尚德靜, 趙 蕾*, 王 野*, 姜鳳全,2
(1.遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,遼寧 大連 116081; 2.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 檢驗科,遼寧 大連 116011)
糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)作為一種條件致病菌,容易形成保護性生物被膜,引起多種慢性感染,例如:感染性心內(nèi)膜炎、尿路感染、傷口感染等,是引起醫(yī)院內(nèi)獲得性感染的主要病原菌之一[1-2].隨著抗生素的廣泛使用,糞腸球菌對臨床上常用的多種抗生素,如帕拉西林、四環(huán)素、左氧氟沙星、阿奇霉素等都產(chǎn)生了耐藥性,糞腸球菌耐藥性的產(chǎn)生給醫(yī)學(xué)界帶來了重大挑戰(zhàn)[3].生物被膜主要由胞外蛋白、胞外DNA(eDNA)和胞外多糖(EPS)等組成,保護細菌免受洗滌劑、抗菌劑和環(huán)境壓力的影響,使細菌對抗生素治療的抗藥性提高10~1 000倍.美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health)估計,多達80%的細菌感染與生物被膜有關(guān),這極大地增加了發(fā)病率和死亡率[4-5].目前認為糞腸球菌生物被膜的形成受其群體感應(yīng)系統(tǒng)(Quorum sensing,QS)的調(diào)控[6].QS是細菌間一種通信系統(tǒng),即細菌通過可擴散的小分子信號感知細胞群體的密度,從而導(dǎo)致細菌群體中某些特定基因的協(xié)同表達[7-8].目前研究發(fā)現(xiàn)糞腸球菌QS中fsr毒力因子調(diào)節(jié)系統(tǒng)可通過調(diào)節(jié)明膠酶(gelE)等毒力因子的表達調(diào)節(jié)生物被膜的形成和發(fā)展[9].Fsr信號系統(tǒng)編碼基因(fsrA、fsrB、fsrC和fsrD)位于gelE的上游,其中,fsrA、fsrB、fsrC與gelE的生成有直接關(guān)系.有研究人員將DNA片段整合到糞腸球菌V583的衍生突變體的fsr位點上,發(fā)現(xiàn)可以抑制gelE的活性,并阻止了生物被膜的形成[10-12].抗菌肽(Antimicrobial peptides, AMPs)是生物體先天免疫的主要成分之一,由10~50個氨基酸構(gòu)成,具有分子量小、帶3~5個正電荷、廣譜抗菌等特點[13],多數(shù)陽離子抗菌肽在膜環(huán)境中能形成兩親性的α-螺旋結(jié)構(gòu)[14-15].細菌細胞膜中含有帶負電荷的磷脂,因此帶正電荷的抗菌肽可以通過靜電作用與帶負電荷的細菌細胞膜結(jié)合,并通過其特有的兩親性α-螺旋結(jié)構(gòu)插入膜的疏水區(qū)域,引起膜的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)位置的變化,進而破壞了細胞膜的完整性和穩(wěn)定性,內(nèi)容物流出,造成細菌死亡[16-18].抗菌肽這種獨特的靶向細菌膜系統(tǒng)的殺菌機制也使得細菌不易產(chǎn)生耐藥性[19-20],使其最有希望成為取代抗生素的新型抗菌藥物[21-22].本實驗室前期從中國林蛙(Ranachensinensis)皮膚分泌物中分離純化了天然抗菌肽Temporin-1CEb,并以此為模板,通過氨基酸替換、增加等方式,設(shè)計合成了抗菌肽LK-6.并在LK-6的基礎(chǔ)上,將不同位置上的亮氨酸(Leu)和異亮氨酸(Ile)替換成色氨酸(Trp),合成了含色氨酸系列抗菌肽(Trp-containing antimicrobial peptides).Trp的疏水性較強,與其他抗菌肽相比,含Trp的抗菌肽更容易插入磷脂雙分子層中,使含色氨酸系列抗菌肽的抗菌活性顯著增強[23].本文旨在研究含色氨酸系列抗菌肽對多藥耐藥糞腸球菌(Multiple-drug resistantEnterococcusfaecalis, MREF)的抗菌活性,并從細菌內(nèi)外膜系統(tǒng)、QS調(diào)控的生物被膜(Biofilm)和毒性因子等方面對抗菌肽的作用機制進行了研究,為研發(fā)新型抗菌藥物提供理論依據(jù).
含色氨酸系列抗菌肽由寧波康貝生化有限公司(寧波,浙江)用標(biāo)準(zhǔn)多肽Fmoc固相合成法合成,多肽的純度大于95%,經(jīng)反相高效液相色譜(RT-HPLC)和MALDI-TOF質(zhì)譜檢測其分子量和純度;多藥耐藥糞腸球菌MREF0321株是從臨床樣本中分離鑒定的菌株,由大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實驗室提供;2.5%(體積分數(shù))戊二醛、無水乙醇、PBS緩沖液、牛肉膏、蛋白胨和氯化鈉等實驗室常用試劑購于Aobox Biotechnology公司(北京);培養(yǎng)皿、濾膜、注射器、涂布棒、酒精燈、移液槍、96孔板等實驗室常用材料購于上海玉博生物科技有限公司 (上海);cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR試劑盒購于寶生物工程有限公司(大連);NPN(N-phenyl-1-naphthylamine)購于Sigma公司(上海);DiSC3-5購于Solarbio公司(北京).
1.2.1 最小抑菌濃度(MIC)測定
細菌37 ℃過夜培養(yǎng)至對數(shù)生長期,稀釋到2×105CFU/mL.取50 μL菌懸液加入96孔板中,加入50 μL不同濃度的抗菌肽在37 ℃孵育18 h,用酶標(biāo)儀測定OD600值.無菌水和LB液體培養(yǎng)基作為空白對照,菌懸液和無菌水作為陰性對照,抗菌肽和LB液體培養(yǎng)基作為陽性對照,根據(jù)公式計算細菌的存活率:
存活率(%)=OD600{(菌+肽)-(LB+肽)}/{(菌+水)-(LB+水)}×100%.
MIC定義為存活率<5%時的抗菌肽濃度.
1.2.2 殺菌動力學(xué)(Time-killcurve)
對數(shù)生長期細菌(1×105CFU/mL)中分別加入終濃度為1×MIC、4×MIC、8×MIC和16×MIC的抗菌肽,37 ℃震蕩培養(yǎng).分別在培養(yǎng)10、30、60、90、120、180和240 min時,取培養(yǎng)物離心(4 000 r/min)10 min.洗去藥物,將樣品稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛群螅? mL稀釋液涂在LB瓊脂培養(yǎng)基上,37 ℃過夜培養(yǎng),次日記錄平板上的細菌菌落數(shù).菌懸液和無菌水作為對照.
1.2.3 掃描電子顯微鏡觀察細菌形態(tài)
500 μL對數(shù)生長期細菌(1×105CFU/mL)中分別加入500 μL終濃度為1×MIC和2×MIC的抗菌肽,37 ℃震蕩培養(yǎng)1 h后,用PBS緩沖液洗滌細菌培養(yǎng)物2次,再用2.5%(體積分數(shù))戊二醛4 ℃固定12 h.固定后用30%、50%、70%、80%、90%和100%(體積分數(shù))乙醇依次進行梯度脫水,每次15 min,自然干燥,噴金后,利用掃描電子顯微鏡觀察.菌懸液和無菌水作為對照.
1.2.4 激光共聚焦顯微鏡觀察細菌細胞膜完整性
對數(shù)生長期細菌(1×105CFU/mL)中分別加入終濃度為1×MIC、4×MIC的抗菌肽,37 ℃震蕩培養(yǎng)1 h后,離心10 min,用PBS清洗3次,每次10 min,得到樣品.將染料PI與SYTO9等比例混合,制成染色液.取1 mL染色液加入樣品中,37 ℃避光染色0.5 h后離心,并用PBS清洗3次后,滴在載玻片上,用防淬滅液固定后,用透明指甲油封片,最后用激光共聚焦顯微鏡觀察(SYTO9激發(fā)/發(fā)射波長為485/530 nm,PI激發(fā)/發(fā)射波長為485/630 nm).菌懸液和無菌水作為陰性對照,多黏菌素B(polyB)作為陽性對照.
1.2.5 Zeta電勢檢測細菌表面的膜電位
取對數(shù)生長期菌懸液離心(3 000 r/min)10 min,用PBS緩沖液將細菌進行重懸,并稀釋到1×105CFU/mL備用.1 mL菌稀釋液中分別加入10 μL不同濃度的抗菌肽,混勻,37 ℃培養(yǎng)5 min.取60 μL混合培養(yǎng)物用Zeta電位分析儀測定細菌表面膜電位.菌懸液和無菌水作為陰性對照,polyB作為陽性對照.
1.2.6 細菌外膜滲透性測定
取對數(shù)生長期菌懸液離心(3 000 r/min)10 min,用緩沖液(5 mM HEPES, 1 mM NaN3)清洗2次后重懸細菌,并稀釋到1×105CFU/mL備用.染料NPN用甲醇配成濃度為10 μM的溶液.在96孔板中加入90 μL菌液和20 μL NPN溶液,混勻,加入10 μL不同濃度的抗菌肽,37 ℃培養(yǎng)1 h,用熒光酶標(biāo)儀檢測熒光強度的變化(激發(fā)波長350 nm,發(fā)射波長420 nm).菌懸液和無菌水作為陰性對照,polyB作為陽性對照.
1.2.7 細菌內(nèi)膜去極化測定
取對數(shù)生長期菌懸液離心(3 000 r/min)10 min,用緩沖液A(5 mM HEPES,20 mM葡萄糖)清洗2次.用緩沖液B(5 mM HEPES,20 mM葡萄糖,100 mM KCl, pH=7.4)重懸細菌,并稀釋到1×105CFU/mL備用.在96孔板中加入90 μL菌懸液和10 μL終濃度為4 μM的 DiSC3-5熒光染料,用熒光酶標(biāo)儀檢測熒光強度(激發(fā)波長622 nm, 發(fā)射波長670 nm),直到DiSC3-5達到最大吸收,分別加入終濃度為1×MIC、2×MIC、4×MIC的抗菌肽,用熒光酶標(biāo)儀檢測熒光強度(激發(fā)波長622 nm, 發(fā)射波長670 nm).菌懸液和無菌水作為陰性對照,polyB作為陽性對照.
1.2.8 細菌生物被膜形成的測定
取50 μL對數(shù)生長期菌懸液(2×105CFU/mL)加入96孔板中,加入50 μL不同濃度的抗菌肽,在37 ℃孵育24 h后,輕輕除去上清液,并用PBS清洗2次,加入甲醇作用15 min,用0.1% (質(zhì)量分數(shù))結(jié)晶紫染色5 min,用清水洗凈,再在每個孔中加入100 μL 95%(體積分數(shù))乙醇,振蕩30 min后,用酶標(biāo)儀測OD590.對照組是菌懸液和無菌水.
生物被膜生成量計算公式:
生物被膜生物量=OD590(加藥)/OD590(對照).
MBIC50被定義為50%的生物被膜被抑制時的抗菌肽濃度,將濃度轉(zhuǎn)換成log值作為X值,抑制率作為Y值,帶入graphpad prism 軟件計算.
1.2.9 細菌生物被膜分解的測定
取50 μL對數(shù)生長期菌懸液(2×105CFU/mL)加入96孔板中,加入50 μL LB培養(yǎng)基,37 ℃孵育24 h后,將上清液倒掉,分別加入50 μL不同濃度的抗菌肽,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,輕輕去掉上清液,用PBS洗后加入甲醇靜置15 min,然后用0.1%(質(zhì)量分數(shù))結(jié)晶紫染色5 min,用清水洗凈加入100 μL 95%(體積分數(shù))乙醇,振蕩培養(yǎng)30 min,用酶標(biāo)儀測OD590.對照組是菌懸液和無菌水.
生物被膜生成量計算公式:
生物被膜生物量=OD590(加藥)/OD590(對照).
MBRC50被定義為50%的生物被膜被分解時的抗菌肽濃度,將濃度轉(zhuǎn)換成log值作為X值,分解率作為Y值,帶入graphpad prism 軟件計算.
1.2.10 細菌生物被膜組分EPS含量的測定
取50 μL對數(shù)生長期菌懸液(2×105CFU/mL)加入96孔板中,加入50 μL不同濃度的抗菌肽,37 ℃孵育24 h后離心(10 000 r/min)15 min,然后將沉淀重懸于高鹽緩沖液,再次離心(10 000 r/min)30 min,取上清液與三體積的冷乙醇混合,4 ℃溫育過夜后加入提前預(yù)冷的苯酚和H2SO4混合物中,用酶標(biāo)儀測OD490.對照組是菌懸液和無菌水.
1.2.11 細菌生物被膜組分eDNA含量的測定
取50 μL對數(shù)生長期菌懸液(2×105CFU/mL)加入Ep管中,加入50 μL不同濃度的抗菌肽,37 ℃孵育24 h后通過孔徑為0.22 μm的濾膜進行過濾去除細菌.取90 μL濾液加入96孔板中,用酶標(biāo)儀測OD260.對照組是菌懸液和無菌水.
1.2.12 RT-qPCR檢測明膠酶相關(guān)基因表達
取1 mL對數(shù)生長期菌懸液(1×105CFU/mL)加入Ep管中,分別加入終濃度為1/4×MIC、1/2×MIC的抗菌肽,37 ℃孵育24 h后離心(10 000 r/min)15 min,在沉淀中加入20 μL 10 mg/mL的溶菌酶,37 ℃水浴鍋靜置45 min后,提取細菌總RNA,并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,進行RT-qPCR實驗. RT-qPCR反應(yīng)體系為20 μL,包括10 μL 2×SYBR Premix Ex TaqⅡ,0.8 μL正反向引物,2 μL樣品,6.4 μL ddH2O.反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性30 s,94 ℃5 s,55 ℃15 s,72 ℃10 s,循環(huán)40次,延伸30 s.對照組是菌懸液和無菌水.16SrRNA用作內(nèi)參,基因定量通過內(nèi)參基因歸一化表示.RT-qPCR的結(jié)果用比較循環(huán)閾值(Cycle threshold,Ct)表示,Ct值計算公式:
ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因,
ΔΔCt=ΔCt-Ctcontrol,n=2-ΔΔCt.
引物16SrRNA、fsrA、fsrB、fsrC、gelE基因由上海生工生物工程公司合成,其序列如表1所示.
2012—2015年寶清縣節(jié)水增糧行動旱田項目區(qū)由35個片區(qū)組成,總面積 15.10萬畝 (15畝=1 hm2,下同),其中中心支軸式噴灌面積7.49萬畝,絞盤式噴灌面積3.91萬畝,滴灌面積3.70萬畝??傆盟繛?49.46萬m3/a,全部為地下水。項目區(qū)共新建水源機井558眼,根據(jù)項目區(qū)水文地質(zhì)條件的差異,確定設(shè)計成井深度為60~80 m,單井設(shè)計出水量為30~80 m3/h,靜水位埋深 4~32 m。 布井間距 300~400 m,井徑 300 mm。
表1 引物序列
1.2.13 檢測細菌明膠酶活性
取50 μL對數(shù)生長期菌懸液(2×105CFU/mL)加入Ep管中,加入50 μL不同濃度的抗菌肽,37 ℃孵育24 h后離心(10 000 r/min)15 min,上清即為測試樣品.配置濃度為2%(體積分數(shù))的偶氮骨膠原溶液,將上清液和偶氮骨膠原溶液加入96孔板中,37 ℃培養(yǎng)1 h后,用酶標(biāo)儀測OD540.對照組是菌懸液和無菌水.明膠酶活性定義為在單位時間內(nèi)分解偶氮骨膠原的量,計算公式:
U=ΔOD540/(0.01×t).
其中,U代表酶活力,ΔOD540代表反應(yīng)時間內(nèi)樣品吸光度值變化量,t代表反應(yīng)時間.
1.2.14 檢測細菌自溶素活性
取50 μL對數(shù)生長期菌懸液(2×105CFU/mL)加入Ep管中,加入50 μL不同濃度的抗菌肽,37 ℃孵育24 h后離心(10 000 r/min)15 min,上清即為測試樣品.配置肽聚糖底物,將上清液和肽聚糖底物加入96孔板中,37 ℃培養(yǎng)1 h后,用酶標(biāo)儀測OD450.對照組是菌懸液和無菌水.自溶素活性定義為在單位時間內(nèi)分解肽聚糖的量,計算公式:
U=ΔOD450/(0.01×t).
其中,U代表酶活力,ΔOD450代表反應(yīng)時間內(nèi)樣品吸光度值變化量,t代表反應(yīng)時間.
含色氨酸系列抗菌肽的相對分子質(zhì)量、理化性質(zhì)和抗菌活性如表2.從表中可以看出,5個抗菌肽(I1W、I4W、L5W、L11W和L12W)氨基酸組成相同,都含有1個Trp殘基,但Trp分別位于氨基端的1、4、5、11和12位點,分子量相同,兩親性和疏水值相似.2個抗菌肽含有2個Trp殘基,分子量相同,兩親性和疏水值相似.7種含色氨酸系列抗菌肽對MREF0321均有較強的抗菌活性,MIC值為1.56~6.25 μM.
表2 含色氨酸系列抗菌肽的生物學(xué)性質(zhì)和抗菌活性
圖1 含色氨酸系列抗菌肽對MREF0321的殺菌活性
SYTO9與PI是檢測細胞膜完整性的兩種染料:SYTO9能夠進入具有完整細胞膜的細菌內(nèi),將細菌染成綠色;而PI無法通過完整的細胞膜,只有當(dāng)細胞膜被破壞時,才能夠進入細菌細胞內(nèi),與細胞核DNA結(jié)合呈紅色熒光.因此,可以通過細菌中紅色或綠色熒光強度的比例判斷細菌細胞膜的破壞程度.結(jié)果如圖2所示,對照組是未處理的正常MREF0321細胞,均呈綠色熒光.加入I4W或L5W后紅色熒光明顯增多,綠色明顯減少,并且隨著肽濃度的增加,紅色熒光也逐漸增加,綠色熒光逐漸減少,其作用效果與陽性對照polyB的相似.提示I4W和L5W能夠利用破壞MREF0321菌株細胞膜殺死細菌.
圖2 激光共聚焦顯微鏡觀察含色氨酸系列抗菌肽對MREF0321的影響
細菌表面帶負電荷,抗菌肽帶正電荷,可以通過Zeta電勢實驗檢測細菌表面的電位變化,說明抗菌肽與細菌的結(jié)合.實驗結(jié)果如圖3A所示,加入I4W或L5W后,MREF0321表面電位從負值逐漸變成0,進一步增加到正電勢,表明MREF0321表面的負電荷逐漸被I4W或L5W所帶的正電荷中和,而且隨著肽濃度增加,呈正電勢.I4W和L5W分別在濃度為3.13 μM和6.25 μM時能夠?qū)REF0321細胞表面的負電荷完全中和,陽性對照polyB與I4W相似.NPN是一種疏水性的熒光探針,在疏水的條件下會產(chǎn)生強烈的熒光,而在水溶液條件下則會發(fā)生熒光淬滅.當(dāng)細菌外膜受到破壞時,NPN熒光染料就會進入外膜的疏水區(qū)域而產(chǎn)生熒光.可以通過檢測NPN熒光強度判斷抗菌肽對細菌外膜的滲透能力.如圖3B所示,加入I4W或L5W后,細菌細胞熒光值明顯升高,而且隨著肽濃度增大,熒光值增加,表明I4W和L5W 能增加MREF0321細胞外膜滲透性,且呈濃度依賴性.DiSC3-5是一種檢測細菌細胞膜通透性的熒光探針,如果細胞膜穩(wěn)定性或通透性被破壞,親脂性分子就會與DiSC3-5緊密結(jié)合,熒光強度隨之上升.熒光值越大說明細胞膜被破壞的程度越大.如圖3C和3D所示,DiSC3-5加入MREF0321溶液后,熒光值開始下降,6 min后熒光值不再下降,表明熒光染料達到最大吸收;第10 min加入I4W和L5W以及陽性對照polyB,1 min后,DiSC3-5熒光迅速釋放,并且肽濃度越大,熒光釋放量越多;在作用6 min時,I4W和L5W組達到最大熒光釋放量,說明I4W和L5W能夠使細胞膜發(fā)生去極化,并且具有濃度依賴性.
圖3 含色氨酸系列抗菌肽對MREF0321細胞外膜和內(nèi)膜的影響
用結(jié)晶紫染色法測定含色氨酸系列抗菌肽對MRFE0321生物被膜的形成和分解的影響.如圖4A所示,I4W和L5W明顯抑制MRFE0321生物被膜的形成,并且隨著肽濃度的增大,抑制增加.兩個肽與polyB的作用效果相似.I4W和L5W的MBIC50值都是5 μM左右,是其MIC值的2~3倍(表3),表明I4W和L5W能夠抑制 MRFE0321生物被膜的形成,但其在低于MIC濃度時,抑制效果較差.含色氨酸系列抗菌肽還可以分解已經(jīng)形成1 d的MREF0321生物被膜.如圖4B所示,低濃度的I4W和L5W 對MREF0321生物被膜的分解較差,當(dāng)肽濃度增加到4×MIC及以上時,對MREF0321生物被膜的分解效率明顯提高,分解效果與polyB相似;I4W和L5W的MBRC50值分別是8.65和10.72 μM,是其MIC值的5.5倍和3.4倍(表3),表明I4W和L5W對已經(jīng)形成1 d的MREF0321的分解能力低于其對生物被膜形成的抑制能力.EPS和eDNA是生物被膜的重要組分,在生物被膜形成過程中發(fā)揮重要的作用.如圖4C和4D所示,加入I4W或L5W后,MREF0321生物被膜中EPS和eDNA的生成量均顯著降低,而且肽濃度越高,二者生成量越少,與陽性對照polyB的作用效果相似.
圖4 含色氨酸系列抗菌肽對MREF0321生物被膜的影響
表3 含色氨酸系列抗菌肽對MREF0321生物被膜的MBIC50和MBRC50值
GelE是糞腸球菌分泌的一種重要毒性因子,其表達受fsr系統(tǒng)中fsrA、fsrB和fsrC等基因調(diào)節(jié),可以從轉(zhuǎn)錄水平上檢測含色氨酸系列抗菌肽對fsr系統(tǒng)中fsrA、fsrB、fsrC及gelE基因表達的影響.結(jié)果如圖5A所示,對照組4個基因表達量穩(wěn)定,而加入I4W和L5W后,fsrA、fsrB、fsrC和gelE的表達均低于對照組,與陽性對照polyB的作用效果相似.表明I4W和L5W能夠抑制gelE及相關(guān)基因fsrA、fsrB和fsrC的表達,并且具有濃度依賴性.gelE能夠分解膠原,當(dāng)與偶氮相連的骨膠原被分解后,偶氮染料釋放進入溶液中,熒光值即OD540就會升高,OD540越高,表示gelE活性越強.結(jié)果如圖5B所示,對照組的酶活力為0.96 U,加入I4W或L5W后,酶活力明顯降低,并且肽濃度越高,降低得越多,與陽性對照polyB的作用效果相似,表明I4W和L5W能夠抑制gelE活性,且具有濃度依賴性.GelE還能激活細菌分泌另一種毒性因子——自溶素,自溶素可以分解肽聚糖.當(dāng)肽聚糖被分解后,吸光值OD450就會降低,OD450越低,表示自溶素的活性越強.結(jié)果如圖5C所示,對照組的酶活力為0.54 U,加入I4W或L5W后,自溶素活性明顯降低,并且肽濃度越高,降低得越多,與陽性對照polyB的作用效果相似,表明I4W和L5W能夠抑制自溶素活性,且具有濃度依賴性.
圖5 含色氨酸系列抗菌肽對MREF0123毒性因子的影響
糞腸球菌作為臨床感染中最常見的致病菌,由于其固有性耐藥和獲得性耐藥,已經(jīng)對多種傳統(tǒng)的抗生素產(chǎn)生了耐藥性,因此迫切需要代替抗生素的新型藥物.隨著人們對抗菌肽的深入研究以及抗菌肽表現(xiàn)出的諸多優(yōu)點,抗菌肽受到越來越多的關(guān)注[24].目前為止,國內(nèi)外學(xué)者提出了關(guān)于抗菌肽機制的多種可能性,但普遍認為帶正電荷的陽離子抗菌肽首先通過靜電作用與細菌細胞膜上帶負電荷的磷脂雙分子層相互作用.隨后抗菌肽的疏水區(qū)域插入疏水的細胞膜磷脂雙分子層,改變細胞膜的通透性,細胞內(nèi)容物外泄,導(dǎo)致細菌死亡[25].本實驗室從中國林蛙皮膚分泌物中提取出天然抗菌肽Temporin-1CEb,并對其進行改造.前期研究發(fā)現(xiàn)含色氨酸系列抗菌肽具有較強的疏水性,其特有的側(cè)鏈基團有助于抗菌肽插入細胞膜中,對銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌等都有良好的抗菌活性.本次研究發(fā)現(xiàn)含色氨酸系列抗菌肽對MRFF0321具有良好的抗菌活性,且具有濃度依賴和時間依賴性,其中,抗菌肽I4W的殺菌活性好于L5W.兩者對細菌的作用靶點位于膜上,可以通過靜電作用與細胞膜結(jié)合改變細胞外膜和內(nèi)膜的通透性,并擾亂膜穩(wěn)定性,使細胞內(nèi)容物泄漏,導(dǎo)致細胞死亡.糞腸球菌在臨床上最常引起的疾病是尿路感染,留置導(dǎo)尿管表面易于細菌的定植和生物被膜的生成,其通過植入各種人造裝置侵入人體,在這個過程中會發(fā)生一些表型變化,從而獲得對抗菌藥物頑強的抵抗力[26-27].造成這種現(xiàn)象的主要原因就是細菌在這些人造材料表面形成了難以清除的生物被膜,生物被膜是其主要毒力及致病因素[28-29].此次研究還發(fā)現(xiàn)抗菌肽I4W和L5W能夠通過抑制fsr群體感應(yīng)系統(tǒng)中明膠酶相關(guān)基因fsrA、fsrB、fsrC、gelE的表達,抑制毒性因子自溶素和明膠酶的生成,最終抑制生物被膜及生物被膜組分EPS和eDNA的生成.國內(nèi)外的研究進展表明,除了大量膜活性抗菌肽外,許多抗菌肽可以干擾或抑制細胞內(nèi)生物合成過程,如抗菌肽buforinⅡ和PR39穿過細菌的細胞膜后與核酸作用,最終殺死致病菌[30].另一方面,有其他研究人員發(fā)現(xiàn),抗菌肽還能夠抑制對宿主有損傷的炎癥反應(yīng),抵制而不直接殺死病原體,維持組織體內(nèi)平衡,為治療傳染病提供了新途徑,因此,抗菌肽具有作為新一代抗生素的發(fā)展?jié)摿?迄今為止,在市場上有超過100種基于肽的藥物用于治療各種疾病,而在臨床試驗中幾乎有500~600種候選藥物,其中,許多都是合成型抗菌肽[31].已經(jīng)在臨床使用合成肽的實例包括用于局部應(yīng)用的多黏菌素[32],作為局部軟膏和滴眼劑的短桿菌肽[33],充當(dāng)食品防腐劑的乳鏈菌肽[31].此外,米卡芬凈和阿尼芬凈作為臨床批準(zhǔn)的抗真菌藥物,達托霉素較早用于皮膚感染,現(xiàn)在最大限度地以注射形式用作抗甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌的備用殺菌藥物[34].因此,深入研究合成肽對病原微生物的殺傷機制,能有效評估抗菌肽在臨床應(yīng)用的潛在價值,同時為新藥研發(fā)提供新思路.