熱蛋白質組學分析鑒定TH588的靶標蛋白

劉宗元，朱松標，鄧海騰，陳宇凌

(1.清華大學生命科學學院，北京 100084；2.生物信息學教育部重點實驗室，北京 100084)

鑒定活性小分子的靶標蛋白不僅可以建立活性小分子與細胞表型之間的聯(lián)系，闡明活性小分子的作用機理，還可以發(fā)現(xiàn)活性小分子的脫靶效應及可能的適應癥，并在藥物開發(fā)的早期階段預測潛在的副作用和毒性，從而降低研發(fā)失敗的風險?；钚孕》肿影袠说蔫b定是藥物研發(fā)的關鍵步驟之一，也是分析化學發(fā)展的重要領域。親和色譜-質譜技術是活性小分子靶標鑒定的標準方法，但需對小分子進行化學修飾，可能導致小分子的活性降低或改變，影響藥物與靶蛋白的結合。近年來，不依賴化學修飾的活性小分子靶標鑒定技術迅速發(fā)展，主要是基于活性小分子與靶標蛋白結合引起的蛋白穩(wěn)定性變化，從而改變靶標蛋白對酶促水解反應、化學變性和熱變性的耐受程度。這些鑒定方法包括藥物親和反應靶標穩(wěn)定性(DARTS)、蛋白質氧化速率穩(wěn)定性(SPROX)、細胞熱位移測定(CETSA)、熱蛋白質組分析(TPP)[1]。TPP技術基于與配體結合可增加目標蛋白在高溫下的穩(wěn)定性，造成目標蛋白隨溫度的溶解曲線發(fā)生偏移這一原理，結合高分辨定量質譜技術，可在細胞裂解物、細胞、組織甚至動物等多層面上實現(xiàn)對小分子靶標蛋白的鑒別，具有重要的應用前景[2-3]。鑒于TPP技術在操作上的復雜性，獲得可靠和可重復的TPP數(shù)據(jù)仍然非常困難。

7，8-二氫-8-氧鳥嘌呤三磷酸酶(MTH1)通過清除氧化受損的核苷酸，防止DNA復制時氧化堿基造成的DNA損傷，是細胞應對ROS引起DNA損傷的關鍵酶[4]。研究表明，在腫瘤細胞中抑制MTH1的活性，增加氧化核苷酸摻入 DNA的頻率，會導致堿基錯配、基因突變和細胞死亡的發(fā)生[4,9]。更重要的是，MTH1是腫瘤細胞生存所必需的，而正常細胞的生存并不依賴MTH1的表達，因此MTH1的抑制能特異性地遏制癌細胞的生長。作為MTH1的第一代抑制劑，TH588是在最早篩選出的含有2-氨基嘧啶結構的候選藥物小分子上添加了氨基環(huán)丙基得到的小分子，可有效抑制 MTH1的催化活性，并在體內外均具有高度的代謝穩(wěn)定性[4]。研究表明，TH588對腫瘤細胞具有毒性，但具體的作用機制卻存在爭議[5-8]。TH588在納摩爾濃度條件下即可較好地抑制MTH1活性，但其發(fā)揮抗癌作用并不依賴于MTH1。例如，研究人員開發(fā)了多種其他的MTH1抑制劑(BAY-707、NPD7155、NPD9948等)，但對人源癌細胞系并無殺傷作用[7-8,10]；在腫瘤細胞中敲除MTH1，無法抑制細胞增殖[7,11]；MTH1缺陷小鼠發(fā)生自發(fā)性癌癥的概率顯著增加[12]。與此同時，TH588具有促進腫瘤細胞內微管蛋白解聚，造成氧化損傷，并下調PI3K-AKT-mTOR軸等作用[13-16]?？梢?，在腫瘤細胞中除MTH1外，TH588還存在其他的作用靶標，鑒定TH588的脫靶效應對研究其抗腫瘤及造成機體不良反應的作用機制具有重要意義。

本研究擬通過優(yōu)化TPP方法，在Hela細胞中鑒定TH588的直接靶點和間接靶點，為進一步探究TH588抗腫瘤的作用機制提供實驗依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

UltiMate 3000液相色譜系統(tǒng)和Q Exactive HF-X質譜儀：美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；聚合酶鏈式反應分析儀(PCR儀)：美國ABI公司產(chǎn)品。

DMEM培養(yǎng)基、PBS緩沖液、青霉素/鏈霉素：中國Wisent公司產(chǎn)品；DMSO：中國索萊寶公司產(chǎn)品；胎牛血清：德國PAN公司產(chǎn)品；ECL化學發(fā)光液、PVDF膜：德國Millipore公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈、預染蛋白標簽：均為質譜級，美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；胰蛋白酶(質譜級)：美國Promega公司產(chǎn)品；三(2-羧乙基)膦(tris(2-carboxyethyl)phosphine, TCEP)、氯乙酰胺(2-chloroacetamide, ClAA)、TH588和核酸酶(benzonase)：德國Sigma公司產(chǎn)品；MTH1抗體：英國Abcam公司產(chǎn)品。

1.2 細胞培養(yǎng)

在含10% FBS和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，將Hela細胞置于含5% CO2的37 ℃細胞培養(yǎng)箱。

1.3 細胞裂解物的提取

Hela細胞經(jīng)胰酶消化后，用PBS洗滌2次，被重懸于含有蛋白酶抑制劑的PBS中，充分研磨裂解細胞。

1.4 細胞提取物的制備

將細胞懸液分為2組，分別加入10 μmol/L的TH588或DMSO，25 ℃水浴15 min后，每組均分成10份，按照37、40.4、44、46.9、49.8、52.9、55.5、58.6、62、66.3 ℃溫度梯度分別加熱3 min，于25 ℃孵育3 min，取出后加入終濃度250 U/mL核酸酶和0.8% NP-40，4 ℃下旋轉孵育1 h。蛋白溶液以47 900 r/min超速離心20 min，取蛋白上清用于后續(xù)的蛋白質免疫印跡分析和基于TMT標記的定量蛋白質組學分析。

1.5 蛋白質免疫印跡分析

向蛋白上清中加入4×蛋白上樣緩沖液(含DTT)，使用SDS-PAGE分離，通過濕轉將蛋白轉至甲醇活化過的PVDF膜上。PVDF膜使用含5%脫脂奶粉的TBST封閉，與一抗于4 ℃孵育過夜，經(jīng)TBST洗滌3次后，與二抗于室溫孵育1 h。PVDF膜上經(jīng)ECL化學發(fā)光液顯色，Bio-Rad凝膠成像儀顯影成像。

1.6 基于TMT標記定量的蛋白質組學

向蛋白上清中加入5倍體積冰丙酮，于-20 ℃放置4 h，以9 100 r/min離心棄去上清。蛋白沉淀通過8 mol/L尿素復溶，加入10 mmol/L TCEP和40 mmol/L ClAA進行還原烷基化，之后以酶∶蛋白=1∶50加入胰蛋白酶，于37 ℃酶解過夜。酶切后的樣品經(jīng)Sep-Pak tC18除鹽后，使用TMT10標試劑進行標記，反應終止后混合并除鹽，使用pH 10的HPLC體系對混合肽段進行組分分離，揮干后保存于-80 ℃，待質譜分析。

1.7 LC-MS/MS分析及數(shù)據(jù)處理

多肽樣品通過液相系統(tǒng)分離，質譜儀檢測。液相梯度洗脫程序：0～120 min(5%～55%B)。A為100%水-0.1%甲酸，B為80%ACN-0.08%甲酸，流速0.250 μL/min。質譜儀通過Xcalibur 3.0軟件進行操作，一級質譜的分辨率60 000，質量掃描范圍m/z300～1 800，最大注入時間50 ms，自動增益控制(AGC)3×106；二級掃描在數(shù)據(jù)依賴的采集模式(DDA)下運行，每個一級掃描后有最多40個二級掃描，分辨率45 000，高能碰撞解離(HCD)碎裂模式，歸一化碰撞能量(NCE)35，最大注入時間100 ms，AGC 1×105；二級掃描的分離窗口m/z0.4，動態(tài)排除時間15 s。

質譜數(shù)據(jù)使用Proteome Discoverer Software 2.3中的SEQUEST搜索引擎進行分析。參數(shù)設置如下：胰蛋白酶全切，最多允許2個漏切位點；修飾半胱氨酸上烷基化，肽段N端和賴氨酸上的TMT10標修飾設置為固定修飾；甲硫氨酸上的氧化修飾和蛋白N端的乙?；O置為可變修飾；一級質譜誤差范圍為2×107，二級質譜誤差設置為20 mmu；假陽性率FDR基于q-value，設置為小于1%，Xcorre>3；只使用特異性的肽段進行蛋白定量分析，蛋白定量基于肽段比例進行；使用 Uniprot人類蛋白數(shù)據(jù)庫(2019.11下載，共20 302個序列)進行搜庫分析。

搜庫結果以最低溫度條件作為參照，計算不同溫度點蛋白量的倍數(shù)變化，基于R語言下TPP R包[15-16]進行S型曲線擬合，并基于如下條件進行過濾：DMSO和TH588處理后的蛋白質熔解曲線，R2>0.8；DMSO曲線的平臺期<0.3；配對的DMSO和TH588處理的蛋白質熔解曲線最陡斜率<-0.06；2次DMSO重復之間每種蛋白質的熔點變化(ΔTm)<1.5 ℃。通過過濾條件的蛋白，根據(jù)2次ΔTm均大于1.5，以及TH588與DMSO的ΔTm大于2個DMSO組間的ΔTm這2個條件，篩選TH588的靶標蛋白。

2 結果與討論

2.1 TPP實驗中TH588濃度的確定

前期實驗顯示，不是所有的蛋白都表現(xiàn)出隨溫度升高而穩(wěn)定性逐漸下降的現(xiàn)象，小分子結合對蛋白熱穩(wěn)定性的影響也表現(xiàn)出較大的差異。在TPP實驗中，小分子濃度的選擇尤為重要，過低的濃度可能導致一些結合力相對較低的靶標蛋白無法被鑒定到，而過高的濃度則會增加假陽性率，給后續(xù)數(shù)據(jù)分析和靶標驗證造成困難。為了確定最合適的TH588藥物濃度，并為后續(xù)實驗提供質量控制指標，首先利用Western Blotting評估了TH588對其靶標MTH1熱穩(wěn)定性的影響。

將細胞裂解液分別以44、47、50、53、56、59、63、67 ℃的溫度梯度進行加熱，經(jīng)超速離心去除沉淀后，取等量上清液進行蛋白免疫印跡分析，用于確定高溫對MTH1穩(wěn)定性的影響，結果示于圖1a?？梢姡S著溫度升高，溶解于上清液中的MTH1總量呈下降趨勢，并且在56 ℃時已經(jīng)減少了50%以上。因此，最終選取56 ℃用于TH588藥物最佳濃度的測試分析。

圖1 溫度梯度(a)和濃度梯度(b)處理下，MTH1的免疫印跡結果Fig.1 Western blot results of MTH1 treated with different temperatures (a) and different TH588 concentrations (b)

本實驗向細胞裂解液中分別加入0、0.1、0.5、1、5、10、50、100、500、1 000 μmol/L TH588，于25 ℃孵育15 min后，56 ℃加熱3 min。超速離心去除沉淀后，取等量上清液進行蛋白免疫印跡分析，結果示于圖1b。可見，隨著TH588濃度的升高，MTH1在56 ℃的溶解度呈劑量依賴性地逐漸增加，在10～1 000 μmol/L時，MTH1的溶解度基本持平，10 μmol/L TH588即可充分保護蛋白，抵抗溫度升高造成的蛋白變性。因此，本實驗選擇10 μmol/L TH588作為后續(xù)TPP實驗的濃度。

2.2 TH588在Hela細胞中靶標的檢測

以上實驗已證明了TH588可以保護作用靶點MTH1，增加其在加熱條件下的穩(wěn)定性，并確定了10 μmol/L作為TPP實驗的TH588濃度。本研究將使用Hela的細胞裂解物進行TPP實驗，以進一步確定TH588的脫靶靶點。

在25 ℃下，加入TH588或DMSO的細胞裂解樣品孵育15 min后，將蛋白溶液分成10份，分別在37～66.3 ℃范圍內的10個不同溫度條件下，嚴格控制3 min的加熱時間，并以47 900 r/min超速離心將不溶蛋白去除，取等體積的蛋白溶液進行基于10標TMT標記的定量蛋白質組學分析。同時，為了嚴格控制樣品質量，確保質譜分析前蛋白樣品的穩(wěn)定性和可重復性，選取部分蛋白溶液進行免疫印跡實驗，證實在這批樣品中TH588增加了MTH1在高溫下的溶解性。本研究利用R語言中的TPP程序包對質譜分析結果進行解析，對2次重復實驗分別進行蛋白的熔解曲線擬合、擬合度過濾和熔點計算。

2次重復實驗分別檢測到5 546個和5 705個蛋白，其中同時鑒定到5 141個蛋白。與預期相符，大多數(shù)蛋白隨著溫度的升高而減少，并且在TH588組與DMSO組中沒有顯著差異，示于圖2。根據(jù)Savitski等[14-15]的方法，對數(shù)據(jù)進行篩選和蛋白熔解曲線的繪制，并計算熔點(Tm)，即單一蛋白變性沉淀50%時的溫度，2次實驗分別計算出3 630個和3 873個蛋白的Tm，其中有3 248個蛋白在2次實驗中均出現(xiàn)。分別計算2次重復實驗中所有蛋白的Tm值相關性，并繪制不同實驗組間的相關性分布圖，示于圖3?？芍?，大部分蛋白的Tm值在不同的實驗組間具有高度的相關性，表明本次實驗具有良好的重復性。

圖2 處理組(TH588)和對照組(DMSO)中所有蛋白質的熱穩(wěn)定性熱圖Fig.2 Thermostability heat maps of all proteins treated with TH588 or DMSO in two replicated experiments

圖3 不同實驗組中蛋白Tm的相關性分布的矩陣散點圖Fig.3 Matrix scatter of protein Tm correlations in two replicated experiments

本研究計算了蛋白在TH588組和DMSO組之間的Tm差值，得到了3 248個蛋白的熔點差ΔTm。MTH1作為TH588的已知靶點，在2次實驗中，ΔTm分別為1.89、5.81 ℃，均發(fā)生了明顯的正向偏移，即TH588的加入顯著增加了MTH1在高溫下的穩(wěn)定性，提高了其熔點，示于圖4a。雖然大多數(shù)小分子的結合可以使靶標蛋白的ΔTm升高，但前期結果與本實驗結果顯示，部分蛋白在小分子處理組的Tm較對照組出現(xiàn)下降的情況，將這類蛋白稱為小分子的間接靶標，該類蛋白可能會與小分子的直接靶標蛋白存在結合作用，小分子的結合占據(jù)了直接靶標蛋白，使該類蛋白失去了直接靶標蛋白在加熱條件下對其保護的作用，因此ΔTm下降。本研究遵循2次重復實驗中，ΔTm均大于1.5 ℃(直接靶標蛋白)或均小于-1.5 ℃(間接靶標蛋白)的篩選標準，確定了28個直接靶標蛋白和53個間接靶標蛋白，分別列于表1和表2。通過在線網(wǎng)站STRING(https:∥www.string-db.org/)對鑒定到的TH588直接靶標和間接靶標進行相互作用網(wǎng)絡分析，結果示于圖5?？梢钥闯?，中間區(qū)域蛋白網(wǎng)絡相對密集，表示TH588能夠影響該區(qū)域的蛋白互作。其中，RAN、SNRPB2、CPSF3、DDX39A、ZC3H11A、NUP214等與mRNA和蛋白在細胞內的加工和轉運密切相關。有報道證明[18]，TH588可能通過影響有絲分裂中紡錘體調節(jié)的通路來抑制腫瘤增殖，同時在功能聚類中發(fā)現(xiàn)SEH1L、RACGAP1、WAPAL等與有絲分裂相關的蛋白，提示TH588的脫靶功能可能通過影響細胞分裂來抑制腫瘤細胞增殖。

表1 TPP實驗發(fā)現(xiàn)的TH588在Hela細胞中的直接靶標Table 1 Direct targets of TH588 in Hela cells found in the TPP experiment

表2 TPP實驗發(fā)現(xiàn)的TH588在Hela細胞中的間接靶標Table 2 Indirect targets of TH588 in Hela cells found in the TPP experiment

2.3 TH588在PI3K-Akt通路中的功能分析

研究表明[15]，TH588可降低AKT和 4EBP1的磷酸化水平，以及EGFR和IGFR的表達，抑制PI3K-Akt通路，降低腫瘤的增殖和轉移。本實驗結果顯示，CDC37和HSP90B1可與TH588直接結合，示于圖4b、4c。熱休克蛋白90(HSP90)是一種保守的分子伴侶，有數(shù)百種蛋白質底物，除參與蛋白質折疊外，還參與包括DNA修復、發(fā)育、免疫反應和神經(jīng)退行性疾病在內的多種細胞過程，是維持真核細胞在生理和壓力條件下蛋白質穩(wěn)態(tài)的關鍵調節(jié)劑。HSP90B1是HSP90蛋白家族成員之一，參與蛋白的穩(wěn)定和折疊，并在分泌蛋白質的加工和運輸中發(fā)揮作用。HSP90可通過與多種伴侶蛋白結合發(fā)揮作用，CDC37是目前研究最深入的底物特異性伴侶蛋白之一，其作用主要與蛋白激酶的激活相關，CDK4，Akt等激酶的成熟依賴于CDC37-HSP90伴侶復合物[17]。TH588與CDC37和HSP90的結合可能會影響CDC37-HSP90復合物的形成，阻止其對Akt的招募與磷酸化，下調PI3K-Akt通路，抑制腫瘤細胞的增殖和遷移。

圖4 MTH1(a)、CDC37(b)、HSP90B1(c)、TUBB(d)和PPP4R2(e)的熔解曲線Fig.4 Melting curves of MTH1 (a), CDC37 (b), HSP90B1 (c), TUBB (d) and PPP4R2 (e)

續(xù)表2

注：灰色圓圈代表直接靶標；白色圓圈代表間接靶標；蛋白間連線表示已有報道的相互作用圖5 TH588的靶標蛋白網(wǎng)絡分析圖Fig.5 Network analysis of target proteins of TH588

2.4 TH588在微管形成中的功能分析

微管蛋白是構成微管的結構單元，在細胞內運輸、染色體分離和細胞遷移等多種細胞過程中起著重要作用。研究表明[18]，TH588是一種微管調節(jié)劑，可導致微管蛋白解聚，阻斷有絲分裂，抑制腫瘤細胞的增殖。本研究結果顯示，TH588可與TUBB和PPP4R2發(fā)生直接結合作用，分別示于圖4d、4e。作為9種人源β-微管蛋白之一，TUBB與微管的組成直接相關，其表達降低可增加肺腺癌細胞對紫杉醇等化療藥的敏感性。PPP4R2是蛋白磷酸酶4(PPP4C)的調節(jié)亞基之一，與PPP4C形成復合物，在中心體微管組織中心調節(jié)PPP4C的活性，參與微管生長、細胞凋亡和腫瘤壞死因子信號傳導等生物學過程。TH588與TUBB的相互作用可能直接阻止微管的組裝，與PPP4R2的結合可能會影響PPP4R2-PPP4C復合物的形成，破壞PPP4R2對PPP4C的活性調節(jié)，進而導致腫瘤細胞的死亡。

3 結論

本研究系統(tǒng)地介紹了TPP技術的工作流程，通過對已有靶點蛋白熔點和最佳藥物濃度的優(yōu)化，確定TPP實驗的溫度范圍和藥物刺激濃度，并應用該方法鑒定了TH588的作用靶標，發(fā)現(xiàn)了28個直接靶標和53個間接靶標，有助于加深對TH588抗癌作用機制的理解。