多肽組學(xué)技術(shù)在體液生物標(biāo)志物中的研究進(jìn)展

鄭琬琳，萬(wàn)磊磊，李水明,3，洪曉榆，王 勇,3

(1.深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳市腦病和大數(shù)據(jù)研究所，廣東 深圳 518055；2.深圳灣實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518055；3.深圳-香港腦科學(xué)創(chuàng)新研究院，廣東 深圳 518055)

分子質(zhì)量小于10 ku的小蛋白質(zhì)統(tǒng)稱為多肽，由內(nèi)源性肽酶水解前體蛋白質(zhì)產(chǎn)生，人體的生理或病理變化會(huì)動(dòng)態(tài)地反映在蛋白質(zhì)和肽的產(chǎn)生和代謝上[1-3]。多肽組學(xué)(peptidomics)研究體液、細(xì)胞、組織等材料中的全部多肽[4]，其中，由于體液取樣方便，可以為疾病提供可能的生物標(biāo)志物信息。早期的肽檢測(cè)主要使用放射免疫分析或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等免疫分析法，但只能分析已知序列的多肽[5]。近年來(lái)，基于質(zhì)譜的多肽組學(xué)技術(shù)得以發(fā)展，血液、唾液、尿液、汗液、淚液和胸腔積液等體液多肽組學(xué)標(biāo)志物的研究明顯增多[2,6-11]，尤以前3種體液最為常見。多肽組學(xué)的分析一般包括樣品預(yù)處理、內(nèi)源性肽提取分離、質(zhì)譜分析、肽鑒定與定量、數(shù)據(jù)分析等步驟[12]，示于圖1。本文將從多肽組學(xué)研究方法出發(fā)，對(duì)多肽的分離、表征、應(yīng)用和多肽組分析結(jié)果的影響因素等方面進(jìn)行綜述。

圖1 多肽組生物標(biāo)志物研究的一般路線Fig.1 General route of peptidomics biomarker research

1 多肽的分離方法

為降低高豐度蛋白質(zhì)、糖、脂質(zhì)或鹽等基底物質(zhì)的干擾[12]，在質(zhì)譜檢測(cè)前需進(jìn)行多肽的分離提取和富集，主要的方法包括有機(jī)溶劑沉淀法[13-14]、離心超濾法[14-15]、固相萃取(SPE)法[16-17]和納米材料磁珠富集法[17-18]等。其中，有機(jī)溶劑沉淀法通過(guò)加入乙腈等有機(jī)溶劑，使溶液中大分子蛋白質(zhì)沉淀，而肽溶解在有機(jī)溶劑中，會(huì)形成共沉淀導(dǎo)致肽損失，需要輔助解離試劑進(jìn)行增溶，提高肽的回收率[19]。Romanova等[20]使用2,5-二羥基苯甲酸(DHB)有效地從組織中提取內(nèi)源性肽，且儲(chǔ)存在DHB提取介質(zhì)中的肽提取物可穩(wěn)定保存多年，該技術(shù)簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好、易于遠(yuǎn)程制備樣品，無(wú)需冷凍即可長(zhǎng)期保存樣品。固相萃取是一種從生物樣品中獲取內(nèi)源肽的有效方法，固體吸附劑材料的結(jié)構(gòu)和表面性質(zhì)在肽的提取中起著重要作用。凝膠過(guò)濾色譜(GFC)，又稱尺寸排阻色譜(SEC)，是利用分子大小提取內(nèi)源性肽的有效方法[12]。Kononikhin等[21]在使用LC-MS/MS法對(duì)先兆子癇的尿肽組分析時(shí)，采用基于SPE和SEC 2種不同方案，發(fā)現(xiàn)相較于SPE法，SEC法鑒定的肽總數(shù)更多，且SPE法提取的肽長(zhǎng)度不超過(guò)30個(gè)氨基酸?？紫殁萚17]使用Zip-Tip C18固相萃取和氧化石墨烯-磷酸鑭納米復(fù)合材料(LaGM)分離唾液多肽組，發(fā)現(xiàn)這2種方法對(duì)多肽的富集有一定的偏好性，所得的肽段分布特征和優(yōu)勢(shì)肽段構(gòu)成存在明顯差異，即使用單一分離法只能獲得全部多肽組的部分信息。

Ziganshin等[18]提出一種從豐富的血液蛋白質(zhì)中解吸低分子質(zhì)量肽的方法。將稀釋血清加熱至98 ℃后保持15 min，將低分子質(zhì)量肽從最豐富的血液蛋白質(zhì)中分離，再使用帶有功能化表面的磁珠進(jìn)行血漿/血清分離，顯著增加了MALDI-TOF MS檢測(cè)到的低分子質(zhì)量肽的數(shù)量。Ma等[22]合成并開發(fā)了一種新穎的多功能復(fù)合材料rGO-SnO2NRs，該材料包括在還原的氧化石墨烯(rGO)片上垂直排列的介晶SnO2納米棒(NRs)多功能的親和探針，結(jié)合了rGO的疏水性和SnO2的高親和力NRs，可通過(guò)簡(jiǎn)單調(diào)節(jié)洗脫緩沖液來(lái)連續(xù)富集標(biāo)準(zhǔn)樣品和血清樣品中的內(nèi)源肽和磷酸肽，這種二元復(fù)合材料表現(xiàn)出對(duì)肽富集的高靈敏度和選擇性。Fang等[23]將固定化金屬離子親和色譜法(IMAC)與介孔材料相結(jié)合，提出了銅離子摻雜磁性介孔二氧化硅材料(簡(jiǎn)稱為“磁性介孔材料”)Fe3O4@mSiO2-Cu2+對(duì)內(nèi)源性多肽具有顯著的敏感性和尺寸專一性。Cheng等[24]用REPO4(RE=La，Nd，Eu)納米棒修飾的親和MALDI板，從復(fù)雜的生物樣品中選擇性捕獲和純化痕量磷酸肽。在基質(zhì)沉積后，可使用MALDI-TOF MS直接檢測(cè)親和板上的富集磷酸肽，整個(gè)過(guò)程可在幾分鐘內(nèi)完成。近10年來(lái)，復(fù)旦大學(xué)、軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院、大連化物所和長(zhǎng)春應(yīng)化所等多家高校和科研院所在多肽的納米材料富集方面做了大量的創(chuàng)新性工作，但采用的研究體系通常為牛血清白蛋白等簡(jiǎn)單體系，如果這些材料能用于體液多肽組等復(fù)雜體系，則可以更好地發(fā)揮新材料的特性，拓展體液多肽組的研究深度。

2 多肽組的質(zhì)譜分析方法

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)和電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)是多肽組分析中最常用的2種技術(shù)[6,25]。MALDI-TOF是早期多肽組研究的主要工具，因操作簡(jiǎn)便、分析速度快、通量高和結(jié)果直觀而被廣泛使用，但由于電離抑制效應(yīng)，MALDI-TOF得到的質(zhì)譜峰數(shù)目通常在100以內(nèi)。ESI-MS常與液相色譜或毛細(xì)管電泳聯(lián)用，獲取信息能力隨分析時(shí)間的增加而增強(qiáng)，所得多肽組序列信息更精準(zhǔn)[25-27]。有研究將這2種方法結(jié)合，先使用MALDI-TOF MS等方式分析得到差異肽信息(如質(zhì)荷比、分子質(zhì)量)后，再使用MALDI-TOF/TOF或LC-MS/MS等方式對(duì)特定差異肽進(jìn)行深入分析，從而獲得更具體的肽段信息(如肽段序列、肽來(lái)源蛋白質(zhì)等)[13,21,28-38]，但對(duì)于非特異性酶切的內(nèi)源性多肽，MALDI-TOF/TOF的二級(jí)質(zhì)譜斷裂效果欠佳。一些研究開發(fā)了新型的多肽分離技術(shù)，例如使用特殊芯片的免疫印記芯片法(BLOTCHIP-MS)，可以將凝膠電泳中分離的肽和蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)印至免疫印記芯片后直接使用MALDI-MS進(jìn)行質(zhì)譜分析，省略了染色、提取、裝載等中間過(guò)程，縮短了分析時(shí)間，可以同時(shí)分析樣本中的游離肽和蛋白質(zhì)結(jié)合肽[29,39-40]。近年來(lái)，這2種電離方式在生物標(biāo)志物中的應(yīng)用情況列于表1。可以看出，體液多肽組生物標(biāo)志物在腫瘤、內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)等疾病中均具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

表1 不同質(zhì)譜方法在疾病的體液生物標(biāo)志物的應(yīng)用Table 1 Application of different mass spectrometry methods in body fluid biomarkers of diseases

續(xù)表1

3 體液多肽組生物標(biāo)志物的應(yīng)用

研究生物標(biāo)志物的目的是鑒定和區(qū)分特定疾病[65]。腦脊液是腦室和中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管周圍的無(wú)色體液，因此腦脊液的組成會(huì)動(dòng)態(tài)地反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的許多生理或病理過(guò)程[66]。已有大量研究證明，α-突觸核蛋白、Aβ42、tau、磷酸化tau和神經(jīng)絲蛋白等腦脊液蛋白或多肽可用于診斷阿爾茨海默病[67]、帕金森病[68]和額葉顳葉癡呆[69]等神經(jīng)退行性疾病。Wijte等[13]利用MALDI-TOF對(duì)阿爾茨海默病患者死后腦脊液中的肽進(jìn)行差異分析，鑒定出游離肽組分中的差異肽來(lái)源于VGF神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)前體和補(bǔ)體C4前體，蛋白結(jié)合肽組分中的差異肽來(lái)源于VGF神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)前體和α-2-HS-糖蛋白。為了檢測(cè)腦血管疾病煙霧病的生物標(biāo)志物，Maruwaka等[41]通過(guò)SELDI-TOF MS分析患者腦脊液，發(fā)現(xiàn)4 473 u等3個(gè)肽段強(qiáng)度顯著升高。但是，獲得腦脊液樣品需要侵入性取樣，并且可能引起某些患者的不適或副作用[70]，很難對(duì)存在的潛在患者進(jìn)行普遍篩查，需要血液、唾液、尿液等非侵入性和更易獲得的生物標(biāo)志物來(lái)源。

3.1 血清和血漿

血液(血清或血漿)是人類所有細(xì)胞、組織和器官之間的主要紐帶，組織微環(huán)境中產(chǎn)生的蛋白水解肽片段可以反映早期病理變化[65]，而小尺寸的肽段容易分泌到細(xì)胞外間質(zhì)，從而釋放到血液循環(huán)中[71]。部分血液肽組學(xué)作為疾病潛在生物標(biāo)志物的相關(guān)研究結(jié)果列于表2。相較于腦脊液、尿液等其他體液，血液標(biāo)志物可診斷的疾病類別更加豐富，涵蓋了癌癥[14,28,30-31,43-44,48,51-52,54]、腸炎[44]、呼吸病[45,47]、心血管疾病[46]、神經(jīng)退行性疾病[29]、糖尿病[50]等多種不同類型的疾病[40,49,53]。數(shù)據(jù)依賴采集是目前多肽組序列鑒定的最常用方法，數(shù)據(jù)獨(dú)立采集策略采用的較少，但可能更具優(yōu)勢(shì)[14]。

表2 血液肽作為疾病生物標(biāo)志物的研究與應(yīng)用Table 2 Research and application of blood peptides as biomarkers of diseases

3.2 尿液

尿液是臨床診斷最有用的體液之一[61]，尿多肽組學(xué)可以極大地改善腎臟疾病的診斷與治療[72]。部分尿液肽組學(xué)作為疾病潛在生物標(biāo)志物的相關(guān)研究結(jié)果列于表3。Good等[55]采用CE-MS篩選出273種潛在的慢性腎病生物標(biāo)記物，敏感性和特異性分別為85.5%和100%。Carrick等[33]通過(guò)MALDI-MS分析了95名敗血癥患者的尿液樣本，采用CE-MS鑒定了39種尿肽作為伴隨敗血癥的急性腎損傷生物標(biāo)志物，敏感性和特異性分別為86%和76%，其中部分肽段鑒定為來(lái)自膠原鏈α-1(Ⅰ)(COL1A1)和α-1(Ⅱ)(COL1A2)、α-1-抗胰蛋白酶(SERPINA1)、β-2-微球蛋白(B2M)和纖維蛋白原α鏈(FGA)的片段。di Meo等[58]使用定量無(wú)標(biāo)記LC-MS和靶向平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)，鑒定了9種在腎癌中顯示出明顯升高表達(dá)的內(nèi)源肽，證明了非侵入性內(nèi)源肽作為早期腎癌的潛在診斷和預(yù)后標(biāo)志物的實(shí)用性。

表3 尿液肽作為疾病生物標(biāo)志物的研究Table 3 Research and application of urine peptides as biomarkers of diseases

除了針對(duì)腎相關(guān)疾病的研究外，尿肽標(biāo)志物還應(yīng)用于其他生殖或泌尿類疾病的診斷，如前列腺癌[35,73-74]、膀胱癌[75]、先兆子癇[21,59]等。M’Koma等[35]利用MALDI-TOF分析了407個(gè)尿液樣品，在m/z1 373.1、1 433.5、2 236.3和2 484.6處發(fā)現(xiàn)了一系列能夠區(qū)分前列腺癌和前列腺增生患者的肽段。Kononikhin等[21]通過(guò)HPLC-MS/MS檢測(cè)出包括SERPINA1的C末端片段(MIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK)和白蛋白肽(DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVL)在內(nèi)的35個(gè)先兆子癇尿肽標(biāo)志物。此外，Zhang等[60]利用CE-MS鑒定了96種心力衰竭的潛在生物標(biāo)志物。Wang等[36]利用MALDI-TOF MS確定了5個(gè)重度抑郁癥潛在生物標(biāo)記物，靈敏度和特異性分別為91.7%和84.6%，并鑒定其中4個(gè)肽段為血清白蛋白、AMBP蛋白、HSPG和載脂蛋白A-I(APOA1)的片段。

3.3 唾液

Ao等[38]利用MALDI-TOF找到了3種可用于鑒定低齡嬰幼兒齲的候選唾液肽生物標(biāo)志物1 346.6、2 603.5、3 192.8 u。Chi等[62]在唾液中檢測(cè)到5種口腔鱗狀細(xì)胞癌生物標(biāo)志物MMP1、PADI1、TNC、CSTA和MMP3。Neves等[63]通過(guò)LC-MS/MS證明，唾液中富含脯氨酸的堿性蛋白1的肽片段和蛋白LCN1、MUC7、PON1、C4BPA、ITIH2、AHSG可用于鑒別頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者。Wu等[64]采用MALDI-TOF MS分析6例加速成骨正畸患者的36份唾液標(biāo)本，結(jié)果顯示有182個(gè)峰有顯著性差異。

續(xù)表2

續(xù)表3

綜上，多肽組生物標(biāo)志物是一個(gè)較寬泛的概念，肽段分子質(zhì)量、肽段序列及其歸屬的蛋白質(zhì)都可用于表征。因此，標(biāo)志物的數(shù)量差異較大，并且肽段強(qiáng)度的上調(diào)和下調(diào)都與疾病狀態(tài)相關(guān)。值得注意的是，盡管以肽段分子質(zhì)量為多肽組標(biāo)記物的指標(biāo)被廣泛使用，MALDL-TOF譜圖中的1個(gè)質(zhì)譜峰也可能代表多個(gè)肽段。例如，血清中Apolipoprotein A-Ⅱ的肽段YFVELGTQPATQ分子質(zhì)量為1 352.668 u，而歸屬于Prothrombin的肽段FEKKSLEDKTE分子質(zhì)量為1 352.684 u，Hemoglobin subunit alpha的降解肽段QLSELHCDKLHVD(Gln->pyro-Glu@N-term; Trioxidation(C)@7)和SLDKFLASVSTVLTS分子質(zhì)量分別為1 566.704、1 566.861 u，而同一樣本中Profilin-1的降解肽段NITPAEVGVLVGKDR分子質(zhì)量為1 566.874 u，飛行時(shí)間質(zhì)譜分辨率不足以區(qū)分這些肽段，在尿液和唾液中也有類似現(xiàn)象。因此，用分子質(zhì)量(質(zhì)荷比)表征多肽組得到的信息量不僅少，而且不夠精準(zhǔn)。

4 多肽組分析結(jié)果的不確定性

雖然研究多肽組生物標(biāo)記物的報(bào)道較多，但是真正用于臨床的卻較少，原因之一可能是對(duì)多肽組分析結(jié)果不確定性的認(rèn)識(shí)尚不夠充分。早期研究表明[76]，尿液收集方式與收集時(shí)間等外源性變量因素和尿液pH值、鹽與蛋白質(zhì)的濃度以及血液與細(xì)菌干擾等內(nèi)源性變量因素，均會(huì)顯著影響肽譜分析的結(jié)果。唾液成分也會(huì)受到收集方法和唾液流動(dòng)刺激程度的影響，并且唾液含有來(lái)自宿主和口腔微生物的蛋白水解酶，這些酶會(huì)影響某些標(biāo)志物的穩(wěn)定性，并在收集唾液樣本后持續(xù)降解，導(dǎo)致肽譜的巨大變化，從而限制了肽組學(xué)分析的可重復(fù)性[77]。吳杰等[78]采用MALDI-TOF/TOF技術(shù)研究尿液標(biāo)本的收集儲(chǔ)存方法、凍存條件、反復(fù)凍融次數(shù)等多個(gè)實(shí)驗(yàn)流程中的影響因素，發(fā)現(xiàn)不同性別組間尿液多肽譜未見明顯差異，且5次以內(nèi)有限凍融對(duì)出峰沒有影響。本課題組[79]考察了將唾液樣品分別置于-80 ℃、-20 ℃凍存6個(gè)月后對(duì)唾液多肽組的影響，發(fā)現(xiàn)-20 ℃凍存不僅會(huì)導(dǎo)致樣品中低含量肽段的減少和消失，高含量肽段也會(huì)發(fā)生一系列的進(jìn)一步降解。即使是對(duì)于完全相同的樣本，納升液相色譜-質(zhì)譜分析法的重現(xiàn)性對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也有影響，我們利用納升液相色譜-高分辨質(zhì)譜對(duì)健康人的尿液多肽組進(jìn)行7 次平行分析，發(fā)現(xiàn)多肽組的單次分析結(jié)果具有一定的隨機(jī)性和相對(duì)的穩(wěn)定性。增加平行實(shí)驗(yàn)次數(shù)會(huì)擴(kuò)大多肽組數(shù)據(jù)集，但測(cè)定3次以上后增加幅度減小。相比于肽段，利用降解蛋白質(zhì)為多肽組的生物標(biāo)志物更穩(wěn)健[80]。目前，大多數(shù)多肽組學(xué)研究只用一種搜庫(kù)軟件解析串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，我們使用Peaks studio 8.5(PS)和Protein Pilot Software4.0(PP)兩種軟件分析了10個(gè)隨機(jī)唾液樣本的多肽組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)多肽組的分析結(jié)果與搜庫(kù)方法相關(guān)，某些肽段只能被PS或PP一種軟件鑒定，兩種軟件具有互補(bǔ)性[81]。因此，在樣本的取樣、保存、多肽提取富集、液相色譜-質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫(kù)搜索的各環(huán)節(jié)都可能產(chǎn)生分析結(jié)果的變化，質(zhì)譜靈敏度的增加和肽段分析能力的提高可以更清晰地觀察這些變化。

5 總結(jié)與展望

體液多肽組標(biāo)志物具有廣泛的臨床需求，血液標(biāo)志物應(yīng)用廣泛，尿液多肽組標(biāo)志物多應(yīng)用于腎病相關(guān)疾病，唾液多肽組則較多用于口腔疾病，但是，尿液和唾液中也含有與血液相同或相似的多肽和降解蛋白質(zhì)，同樣參與生理循環(huán)，因此在其他疾病中也具有更廣闊的應(yīng)用前景。值得注意的是，目前對(duì)健康人體液多肽組生理波動(dòng)的研究很少，對(duì)它們的本質(zhì)特征和分布規(guī)律缺少深層次的認(rèn)識(shí)。為使多肽組學(xué)標(biāo)記物真正應(yīng)用于臨床，需規(guī)范和優(yōu)化多肽組分析方法，降低分析結(jié)果的不確定性。加強(qiáng)對(duì)各種不同體液多肽組本質(zhì)特征和規(guī)律的探索，區(qū)分多肽組結(jié)果中的生理變化和病理變化，研究體液多肽組在健康人體內(nèi)的基本組成和波動(dòng)幅度。