虎掌南星超快速Real-time VPCR閉管檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

陳 蓉，余佳文，徐瑞超，唐 卓

1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 民族醫(yī)藥學(xué)院，四川 成都 611137

2.太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠(chǎng)有限公司，重慶 408000

3.中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所 天然產(chǎn)物中心，四川 成都 610041

虎掌南星又名掌葉半夏，是天南星科半夏屬植物掌葉半夏Pinellia pedatisectaSchott的干燥塊莖，具有燥濕化痰、祛風(fēng)止痙、散結(jié)消腫等功效[1]?；⒄颇闲悄壳盀榉撬幍淦贩N，但是被部分省地方標(biāo)準(zhǔn)收載品種[2-3]。半夏是一味常用中藥材，具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)的功效?！吨袊?guó)藥典》2020年版規(guī)定半夏為天南星科植物半夏Pinellia ternata(Thunb.) Breit的干燥塊莖。由于半夏的市場(chǎng)需求量較大，價(jià)格高，市場(chǎng)上半夏藥材的摻偽現(xiàn)象比較常見(jiàn)，其中最常見(jiàn)的偽品為虎掌南星[4]。個(gè)小的虎掌南星與半夏在形態(tài)上極為相似，經(jīng)過(guò)加工炮制之后更加難以區(qū)分。所以建立虎掌南星特異性的鑒別方法對(duì)虎掌南星藥材和半夏藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)以及2種藥材的臨床使用都具有十分重要的意義。

利用DNA分子鑒定技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥材及其成藥當(dāng)中原料藥的真?zhèn)舞b定[5-9]，從2010年至今，歷版《中國(guó)藥典》先后收載了包括烏梢蛇[10]、蘄蛇[10]、霍山石斛[11]、金錢(qián)白花蛇[11]在內(nèi)的多個(gè)中藥材的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)鑒別法?！吨袊?guó)藥典》2020年版還新增了《聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法》[12]和《DNA測(cè)序技術(shù)指導(dǎo)原則》[12]，為DNA分子鑒定技術(shù)應(yīng)用于中藥材真?zhèn)舞b定的推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。實(shí)時(shí)熒光PCR（Real-time PCR）技術(shù)是在PCR擴(kuò)增過(guò)程當(dāng)中，通過(guò)熒光信號(hào)，對(duì)PCR過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的一種技術(shù)。該技術(shù)的整個(gè)過(guò)程不需要開(kāi)蓋，在最大程度上避免了PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，同時(shí)由于該技術(shù)是一種實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)技術(shù)，相比于傳統(tǒng)瓊脂糖凝膠電泳的終點(diǎn)檢測(cè)可以節(jié)約大量的人力成本和時(shí)間成本，非常適用于大量樣本的快速檢測(cè)，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床病原微生物[13]、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品[14]、肉類(lèi)產(chǎn)品[15]的真?zhèn)舞b定等多個(gè)領(lǐng)域，2019年底爆發(fā)至今的新型冠狀病毒的核酸檢測(cè)也大都采用此法。

目前常規(guī)的RT-PCR操作采用PCR傳統(tǒng)的三步法或兩步法，整個(gè)擴(kuò)增檢測(cè)時(shí)間約為1 h，本課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，PCR過(guò)程中的變性、退火、延伸3個(gè)步驟不是一定要在傳統(tǒng)的3個(gè)溫度點(diǎn)且保持一定時(shí)間才能完成，而是可以在一個(gè)動(dòng)態(tài)的變溫過(guò)程中實(shí)現(xiàn)，即體系的溫度只需要在2個(gè)溫度點(diǎn)之間來(lái)回變化，就可以實(shí)現(xiàn)核酸的快速擴(kuò)增[16]。由于該快速核酸擴(kuò)增方法省略掉了在3個(gè)溫度點(diǎn)的停留時(shí)間，整個(gè)核酸擴(kuò)增的時(shí)間將大幅度縮短，同時(shí)由于該體系中溫度對(duì)時(shí)間的曲線(xiàn)圖會(huì)呈現(xiàn)多個(gè)重復(fù)的“V”字型，因此將上述快速核酸擴(kuò)增方法取名為“VPCR”。前期研究還證明了VPCR技術(shù)可以應(yīng)用于實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，取名為“Real-time VPCR”。使用Real-time VPCR技術(shù)同樣可以將核酸擴(kuò)增檢測(cè)的時(shí)間從1 h以上縮短至20 min左右。所以，本實(shí)驗(yàn)采用Real-time VPCR技術(shù)，建立了虎掌南星特異性的快速鑒別方法，可以在24 min內(nèi)完成擴(kuò)增檢測(cè)，以期為虎掌南星以及半夏藥材的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料和儀器

1.1 材料

特異性研究使用的虎掌南星P.pedatisecta、半夏P.ternata、水半夏Typhonium flagelliforme(Lodd.) Blume和天南星Arisaema erubescens(Wall.) Schott由太極集團(tuán)提供，經(jīng)太極集團(tuán)余佳文總工程師鑒定以及ITS序列測(cè)序鑒定無(wú)誤；用于盲測(cè)的7批藥材采集自甘肅西和（編號(hào)1）、甘肅清水（編號(hào)2、3）、河北安國(guó)（編號(hào)4）、四川成都（編號(hào)5、6）、江西贛州（編號(hào)7），每批8個(gè)樣本（a～h）。Easy Taq DNA聚合酶（貨號(hào)AP111）、Trans2K DNA Marker（貨號(hào)BM111-01）、dNTPs（貨號(hào)AD101-12）均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；GELVIEW（貨號(hào)EP1501）購(gòu)于北京百泰克公司；瓊脂糖粉（貨號(hào)TSJ001）購(gòu)于北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；引物（HAP純化)、熒光探針（HPLC純化）均訂自生工生物（上海）技術(shù)有限公司；植物基因組DNA提取試劑盒（貨號(hào)DE-06113）購(gòu)自成都福際生物技術(shù)有限公司；基于拓?fù)洚悩?gòu)酶的超快速克隆試劑盒（貨號(hào)C601-01）購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 儀器

Thermo Shaker恒溫儀（杭州博日公司）；Legend Micro 21R離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；熒光定量PCR儀（Thermo Scientific PikoReal Real-Time PCR System）；電泳系統(tǒng)（北京六一儀器廠(chǎng)）；Typhoon FLA 7000 IP瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)（GE公司），ND5000超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（百泰克公司）。

2 方法

2.1 DNA提取

采取商品化的植物DNA提取試劑盒（柱式）對(duì)樣本的DNA進(jìn)行提?。喝訒r(shí)采用一次性刀片切去樣品表面部分，刮取中間部分5～10 mg置于1.5 mL離心管中，按照植物DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行DNA提取。所提取的DNA經(jīng)超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量純度和濃度，除特殊說(shuō)明外，DNA模板均稀釋至10 ng/μL進(jìn)行使用。

2.2 Real-time VPCR擴(kuò)增

以“2.1”項(xiàng)下制備的DNA作為模板，采用虎掌南星特異性引物HP1（5’-GGGAGAC- TCCTGACGATCGGC-3’），HRP1（5’-CCACGCAG- GCCATCACTTGAT-3’），以及TaqMan探針HP（5’-FAM-CGTGGGCCGGCGGGACGAC-3’-BHQ1）進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)。反應(yīng)體系：10×Taq buffer 2.5 μL；EasyTaq酶2個(gè)單位；正反向引物各0.6 μmol/L；TaqMan探針0.3 μmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L；MgCl22 mmol/L；DNA提取液1 μL；加滅菌水補(bǔ)足20 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃解鏈30 s；94 ℃變性0 s，60 ℃ 0 s，F(xiàn)AM通道熒光采集，循環(huán)40次。

2.3 ITS序列擴(kuò)增與測(cè)序

以“2.1”項(xiàng)下制備的DNA作為模板，采用ITS通用引物ITS 5a fwd（5’-CCTTATCATTTAG- AGGAAGGAG-3’），ITS 4 rev（5’-TCCTCCG- CTTATTGATATGC-3’）進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)。反應(yīng)體系為：10×Taq buffer 2.5 μL；EasyTaq酶2個(gè)單位；正反向引物各0.1 mmol/L；dNTPs 0.2 mmol/L；DNA提取液1 μL；加滅菌水補(bǔ)足20 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃解鏈30 s；94 ℃變性5 s，50℃ 5 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)35次。擴(kuò)增產(chǎn)物送至生物公司采用上述通用引物進(jìn)行雙向測(cè)序。

2.4 瓊脂糖凝膠電泳

PCR或者Real-time VPCR擴(kuò)增結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL與1 μL上樣緩沖液進(jìn)行混合，將混合液加至經(jīng)GELVIEW染色的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，分離電壓150 V，電泳時(shí)間10 min；電泳結(jié)束后，將該凝膠置于瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察并拍照。

2.5 Real-time VPCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序和比對(duì)分析

利用“基于拓?fù)洚悩?gòu)酶的超快速克隆試劑盒”，按照試劑盒操作說(shuō)明：將Real-time VPCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接至載體，并將該載體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，再將感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行放大培養(yǎng)后涂板，待肉眼可見(jiàn)克隆長(zhǎng)出時(shí)，挑取單克隆交由生物公司采用M13通用引物M13F（5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’）進(jìn)行測(cè)序。所測(cè)得序列在Genbank BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)分析。

2.6 真實(shí)樣本測(cè)序鑒定

真實(shí)樣本檢測(cè)中，將在Real-time VPCR快速擴(kuò)增體系中顯示陽(yáng)性結(jié)果的擴(kuò)增產(chǎn)物送至生物公司，利用虎掌南星特異性引物HP1（5’-GGGAGACT- CCTGACGATCGGC-3’）直接進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序序列在Genbank BLAST網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)分析，測(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)中虎掌南星序列（AF469040.1）一致者判斷為虎掌南星樣本；對(duì)于在Real-time VPCR快速擴(kuò)增體系中顯示陰性結(jié)果的樣本，取其DNA提取液，按照已報(bào)道文獻(xiàn)所述方法[17]進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后將擴(kuò)增產(chǎn)物送至生物公司，利用文中所報(bào)道半夏特異性引物BP3（5’-GGGAGACTCCCGACGATCG- CA-3’）直接進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序序列在Genbank BLAST網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)分析，測(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)中半夏序列（AF469036.1）一致者判斷為半夏樣本。

3 結(jié)果與分析

3.1 序列分析以及引物和探針的設(shè)計(jì)

通過(guò)對(duì)ITS序列部分進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序的方式得到虎掌南星、半夏、天南星以及水半夏的ITS序列，并將所獲得的序列與Genbank中已知序列相對(duì)比，發(fā)現(xiàn)所測(cè)得序列與Genbank中所登記序列一致（虎掌南星序列登記號(hào)為AF469040.1，半夏序列登記號(hào)為AF469036.1，水半夏序列登記號(hào)為AM777883.1，天南星序列登記號(hào)為JF975897.1。）采用序列比對(duì)軟件將四者的序列進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)虎掌南星與天南星和水半夏的序列差異較大，相似度約為78%；虎掌南星與半夏由于屬于同科同屬植物，序列相似性高達(dá)92%。根據(jù)前期的研究經(jīng)驗(yàn)以及引物和TaqMan探針設(shè)計(jì)原則，將差異堿基放至引物和探針的3’端，設(shè)計(jì)出核酸擴(kuò)增所需要的引物和探針（圖1）。

圖1 虎掌南星及其近緣品種ITS序列分析Fig.1 Sequence alignments of ITS (partial sequence) from P.pedatisecta and its closely related species

3.2 Real-time VPCR體系的建立和優(yōu)化

按照Real-time VPCR的操作[19]，分別對(duì)引物濃度和探針濃度進(jìn)行了優(yōu)化，如圖2-A所示，引物濃度在0.2～0.6 μmol/L，隨著引物濃度增加，Ct值從26.12降至20.99，但是當(dāng)引物濃度從0.6 μmol/L升至1 μmol/L的過(guò)程中，Ct值變化不大，同時(shí)由于過(guò)高的引物濃度可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)生，故將引物濃度設(shè)定為0.6 μmol/L。在探針濃度方面，如圖2-B所示，當(dāng)探針濃度從0.1μmol/L升至0.3 μmol/L的過(guò)程中，Ct值從21.66降低至20.85，但是當(dāng)探針濃度從0.3 μmol/L升至0.5 μmol/L的過(guò)程中，Ct值變化不大，所以將探針濃度設(shè)定為0.3 μmol/L。所以最終確定在20 μL的反應(yīng)體系中，優(yōu)化后引物濃度為0.6 μmol/L；探針濃度為0.3 μmol/L，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃解鏈30 s；94 ℃、0 s，60℃、0 s，F(xiàn)AM通道熒光采集，循環(huán)40次?？偡磻?yīng)時(shí)間為24 min。

圖2 引物 (A) 和探針 (B) 濃度優(yōu)化Fig.2 Optimization of primers (A) and probes concentration (B)

3.3 虎掌南星Real-time VPCR體系特異性和準(zhǔn)確性考察

利用虎掌南星Real-time VPCR檢測(cè)體系對(duì)虎掌南星、半夏、水半夏以及天南星的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)，從而考察所建立體系的特異性，熒光擴(kuò)增結(jié)果如圖3-A所示，僅虎掌南星樣本顯示有明顯的擴(kuò)增曲線(xiàn)，Ct值在20個(gè)循環(huán)左右，而其他3個(gè)品種在40個(gè)循環(huán)以?xún)?nèi)均無(wú)明顯擴(kuò)增，將該擴(kuò)增產(chǎn)物取出經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳檢測(cè)結(jié)果與熒光PCR結(jié)果一致：僅虎掌南星樣本中有特異性的目的DNA條帶產(chǎn)生，在其他樣品中均沒(méi)有特異性擴(kuò)增條帶產(chǎn)生（圖3-B）。上述結(jié)果表示該方法具有良好的特異性。將該擴(kuò)增產(chǎn)物制作成單克隆后送測(cè)序公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示該序列與Genbank中虎掌南星序列（AF469040.1）百分之百一致；表示該方法具有高度的準(zhǔn)確性（圖3-C）。

圖3 特異性和準(zhǔn)確性考察結(jié)果Fig.3 Specificity and accuracy studies

3.4 虎掌南星Real-time VPCR體系靈敏度考察

利用虎掌南星的引物和探針?lè)謩e對(duì)質(zhì)量濃度為0.1～1×104pg/μL的虎掌南星基因組DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光VPCR擴(kuò)增檢測(cè)，熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖4。由試驗(yàn)結(jié)果可知（圖4-A），當(dāng)待檢測(cè)模板濃度在0.1 pg/μL時(shí)，在熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)上就可以看到明顯的擴(kuò)增曲線(xiàn)，說(shuō)明該體系可以檢測(cè)到低至0.1 pg/μL的DNA模板。與此同時(shí)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中還可以看出（圖4-B），當(dāng)待檢測(cè)模板質(zhì)量濃度在0.1～10 ng/μL內(nèi)，Ct值與DNA濃度的lg值之間的相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999 6，表明二者之間存在良好的線(xiàn)性關(guān)系，說(shuō)明該體系條件良好，適合實(shí)時(shí)熒光PCR的擴(kuò)增分析。

圖4 靈敏度研究Fig.4 Sensitivity analysis

3.5 真實(shí)樣本檢測(cè)結(jié)果

如前所述，由于虎掌南星常被當(dāng)做半夏使用，本課題組嘗試?yán)蒙鲜龌⒄颇闲荝eal-time VPCR快速擴(kuò)增體系對(duì)課題組所采購(gòu)的“半夏”藥材進(jìn)行檢測(cè)。首先利用“2.2”項(xiàng)中所述的DNA提取方法對(duì)所購(gòu)7個(gè)批次共56個(gè)樣本的DNA進(jìn)行提取，并對(duì)所提取的DNA質(zhì)量進(jìn)行分析和控制；再利用Real-time VPCR擴(kuò)增方法對(duì)上述DNA進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，第1批次和第3批次共16個(gè)樣本在虎掌南星的快速鑒別體系中產(chǎn)生了典型的擴(kuò)增曲線(xiàn)，且Ct值均在20左右（圖5-A、B），提示上述16個(gè)樣本為虎掌南星而非半夏，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證無(wú)誤，確定為虎掌南星品種；其余40個(gè)樣本無(wú)明顯擴(kuò)增曲線(xiàn)，通過(guò)DNA測(cè)序確定為半夏正品（圖5-C）。因此，通過(guò)以上結(jié)果證明所建立的虎掌南星快速檢測(cè)方法具有高度的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。

4 討論

從藥材圖片可以看出，半夏藥材大小不一，形態(tài)各異，由于栽培變種等原因，半夏與虎掌南星在形態(tài)學(xué)上的差異已經(jīng)變得比較模糊，而從DNA分子水平可以有效的對(duì)藥材的真?zhèn)芜M(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定。中藥材的真?zhèn)舞b定除了正品的鑒定，也包括偽品的識(shí)別，前期已有文獻(xiàn)報(bào)道了半夏藥材的真?zhèn)舞b定方法[20]，本實(shí)驗(yàn)報(bào)道了虎掌南星的快速鑒別法，二者聯(lián)用可以互為補(bǔ)充，全面的實(shí)現(xiàn)半夏藥材以及虎掌南星藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)。另一方面，中藥的質(zhì)量控制除了定性鑒別還包括定量分析，大量研究證明以DNA為基礎(chǔ)的分子鑒定方法可以有效的應(yīng)用于中藥材的定性鑒別；在定量分析上，由于DNA含量受采收時(shí)間、藥材儲(chǔ)存時(shí)間等因素影響較大，利用藥材DNA含量來(lái)對(duì)藥材重質(zhì)量進(jìn)行定量分析的研究較少，但是根據(jù)本研究結(jié)果，如要實(shí)現(xiàn)定量分析，可以對(duì)一批藥材采取抽樣分析，如抽取一定量數(shù)目的單個(gè)藥材，并對(duì)每一顆藥材都進(jìn)行鑒別，最后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算，得出本批藥材的定量分析結(jié)果。如要實(shí)現(xiàn)對(duì)大量樣本的真?zhèn)舞b定，這就要求該檢測(cè)方法能夠快速、便捷、高通量地處理大量樣本。

圖5 樣本照片和檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Sample photos and analysis results

Real-time PCR法由于其具有閉管、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、可以有效降低污染等優(yōu)點(diǎn)，目前在臨床病原微生物的檢測(cè)方面應(yīng)用較為廣泛，但在中藥材的真?zhèn)舞b定領(lǐng)域報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)在Real-time PCR法的基礎(chǔ)上，建立了更加快速的Real-time VPCR檢測(cè)方法，使得該技術(shù)的應(yīng)用變得更加簡(jiǎn)單和快捷，目前實(shí)現(xiàn)了在24 min之內(nèi)完成對(duì)虎掌南星特異性DNA的快速擴(kuò)增和實(shí)時(shí)檢測(cè)，避免了開(kāi)蓋檢測(cè)和容易污染等問(wèn)題，方法本身在高效快速的基礎(chǔ)上還兼具有靈敏、特異和準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)7個(gè)批次56個(gè)盲測(cè)樣本的準(zhǔn)確鑒定也證明了方法的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。隨著新型冠狀病毒疫情的爆發(fā)，各類(lèi)新型核酸檢測(cè)儀器和核酸擴(kuò)增技術(shù)迅速發(fā)展，推動(dòng)著整個(gè)核酸檢測(cè)技術(shù)朝著更高通量、更加快速的方向前進(jìn)。核酸檢測(cè)主要包括核酸提取、核酸擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)3個(gè)步驟，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用快速核酸擴(kuò)增技術(shù)解決了虎掌南星藥材核酸的快速擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)的問(wèn)題，在今后的應(yīng)用中，如果可以結(jié)合DNA自動(dòng)提取工作站，就可以實(shí)現(xiàn)虎掌南星藥材的自動(dòng)化、高通量、快速檢測(cè)，有效解決中藥基因檢測(cè)實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中的科學(xué)問(wèn)題、推動(dòng)中藥基因檢測(cè)技術(shù)在中藥質(zhì)量控制上的實(shí)際應(yīng)用。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)所用的方法也可以推廣到其他中藥品種，為其他中藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供新的選擇和參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突