抗病毒核苷類藥物以及分子標記物［69］。傳統(tǒng)上，dGMP 是從DNA 降解產物分離出來的，這表示其是低產且耗時的。Li 等［70］研究了一種新型的一鍋多酶級聯(lián)反應以生產dGMP（圖7）。該反應涉及來自大腸桿菌的嘌呤核苷磷酸化酶（PNPase）和乙酸激酶（ACKase），來自德氏乳桿菌的N-脫氧核糖轉移酶Ⅱ（NDT-Ⅱ）和來自枯草芽孢桿菌的脫氧鳥苷激酶（dGKase）。最初的鳥苷底物首先被PNPase裂解為鳥嘌呤和1-磷酸核糖。隨后NDT-Ⅱ催化鳥嘌呤和胸苷反應生成脫氧鳥苷（dGR）。最后，通過dGKase 和ACKase 利用乙酰磷酸的胞苷三磷酸（CTP）再生系統(tǒng)將中間體dGR 磷酸化為dGMP。在反應過程中，最初的鳥苷底物被PNPase切割成鳥嘌呤和核糖-1-磷酸。然后，dGR 隨后由鳥嘌呤和胸苷之間的反應產生，NDT-Ⅱ催化反應進行。最后，中間體脫氧核糖核酸通過脫氧葡萄糖苷酶和CTP磷酸化生成dGMP。在反應過程中，添加了非常少量的CTP，因為CTP 再生可有效地將磷酸基團從乙酰磷酸酯轉移至dGR。孵育12 h 后，基于添加5 mmol/L 鳥苷和5 mmol/L 胸苷，獲得的最高dGMP產率高達76%。這是一種綠色高效生產dGMP的新型生物合成途徑，選用了低成本的環(huán)保試劑并減少了中間產物的積累。

圖7 一鍋法多酶級聯(lián)反應生產2'-脫氧鳥苷酸路線［70］Fig.7 One-pot multi-enzyme cascade production route of deoxyguanosine-2'-monophosphate［70］［Original guanosine substrate is first cleaved by PNPase into guanine and 1-phosphate ribose.Subsequently，NDT-Ⅱcatalyzes reaction of guanine and thymidine to produce deoxyguanosine（dGR）.Finally，dGKase and ACKase utilize cytidine triphosphate（CTP）regeneration system of acetyl phosphate to phosphorylate intermediate dGR into dGMP.During reaction，original guanosine substrate is cleaved by PNPase into guanine and ribose-1-phosphate.Then，dGR is subsequently produced by reaction between guanine and thymidine，and NDT-Ⅱcatalyzes reaction to proceed.Finally，intermediate deoxyribonucleic acid is phosphorylated by deoxyglucosidase and CTP to generate deoxyribonucleic acid polysaccharide］

3.3 多酶催化體系在心血管疾病、肝病和精神疾病藥物合成中的應用

他汀類藥物是合成降膽固醇藥物的活性成分［71-72］，阿托伐他汀與同類藥物相比在降低膽固醇方面具有強大的效力，故被認為是超級他汀類藥物［73-74］。?varc 等［75］采用多酶2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶（DERA）催化雙醛醇加成生產阿托伐他汀側鏈前體（圖8），通過DERA 將乙醛連續(xù)雙醛加成于苯乙酰胺的氨基保護丙醛上，經NADPH依賴型脫氫酶（KRED）脫氫，脂肪酶催化酰化，青霉素G-?；该摪被Ｗo，最終獲得目的產物，在補料式反應器中獲得最高的最終產物濃度為124 g/L。

圖8 阿托伐他汀側鏈前體生產路線［75］Fig.8 Atorvastatin side chain precursor production route［75］DERA—2-deoxyribose-5-phosphate aldolase；KRED—NADPH-dependent dehydrogenases；PGA—penicillin G-acylase

熊去氧膽酸（ursodeoxycholic acid）常用于治療各型肝類與眼部疾病等［76-80］。但是其化學合成方法多以動物膽酸為原料，存在步驟多、分離困難、收率低等問題［81］。Monti 等［82］首先篩選了酶的可用性（從商業(yè)來源或實驗室生產），并通過動力學測量評估了它們的底物和輔酶的特異性，之后利用“一鍋法”將細菌來源獲得的各類羥基類固醇脫氫酶（HSDHs）與輔酶再生結合，交替進行氧化步驟和還原步驟，開發(fā)出耦合的原位再生系統(tǒng)，為作用在底物分子不同部位上的氧化反應和還原反應提供了必要的驅動力，催化膽酸合成熊去氧膽酸的關鍵中間體12-酮基熊去氧膽酸（12-ketoursodeoxycholic acid）。將6 種最終反應物混合，通過酸沉淀分離出關鍵中間體產物，轉化率為73%。該混合反應存在3 種可能路徑：第1 條路徑膽酸先被NADPH 依賴型7α-HSDH 氧化為3α，12α-二羥基-7-氧代-5β-膽烷酸（3α，12α-dihydroxy-7-oxo-5β-cholanoic acid），再被12α-HSDH氧化為3α-羥基-7，12-二氧代-5β-膽烷酸（3α-hydroxy-7，12-dioxo-5β-cholanoic acid），最后通過7β-HSDH催化生成關鍵中間體12-酮基熊去氧膽酸；第2 條路徑，膽酸7 號位羥基首先被7α-HSDH 氧化為酮基，但此后則被7β-HSDH 立體選擇性還原生成熊果膽酸（ursocholic acid），最后通過12α-HSDH 氧化為關鍵中間體；第3 條路徑膽酸先被12α-HSDH 氧化為12-酮基熊果膽酸（12-ketoursocholic acid），再被7α-HSDH 氧化為3α-羥基-7，12-二氧代-5β-膽烷酸，最后通過7β-HSDH 催化生成關鍵中間體12-酮基熊去氧膽酸（圖9）。

圖9 合成熊去氧膽酸的關鍵中間體途徑［82］Fig.9 Key intermediate synthesis pathway of ursodeoxycholic acid［82］

R-1-苯 基-1，2-乙二醇［（R）-1-phenyl-1，2-ethanediol］通常用于合成R-去甲氟西?。?3］、R-氟西汀［84］和β-內酰胺類抗生素［85］，可以用來治療精神疾病和相關的新陳代謝問題［86］。通過氧化還原反應去消旋化是獲得對映體純化合物的最具吸引力的方法之一，但目前可用的酶促系統(tǒng)均受限于去消旋化的效率。Li等［87］評估了20種具有立體選擇性的氧化還原酶，篩選出了一種酮還原酶和一種立體特異性羰基還原酶，將這兩種酶組合為多酶催化體系并與輔因子再生系統(tǒng)結合（圖10）。外消旋PED 消旋為R-對映體，通過Enzyme 1，（S）-PED 被氧化成2-羥基磷灰石，同時NADP+被還原成NADPH。隨后，通過Enzyme 2，2-羥基磷灰石被還原為（R）-PED，同時還將NADPH 氧化為NADP+。利用這種“一鍋法”生產R-1-苯基-1，2-乙二醇，產率達到91.62%，光學純度為95.50%，該系統(tǒng)為今后構建體外無細胞多酶催化去消旋化體系提供了策略。

圖10 體外多酶催化去消旋化體系生產（R）-1-苯基-1，2-乙二醇［87］Fig.10 (R)-1-Phenyl-1,2-ethanediol were produced by in vitro multi-enzyme catalytic de-racemization system［87］［Racemic PED is reduced to(R)-enantiomer through selective oxidation and asymmetric reduction involving self-circulation of cofactor.Enzyme 1 oxidizes(S)-PED to 2-HAP and reduces NADP+to NADPH.Subsequently,by enzyme 2,2-HAP is reduced to(R)-PED,while NADPH is oxidized to NADP+]

3.4 多酶催化體系在其他活性成分合成中的應用

D-葡萄糖二酸（D-gluconic acid）是一種重要的增值化學品原料和添加劑，在制藥行業(yè)中也有廣闊的應用前景［88］。但是葡萄糖酸在生物體內由于代謝物競爭等原因，生產效率并不高，這促使人們尋求更高效、生產成本更低的途徑。傳統(tǒng)的葡萄糖酸的生產方法是離子交換法［89］，樹脂的再生、鹽污染的處理都大大增加了生產成本，人們轉而利用生物多酶催化的方法，Su 等［90］開發(fā)了一種新型的多酶級聯(lián)反應，利用單個容器“一鍋法”結合7種酶有效地將蔗糖轉化為D-葡萄糖二酸，將50 mmol/L 的蔗糖轉化為34.8 mmol/L 的D-葡萄糖二酸，達到了理論收率的75%。也有研究者通過非共價鍵將多種酶共固定在氧化石墨烯上，用于從淀粉中一鍋生產葡萄糖酸［91］。此外，Petroll等［92-93］在體外構建了一種以葡萄糖為底物多酶催化生產D-葡萄糖酸的平臺，整個過程一共有6種酶參與，其中NADH 氧化酶（Nox）用于NAD+的再生，將熱穩(wěn)定酶和嗜溫酶融合提高穩(wěn)定性（圖11），并對途徑中的酶進行固定化和回收利用，將途徑分為兩個反應（“兩鍋法”），生產率達到（0.170±0.004）g/（h·L），是迄今為止報道的最高生產率。

圖11 多酶催化生產D-葡萄糖二酸［90］Fig.11 Production of D-gluconic acid by multi-enzyme catalysis from glucose［90］[Conversion of G1P to GlucA was achieved by six enzymes:i)a phosphoglucomutase(PGM)which catalyses intermolecular phosphate transfer of G1P to G6P,ii)a myo-inositol-3-phosphate synthase(IPS)which catalyses multi-step oxidation,cyclisation and reduction of G6P to I1P,iii)a inositol-1-monophosphatase(IMP)which catalyses dephosphorylation of I1P to myo-inositol,iv)a myo-inositol oxygenase(MIOX)which mediates oxygen-catalysed oxidation of myo-inositol to GA,v)uronate dehydrogenase(Udh)which catalyses oxidation of GA to glucaro-1,4-lactone(GlucA lactone)under reduction of NAD+to NADH and vi)a NADH oxidase(Nox)for NAD+regeneration to minimise supply of expensive coenzyme for continuous GlucA production.GlucA lactone ring is mostly stable in neutral solutions and is hydrolysed to GlucA with heating in alkaline conditions]

萜類化合物（terpenoids）是與工業(yè)相關的天然產物中具有生物活性的最大類別之一，并被廣泛應用于生物燃料、日用化學品、維生素、藥物等相關產業(yè)中［94-98］。目前通過微生物發(fā)酵生產萜類化合物已經得到了應用，大腸桿菌和釀酒酵母均已成功工程化能夠生產單萜、二萜等化合物［99-101］。但是大批量生產工業(yè)用的萜類化合物還尚未實現(xiàn)，產品或中間體的毒性、相互競爭的內源途徑、難以分離產物等問題限制了工程菌的高產量生產。Korman 等［102］試圖通過無細胞生產的方法來解決上述問題并成功提高了產量。首先使用CoPASI38 開發(fā)了計算機模型探索整個系統(tǒng)設計的基本特征。在獲得合理模型的情況后，利用“一鍋法”構建了一個含有27 種酶的系統(tǒng)可將葡萄糖轉化為單萜（圖12），轉化率＞95%，產物濃度＞15 g/L，遠高于細胞系統(tǒng)，表現(xiàn)了巨大的應用潛力。

圖12 多酶催化生產單萜［102］Fig.12 Production of monoterpenes from glucose by multi-enzyme catalysis［102］(Enzymes in each sub-module are marked with colored boxes,and steps of consuming and generating ATP are shown in purple and blue respectively.Purge valve that produces NADPH is shown in red,while top of mevalonate pathway that consumes NADPH is shown in orange.Solid arrow represents flow of cofactor,and dotted arrow emphasizes cycle of each step in pathway)

5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，5-ALA）作為一種環(huán)境相容性及選擇性很高的新型光活化農藥［103］，在農業(yè)領域應用非常廣泛［104］，其合成方法主要通過化學合成［105］和微生物發(fā)酵生產［106］?；瘜W合成以乙酰丙酸為原料，但是3 位和5 位在溴代中選擇性接近，致使5 位分離產率較低。Meng 等［107］使用熱穩(wěn)定酶開發(fā)無細胞多酶催化過程用于5-氨基乙酰丙酸的生產。以廉價的琥珀酸和甘氨酸為底物，開發(fā)了通過3 種酶，即來自糖醋桿菌的5-氨基乙酰丙酸合酶（LS-ALAS），來自大腸桿菌的琥珀酰CoA 合酶（Suc）和多磷酸鹽激酶（Ppk）生產ALA 的無細胞催化過程。該過程中通過Ppk 再生ATP，而CoA 通過ALAS 和Suc 催化的兩個反應進行再循環(huán)（圖13）。琥珀酰CoA 的前體琥珀酸酯以分批補料的方式加入到反應體系中，避免其對Suc 的抑制作用。反應160 min 后，5-氨基乙酰丙酸濃度最終增加到5.4 mmol/L（0.7 g/L），這是生產5-氨基乙酰丙酸的首次無細胞研究，也是對未來高效經濟生產5-氨基乙酰丙酸的一種嘗試。

圖13 無細胞多酶催化合成5-氨基乙酰丙酸［107］Fig.13 Synthesis of 5-aminolevulinic acid catalyzed by cell-free multi-enzyme［107］[(Succinyl-CoA synthase catalyzes succinate to produce succinyl-CoA,and CoA can be catalyzed by two reactions catalyzed by 5-aminolevulinic acid synthase and succinyl-CoA synthase recycling is carried out,and another required substrate,ATP,provides required ATP from polyphosphate through polyphosphate kinase regenerationsystem)]

4 多酶催化體系存在的問題

雖然蛋白質模擬和設計的新興技術已經取得長足進展，使得工藝設計定制特定的酶成為可能，但對酶動力學及其構效關系仍缺乏完整而深刻的認識。首先，從環(huán)境動力學角度出發(fā)，環(huán)境因素（例如特定的化學物質、pH、溫度等）會顯著影響多酶系統(tǒng)的相互作用，因此最佳的酶催化條件通常不適合多酶的組裝［108］。同時由于大分子相互作用的復雜性，在分子水平上實時監(jiān)測多酶體系的組裝過程和探索組裝機理是一個挑戰(zhàn)，所以為了揭示多酶復合物受控組裝的機理，可以開發(fā)更高級的動態(tài)模擬組裝過程中涉及多級相互作用的構象變化的策略。如在Qiu 等［109］的研究中開發(fā)了基于量子點（QDs）的納米探針（圖14），它能夠檢測彎曲的毛細管內兩種酶的相互作用，然后通過監(jiān)測原始Cy5-LEVLVP-QD 復合物產生的峰和顯著的熒光變化，對兩種不同的酶進行了靈敏的分析。

圖14 Cy5-LEVLVP-QD納米探針多酶檢測原理［109］Fig.14 Schematic representation of multi-enzyme detection using Cy5-LEVLVP-QD nanoprobe［109］

同樣在Xiang 等［110］的研究中使用多層酶逐層組裝的單壁碳納米管（SWCNT）復合標簽技術放大檢測的靈敏度，捕獲抗體和次級信號抗CEA/酶-LBL/SWCNT生物綴合物之間的相互作用（圖15）。

圖15 SWCNT-（PDDA/ALP）n-PDDA-PSS-Ab2生物偶聯(lián)物的制備［110］Fig.15 Illustration of preparation of SWCNT-(PDDA/ALP)n-PDDA-PSS-Ab2 bioconjugates［110］

其次，所謂的從頭設計仍然停留在非?；A的階段，基于此設計的酶活性差、穩(wěn)定性低，因此，不得不使用天然的酶結構作為蛋白質進化研究的起點。隨著分子生物學和高通量篩選技術的發(fā)展，相對從頭設計而言，酶的結構改造已經較為成熟，獲得具有更多特性不同的酶突變體，如提高工業(yè)酶底物活性和穩(wěn)定性，已是生物制造行業(yè)較為常見的步驟。大量突變體的獲得及改造思路的完善，使得生物催化劑庫得到擴充，在體內和體外構建多酶催化體系也因此變得更為簡單易行。在Lim 等［111］的研究中開發(fā)了一種通用的基于CRISPR/Cas 的策略，來構建可編程模式的多酶復合物（圖16），催化無活性的dCas9 核酸酶與SpyCatcher-SpyTag 化學結合使用，以高度模塊化的方式組裝酶。

圖16 DNA支架組裝CRISPR/Cas定向多酶復合物［111］Fig.16 General scheme of CRISPR/Cas-directed programmable assembly of multienzyme complexes on a DNA scaffold［111］

5 結語

隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展，環(huán)保綠色等概念的提出，對化學品的生產要求也越來越高，而且手性化學品與結構復雜的化學品利用化學合成難度較大。酶被用來代替化學催化劑轉化有機化合物，并具有更高的反應效率、區(qū)域選擇性和立體選擇性等優(yōu)點。因此，生物催化劑現(xiàn)在被廣泛用于生產有價值的商品化學品、藥品和燃料。此外，生物催化反應通常在較溫和的溫度范圍內進行，反應所需的能量較低，生物催化反應可以在水環(huán)境中進行，降低了溶劑的使用和處理/回收成本，而能源消耗和產物分離成本是影響產品最終價格的重要因素。

由于多酶催化體系高度可控，以及模式化工具箱的出現(xiàn)和人工多酶合成途徑的增多，一般僅利用常見的起始原料，即可生產各類代謝中間體，并轉化為更為復雜的目標化合物。與傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵生產相比，多酶催化系統(tǒng)具有許多優(yōu)勢，體外構建多酶催化體系復雜程度較低，反應條件易于控制，通?？梢垣@得一些純度更高的產物，甚至能夠構建一些新型的多酶催化體系來完成一些生物體內本來不存在的反應［112］。隨著不同生物催化劑的使用范圍的不斷擴大，這些多酶級聯(lián)催化可能會變得更加普遍，但在構建多酶催化體系時，不僅要考慮到總體催化效率，還需要對體系中的介質和每種酶的催化活性進行評估和選擇，從而避免競爭途徑、毒性效應和宿主與工業(yè)條件的不相容等問題。

然而多酶催化體系仍有許多不足之處，如需要生產和純化各個生物酶，并構建空間復合體系，導致時間和經濟成本的提高，且沒有類似于積木一樣隨取隨用的模塊酶，生產特定產物需要構建特定的體系，隨著多酶體系的復雜程度提高，反應動力學的變化也不可忽視，此外產物抑制和酶催化劑的不穩(wěn)定等問題，使多酶催化體系的構建技術仍不適用于工業(yè)化大規(guī)模生產。多酶催化體系雖然更易于控制，但需要對生物催化劑進行生產和純化，并將其組裝成空間結構的系統(tǒng)，這就又為工業(yè)應用增加了成本。未來多酶催化體系的構建應與計算機模擬和許多新興技術與材料相結合，研究設計出可重復使用，耐受性強和實用方便的多酶反應系統(tǒng)，使其越來越多地應用于生物材料與化工產品的生產上。