去氫駱駝蓬堿對(duì)線蟲神經(jīng)毒性機(jī)制的內(nèi)源性代謝研究

孫倩倩，杜 裕，劉 明，宋星卓，邢彥燾，王析瑞，蔣坤秀，王 娜，劉永剛

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 102488；2.生物醫(yī)學(xué)分析中心，北京 100850)

去氫駱駝蓬堿(harmine, HM)，又稱肉葉蕓香堿，是一種三環(huán)β-咔啉類生物堿，主要來源于多年生草本蒺藜科駱駝蓬(PeganumharmalaL.)，在駱駝蓬子中含量較高，具有抗菌、抗腫瘤、降血糖、抗氧化和抗寄生蟲等藥理活性[1-2]。但駱駝蓬子有毒，去氫駱駝蓬堿具有嚴(yán)重的神經(jīng)毒性，會(huì)引起患者嘔吐、震顫、幻覺甚至死亡，因此未應(yīng)用于臨床[3]。有研究表明[4]，去氫駱駝蓬堿可能通過誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞促使炎癥因子釋放增加，導(dǎo)致神經(jīng)組織損傷。但是，目前對(duì)去氫駱駝蓬堿的神經(jīng)毒性機(jī)制尚不明確。

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans,C.elegans)屬于線蟲動(dòng)物門動(dòng)物。線蟲作為模式生物，具有培養(yǎng)簡(jiǎn)單、易保存和傳代、便于觀察、遺傳背景清晰和造模簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)[5-8]。線蟲以尿嘧啶滲漏突變型大腸桿菌(E.coliOP50)為食，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，且單個(gè)培養(yǎng)基上(直徑9 cm)可存活幾百條線蟲，簡(jiǎn)單易行。線蟲擁有簡(jiǎn)單但完整的神經(jīng)系統(tǒng)，有利于深入研究人類神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能[9]。目前研究發(fā)現(xiàn)[10-11]，可通過線蟲的運(yùn)動(dòng)行為、攝食行為、乙酰膽堿酯酶、基因表達(dá)定量分析和神經(jīng)元形態(tài)反映神經(jīng)毒性。

代謝組學(xué)通過觀察生物體系受刺激或干擾后，其代謝產(chǎn)物隨時(shí)間的變化來研究完整生物體的功能和代謝[12]。通常采用高效液相色譜(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)以及核磁共振(NMR)等高通量、高分辨和高靈敏度的分析手段研究生物體體液中的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，并結(jié)合模式識(shí)別等化學(xué)信息學(xué)技術(shù)，分析生物體在不同狀態(tài)下代謝指紋圖譜的差異，獲得相應(yīng)的生物標(biāo)志物群(Biomarkers)，從而揭示生物體在特定時(shí)間、環(huán)境下的整體功能狀態(tài)[13]。近年來，代謝組學(xué)技術(shù)被越來越多地應(yīng)用于藥物毒理研究領(lǐng)域，在揭示藥物的毒性機(jī)制、識(shí)別與靶器官損害，尤其是與肝腎損害相關(guān)聯(lián)的代謝生物標(biāo)志物方面發(fā)揮著重要作用[14]。

本課題組前期研究表明[15]，去氫駱駝蓬堿可以降低秀麗隱桿線蟲的體長(zhǎng)，神經(jīng)毒性與能量代謝相關(guān)，但作用機(jī)制和通路并不明確?；诖?，本實(shí)驗(yàn)將基于內(nèi)源性代謝探究去氫駱駝蓬堿對(duì)秀麗隱桿線蟲的神經(jīng)毒性機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀：日本島津公司產(chǎn)品；TripleTOF6600 高分辨質(zhì)譜儀：美國(guó)SCIEX公司產(chǎn)品；超低溫冰箱、超凈工作臺(tái)：美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；生化培養(yǎng)箱：北京虹湖化工有限公司產(chǎn)品；體視顯微鏡：日本Nikon公司產(chǎn)品；高溫高壓滅菌鍋：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司產(chǎn)品；KQ100VDB雙頻數(shù)控超聲波清洗器：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司產(chǎn)品；電子天平：美國(guó)Ohaus公司產(chǎn)品；萬分之一電子分析天平：瑞士Mettler Toledo公司產(chǎn)品；微量移液器：德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；智能數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇金怡儀器科技有限公司產(chǎn)品；離心機(jī)、渦旋振蕩器：賽普銳思科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂、蛋白胨、膽固醇、無水乙醇、次氯酸鈉、二甲基亞砜(DMSO)等：北京虹湖化工有限公司產(chǎn)品；氯化鈉、氯化鈣、磷酸二氫鉀、氫氧化鉀、硫酸鎂、磷酸氫二鈉、氯化銨、氫氧化鈉等試劑：蘭博利德生物科技有限公司產(chǎn)品；甲醇、乙醇、甲酸、乙腈：質(zhì)譜級(jí)，美國(guó)Fisher公司產(chǎn)品；去氫駱駝蓬堿：實(shí)驗(yàn)室自制；培養(yǎng)皿(直徑3、6 cm)：北京拜爾迪有限公司產(chǎn)品；野生型秀麗隱桿線蟲(N2 Bristol)：由遺傳所丁梅老師惠贈(zèng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLCTM HSS T3 柱(100 mm×2.1 mm×1.8 μm)；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：3 μL；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸-水溶液，B為0.1%甲酸-乙腈溶液；流速：0.3 mL/min；梯度洗脫程序：0～1.5 min(1%B)；1.5～13.0 min(1%～99%B)；13.0～16.5 min(99%B)；16.5～20.0 min(1%B)。

1.3.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，正、負(fù)離子模式下檢測(cè)；數(shù)據(jù)采集方式為依賴采集模式 (IDA)；全掃描一級(jí)譜圖及二級(jí)譜圖可以在一次分析中獲得；質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 000；質(zhì)量偏差50 mu；離子源霧化氣Gas1和輔助氣Gas2壓強(qiáng)均為50 Pa，氣簾氣壓強(qiáng)35 Pa，溫度500 ℃；噴霧電壓 (ISVF) 5 500 V/-4 500 V，去簇電壓(DP)80 V/-80 V，碰撞能量(collision energy)30±15 eV。

1.4 培養(yǎng)基(NGM)的配制

為保證線蟲能夠與藥物充分接觸，在NGM中補(bǔ)充對(duì)應(yīng)濃度的去氫駱駝蓬堿，以DMSO作為空白對(duì)照。用DMSO溶解藥物，配制成50 mmol/L母液，于4 ℃或-20 ℃保存，待NGM滅菌結(jié)束后，將配制好的藥物母液與NGM混合，制成含去氫駱駝蓬堿濃度為160、300 μmol/L的培養(yǎng)液，然后倒入培養(yǎng)板中。將培養(yǎng)板置于室溫下，待其凝固，將培養(yǎng)皿倒置，4 ℃保存，備用。

1.5 秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)

無菌環(huán)境下，在培養(yǎng)基中接種50 μL缺陷型大腸桿菌(E.coliOP50)后，再放置于生化培養(yǎng)箱中1天用于培養(yǎng)線蟲，秀麗隱桿線蟲在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)發(fā)育，于22 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，大約3～4天轉(zhuǎn)一次板，避免線蟲過于擁擠或處于饑餓狀態(tài)而進(jìn)入dauer時(shí)期(該時(shí)期線蟲為永久性幼蟲)，同時(shí)還需要保證線蟲的干凈，防止霉菌、細(xì)菌以及螨蟲等污染。

1.6 暴露實(shí)驗(yàn)

在含有300 μmol/L去氫駱駝蓬堿的培養(yǎng)板上分別接種同步化后處于卵期、L4時(shí)期的秀麗隱桿線蟲，卵期秀麗隱桿線蟲在22 ℃下暴露72 h，L4時(shí)期秀麗隱桿線蟲分為2組，分別暴露2 h和24 h，對(duì)照組為含300 μmol/L DMSO濃度的培養(yǎng)基。暴露結(jié)束后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)給藥組和空白組至少含有5 000只秀麗隱桿線蟲。

1.7 秀麗隱桿線蟲樣本的代謝物提取以及樣品制備

用M9緩沖液收集不同濃度去氫駱駝蓬堿暴露1天后的秀麗隱桿線蟲，靜置3～5 min，棄去多余的M9，用800 μL 80%甲醇沖洗3次，然后用手持勻漿機(jī)充分勻漿(冰浴)。將研磨液在4 ℃下以12 000 r/min離心20 min，上清液轉(zhuǎn)移至2 mL EP管中；再加入0.4 mL 80%甲醇提取1次，合并2次提取的上清液，在-20 ℃保存沉淀1 h，放置于離心機(jī)中，在4 ℃下以12 000 r/min離心15 min，吸取150 μL至新EP管，并備份1份。將樣品與備份樣品冷凍干燥(樣品干燥時(shí)間3～5.5 h)，于-20 ℃保存。進(jìn)行UPLC-QTOF MS檢測(cè)前，向每份樣品凍干粉中加入100 μL乙醇-水(1∶1，V/V)混合液，反復(fù)吹打管底和管壁，使其充分混合均勻，常溫下超聲5 min，以14 000 r/min離心10 min；每個(gè)樣品吸取2 μL上清液制備成質(zhì)控樣品(QC)，吸取20 μL上清液至塑料上樣管，將上樣管樣品轉(zhuǎn)移至樣品瓶中，按照空白、QC、待測(cè)樣品的順序依次放入上樣品盤中，待UPLC-QTOF MS檢測(cè)。

1.8 秀麗隱桿線蟲內(nèi)源性代謝物代謝組學(xué)分析

在網(wǎng)站(https:∥www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml)進(jìn)行信號(hào)通路的分析，分為以下幾個(gè)步驟：1) 在MetaboAnalyst home界面，點(diǎn)擊click here to start，進(jìn)入模塊選擇頁面；2) 在模塊選擇頁面，選擇Pathway Analysis模塊；3) 上傳數(shù)據(jù)，參數(shù)設(shè)置完成后，點(diǎn)擊Submit；4) 對(duì)網(wǎng)頁所顯示的物質(zhì)進(jìn)行校對(duì)；5) 選擇相應(yīng)的物種以及數(shù)據(jù)庫；6) 下載檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 秀麗隱桿線蟲代謝物檢測(cè)質(zhì)譜條件

秀麗隱桿線蟲代謝樣品在正、負(fù)離子模式下的離子流圖示于圖1。通過總離子流圖可以查看實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，色譜峰重疊部分越多則表明穩(wěn)定性越好。

2.2 秀麗隱桿線蟲內(nèi)源性代謝物代謝組學(xué)分析

秀麗隱桿線蟲內(nèi)源性代謝物的代謝通路示于圖2。在信號(hào)通路分析結(jié)果中會(huì)出現(xiàn)代謝組視圖，可以顯示所有匹配到的通路，將鼠標(biāo)放在每個(gè)節(jié)點(diǎn)上將顯示其通路名稱，單擊每個(gè)節(jié)點(diǎn)將在右側(cè)面板上顯示對(duì)應(yīng)通路。通路中，淺藍(lán)色表示這些代謝物僅作為富集分析的背景信息，并未被匹配到；灰色表示該物質(zhì)既不在數(shù)據(jù)中，富集分析時(shí)也不包括這些數(shù)據(jù)；其他顏色(從黃色到紅色不等)表示代謝物在數(shù)據(jù)中具有不同的顯著性水平。代謝物代碼信息可以直接鏈接到京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)查找。

注：每個(gè)秀麗隱桿線蟲樣本重復(fù)3次進(jìn)針；不同顏色代表不同線蟲樣本的不同進(jìn)針圖1 秀麗隱桿線蟲代謝物在負(fù)(a)、正(b)離子模式下的離子流圖Fig.1 Ion current chromatography of metabolite of caenorhabditis elegans in negative (a) and positive (b) ion modes

卵期給藥的結(jié)果示于圖2，圖中所示編號(hào)信息列于表1。所涉及顯著性水平較高的前3個(gè)通路有：嘌呤代謝通路、精氨酸和脯氨酸代謝通路以及煙酸酯和煙酰胺代謝通路。與空白組相比，嘌呤代謝通路中的ADP、cGMP、腺嘌呤、腺苷琥珀酸、鳥苷、鳥嘌呤、黃嘌呤5′-磷酸、肌苷、次黃嘌呤含量均下調(diào)，尿酸含量上調(diào)；精氨酸和脯氨酸代謝通路中，L-精氨酸、S-腺苷-L-蛋氨酸、L-脯氨酸以及L-谷氨酸鹽含量均下調(diào)；煙酸酯和煙酰胺代謝通路中，煙酰胺D-核糖核苷酸以及煙酰胺含量均下調(diào)。

表1 卵期給藥72 h涉及到的3個(gè)代謝通路有差異的代謝物信息Table 1 Specific information of the different metabolites of the 3 metabolic pathways after 72 h exposure during embryo

L4時(shí)期給藥24 h所涉及到的通路結(jié)果示于圖3，圖中所示編號(hào)信息列于表2。所涉及顯著性水平較高的前3個(gè)通路有：嘌呤代謝通路、氨?；?tRNA的生物合成通路，以及煙酸酯和煙酰胺代謝通路。其中，與空白組相比，嘌呤代謝通路中腺嘌呤、黃嘌呤、鳥苷、鳥嘌呤、黃嘌呤5′-磷酸、肌苷以及ADP含量均下調(diào)，尿酸含量上調(diào)；氨?；?tRNA的生物合成通路中，L-蛋氨酸、L-異亮氨酸、L-酪氨酸 、L-谷氨酸鹽以及L-脯氨酸含量均下調(diào)；煙酸酯和煙酰胺代謝通路中，煙酰胺D-核糖核苷酸以及煙酰胺含量均下調(diào)。

表2 L4時(shí)期給藥24 h涉及到3個(gè)代謝通路有差異的代謝物信息Table 2 Specific information of the different metabolites of the 3 metabolic pathways after 24 h exposure during L4 larva

L4時(shí)期給藥2 h所涉及到的通路結(jié)果示于圖4，圖中所示編號(hào)信息列于表3。所涉及顯著性水平較高的前3個(gè)通路有：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成通路，苯丙氨酸代謝通路以及嘌呤代謝通路。與空白組相比，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成通路中，L-酪氨酸和L-苯丙氨酸含量下調(diào)；苯丙氨酸代謝通路中，L-酪氨酸以及L-苯丙氨酸含量均下調(diào)；嘌呤代謝通路中，腺嘌呤、腺苷琥珀酸、鳥苷、黃嘌呤、黃嘌呤5′-磷酸、ADP以及cGMP含量均下調(diào)。

注：a.嘌呤代謝通路；b.精氨酸和脯氨酸代謝；c.煙酸酯和煙酰胺代謝通路圖2 卵期給藥72 h通路結(jié)果 Fig.2 Pathway results of 72 h exposure during embryo

續(xù)表2

表3 L4時(shí)期給藥2 h涉及到3個(gè)代謝通路有差異的代謝物信息Table 3 Specific information of the different metabolites of the 3 metabolic pathways after 2 h exposure during L4 larva

從以上結(jié)果可以看出，3個(gè)加藥時(shí)期共同的通路是嘌呤代謝通路以及與氨基酸代謝相關(guān)的通路，且均與能量代謝相關(guān)。

在嘌呤代謝中，尿酸是人體嘌呤代謝的終末產(chǎn)物，尿酸含量過高可引起高尿酸血癥等疾病。在3個(gè)給藥時(shí)期中，除尿酸外，檢測(cè)到所有變化的代謝物含量均下調(diào)，并且下調(diào)趨勢(shì)幾乎是：卵期給藥>L4時(shí)期給藥24 h>L4時(shí)期給藥2 h。尿酸升高的原因可能是由于線蟲嘌呤代謝的增加，使嘌呤等物質(zhì)含量下調(diào)，導(dǎo)致尿酸生成過高，也可能是由于尿酸排泄減少。

注：a.嘌呤代謝通路；b.氨?；?tRNA的生物合成通路；c.煙酸酯和煙酰胺代謝通路圖3 L4時(shí)期給藥24 h的通路結(jié)果 Fig.3 Pathway results of 24 h exposure during L4 larva

注：a.苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的生物合成通路；b.苯丙氨酸代謝通路；c.嘌呤代謝通路圖4 L4時(shí)期給藥2 h通路結(jié)果Fig.4 Pathway results of 2 h exposure during L4 larva

在氨基酸代謝通路中，所有涉及氨基酸代謝通路有變化的代謝物含量均下調(diào)。蛋氨酸缺乏時(shí)，可導(dǎo)致食欲減退、生長(zhǎng)減緩、肝壞死。異亮氨酸減少也會(huì)引起食欲減退，影響肌肉蛋白質(zhì)代謝。精氨酸減少會(huì)導(dǎo)致血氨過高，甚至昏迷，影響生長(zhǎng)發(fā)育。

3 結(jié)論

本文建立了超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜法分析去氫駱駝蓬堿的秀麗隱桿線蟲神經(jīng)毒性模型的代謝物以及代謝通路變化。結(jié)果表明，在去氫駱駝蓬堿的線蟲神經(jīng)毒性模型中，嘌呤代謝和氨基酸代謝等與能量相關(guān)的通路發(fā)生顯著變化，嘌呤代謝通路中尿酸含量升高，腺嘌呤、腺苷琥珀酸、鳥苷、黃嘌呤等代謝物含量下調(diào)；氨基酸代謝通路中，蛋氨酸、異亮氨酸、精氨酸等含量下調(diào)，且下降趨勢(shì)與給藥時(shí)間成正相關(guān)。本研究提示能量代謝與神經(jīng)毒性的相關(guān)性，為下一步闡釋駱駝蓬總生物堿神經(jīng)毒性機(jī)制提供了研究思路，也為駱駝蓬的體內(nèi)安全性評(píng)價(jià)研究提供依據(jù)。