生物樣品中醇類代謝物的化學(xué)衍生化質(zhì)譜分析方法研究進(jìn)展

曹宇奇，陸穎潔,2，郭寅龍

(1.中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所，金屬有機(jī)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)交叉科學(xué)研究院，上海 201203 )

生物樣品成分復(fù)雜，包含多種代謝物，如何對(duì)這些痕量級(jí)的代謝物進(jìn)行高選擇性和高靈敏度的分析是很多研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題[1]。質(zhì)譜具有高靈敏度、高通量和較少的樣品前處理等優(yōu)勢(shì)，被越來(lái)越多地用于痕量生物樣品檢測(cè)[2]。在質(zhì)譜分析中，代謝物分子的離子化對(duì)于檢測(cè)效率至關(guān)重要。然而，目前對(duì)于生物樣品中諸多類型的代謝物仍然缺乏合適的離子化方法，導(dǎo)致其質(zhì)譜離子化效率較差，難以進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。

化學(xué)衍生化是通過(guò)特殊設(shè)計(jì)的化學(xué)衍生化試劑與樣本中含有特定官能團(tuán)的目標(biāo)分子發(fā)生衍生化反應(yīng)，對(duì)待測(cè)物質(zhì)的某個(gè)官能團(tuán)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，在保證其骨架結(jié)構(gòu)基本不發(fā)生改變的情況下，使其理化性質(zhì)發(fā)生改變，從而達(dá)到改變目標(biāo)分子質(zhì)譜行為的目的[3]。對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行化學(xué)衍生化一般有以下幾個(gè)目的：1) 提高選擇性和分離度[4-7]；2) 提高電離效率[8-10]；3) 改善目標(biāo)分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)[11-14]；4) 消除內(nèi)源性物質(zhì)的干擾[15]；5) 促進(jìn)同分異構(gòu)體的分辨[16-18]，示于圖1。發(fā)展至今，化學(xué)衍生化已經(jīng)被證明能夠大幅改善質(zhì)譜儀對(duì)特定類型代謝物的檢測(cè)能力。

圖1 目標(biāo)化合物與衍生化試劑的一般反應(yīng)機(jī)理及衍生化方法的優(yōu)點(diǎn)Fig.1 General reaction mechanism between target compound and derivatization reagent, and the advantages of derivatization methods

醇類代謝物主要是指化學(xué)結(jié)構(gòu)中含羥基的內(nèi)源性代謝物，主要包括脂肪醇、甘油酯、類固醇激素、糖類化合物、鞘氨醇、酚類等，廣泛存在于各種生物樣本中。這些醇類代謝物有較高的生理學(xué)活性，在生物體中承擔(dān)著各種不同的生物學(xué)功能。例如，體內(nèi)的脂肪醇主要來(lái)源于脂肪酸的還原代謝，脂肪醇、脂肪醛和脂肪酸的相互轉(zhuǎn)化構(gòu)成重要的代謝循環(huán)[19-20]。諸多疾病的發(fā)生發(fā)展與脂肪醇的代謝異常存在聯(lián)系。例如，在醫(yī)學(xué)上存在一些先天性的脂肪醇代謝障礙病例，如Sj?gren-Larsson綜合征(脂肪醇到脂肪酸的代謝過(guò)程缺失)[21]、Zellweger Syndrome肝腦綜合征[22]。這些疾病主要是與脂肪醇代謝相關(guān)的基因缺陷所導(dǎo)致的遺傳性疾病[23]。另外，有研究表明，脂肪醇在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中的代謝水平存在差異，如MCF-7乳腺癌細(xì)胞中的脂肪醇水平比普通乳腺細(xì)胞高4倍，這為脂肪醇類物質(zhì)發(fā)展為腫瘤生物標(biāo)志物提供了有力依據(jù)[24]。

除脂肪醇外，甾醇和甘油酯類代謝物也有較強(qiáng)的生理學(xué)研究意義。甾醇主要包含脂肪醇和類固醇激素[25-27]。膽固醇是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最豐富的甾醇，在細(xì)胞膜的構(gòu)成和激素的生物合成過(guò)程中扮演著重要角色[26, 28-29]。體內(nèi)的膽固醇含量變化與阿爾茲海默癥、冠心病等多種疾病存在關(guān)聯(lián)。類固醇激素具有極重要的醫(yī)藥價(jià)值，其在生命維持、性功能調(diào)節(jié)以及免疫調(diào)控的生理學(xué)作用已被多項(xiàng)研究結(jié)果所支持。甘油酯類物質(zhì)在生物樣品中占比較大，但目前研究較少[30]。甘油三酯是體內(nèi)含量最大的甘油酯類代謝物，其通過(guò)酶降解生成甘油二酯和甘油一酯[31-32]。大量研究表明，甘油二酯在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中扮演著第二信使的角色[33]。甘油一酯被認(rèn)為是一類重要的細(xì)胞信號(hào)分子[34]。

雖然醇類代謝物具有較高的生理學(xué)和藥理學(xué)價(jià)值，但其在各種生物樣品中的存在形式、存在種類以及含量水平等相關(guān)研究相對(duì)匱乏。相比其他類型代謝物，如醛類[35-36]、胺類[37-38]以及羧酸類[39-40]等，目前能夠靈敏且高通量地定性和定量分析醇類代謝物的質(zhì)譜方法仍然較少，嚴(yán)重阻礙了深入研究相關(guān)醇類代謝物在生物體內(nèi)承擔(dān)各項(xiàng)功能以及其代謝異常產(chǎn)生的生物學(xué)影響。在質(zhì)譜中直接對(duì)生物樣品中的醇類代謝物進(jìn)行檢測(cè)面臨較低的離子化效率和較高的背景基質(zhì)干擾2大困難。醇類代謝物一般趨于中性，質(zhì)子親和能較高，在常用的質(zhì)譜離子源(如電噴霧離子源(ESI)以及基質(zhì)輔助激光解吸附離子源(MALDI))中難以獲得較好的離子化效率。另外，多種醇類代謝物(如脂肪醇和類固醇類激素)在生物樣品中的含量極低，其質(zhì)譜信號(hào)很容易被樣品中其他類型的高豐度代謝物所掩蓋。

綜上，對(duì)醇類代謝物進(jìn)行化學(xué)衍生化后，再進(jìn)行質(zhì)譜分析檢測(cè)是一種新選擇。相比于氨基、羧基和羰基等，醇類代謝物共有的羥基基團(tuán)化學(xué)活性并不突出，因此，樣品中部分低豐度的醇類代謝物對(duì)衍生化試劑的反應(yīng)效率提出了較高要求。這些問(wèn)題給醇類代謝物的衍生化試劑的設(shè)計(jì)增加了許多挑戰(zhàn)。在科研工作者的不懈努力下，一系列性能優(yōu)異的羥基衍生化試劑相繼被報(bào)道，如硅烷化反應(yīng)試劑[41-43]、酰氯/磺酰氯試劑[9, 44-49]，酸酐試劑[50]、N-烷基吡啶季銨化試劑[25, 51-56]、Py+試劑[57-60]等。這些試劑均有其各自的特點(diǎn)，并且已經(jīng)應(yīng)用于各種醇類代謝物的定性和定量分析中。從質(zhì)譜儀器角度，針對(duì)GC-MS、LC-MS/MS、MALDI-MS等開(kāi)發(fā)了不同的衍生化試劑和相應(yīng)的質(zhì)譜分析方法，以滿足不同生物樣品中醇類代謝物的檢測(cè)分析需求。近年來(lái)，敞開(kāi)式質(zhì)譜離子源因其高通量、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)得以快速發(fā)展，并應(yīng)用于多種內(nèi)源性代謝物的檢測(cè)分析。質(zhì)譜成像技術(shù)可以給出生物組織樣品表面內(nèi)源性代謝物的準(zhǔn)確分布信息，引起了研究人員的廣泛興趣。開(kāi)發(fā)能夠在組織原位對(duì)醇類代謝物進(jìn)行衍生化的衍生化試劑已成為一個(gè)新興的研究領(lǐng)域。

本綜述將主要介紹近期報(bào)道的各種醇類代謝物的化學(xué)衍生化試劑，詳盡描述各類型試劑的優(yōu)點(diǎn)和缺陷。另外，討論這些衍生化試劑的應(yīng)用價(jià)值及其發(fā)展趨勢(shì)，希望給醇類代謝物的質(zhì)譜分析方法開(kāi)發(fā)、醇類代謝組學(xué)研究提供幫助。

1 醇類物質(zhì)衍生化試劑

1.1 硅烷化試劑[41-43]

硅烷化試劑是較早被開(kāi)發(fā)應(yīng)用于醇類代謝物質(zhì)譜分析的衍生化試劑，該類試劑已經(jīng)成為使用GC-MS對(duì)醇類代謝物進(jìn)行定性定量分析的主要手段。一般來(lái)說(shuō)，醇類代謝物(如甾醇和糖類)本身(未被衍生化)在GC-MS中有一定的質(zhì)譜信號(hào)，然而，大多極性較低且沸點(diǎn)較高，使其較難汽化并且難以在氣相色譜中分離，這使得帶有較強(qiáng)背景信號(hào)干擾的生物樣品中醇類代謝物的分析工作難以開(kāi)展。在硅烷衍生化反應(yīng)中，硅烷化試劑通過(guò)靶向羥基的α-C發(fā)生Sn2型親核取代反應(yīng)，將硅烷基團(tuán)加載至代謝物化學(xué)結(jié)構(gòu)中，衍生化產(chǎn)物在GC-MS中的色譜分離行為和質(zhì)譜信號(hào)均得到顯著改善。另外，硅烷化反應(yīng)一般不需要復(fù)雜的反應(yīng)后處理和純化步驟，可以直接注射到氣相色譜。目前，常用的醇類代謝物硅烷化試劑包括N-甲基三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTFA)，N,O-雙-(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)和N-(叔丁二甲基硅基)-N-甲基三氟乙酰酰胺(MTBSTFA)，結(jié)構(gòu)示于圖2。

注：a.MSTFA;b.BSTFA;c.MTBSTFA圖2 常用的3種硅烷化試劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.2 Chemical structures of the commonly used silylation reagents

1.2 N-烷基吡啶季銨化(NAPQ)試劑[25,51-52,55-56]

本課題組提出了N-烷基吡啶季銨化試劑，并應(yīng)用于脂肪醇和甾醇的衍生化。與大多數(shù)季胺化衍生化試劑不同，該衍生化試劑使用無(wú)季胺基團(tuán)的吡啶試劑，通過(guò)季胺化反應(yīng)將季胺基團(tuán)引入醇類代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)中。在整個(gè)衍生化反應(yīng)過(guò)程中，衍生化試劑和反應(yīng)代謝物均不帶電荷，僅最終生成的衍生化產(chǎn)物帶有電荷。過(guò)量的衍生化試劑吡啶由于其離子化效率與衍生化產(chǎn)物相差懸殊，不會(huì)對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)過(guò)程造成嚴(yán)重干擾，從而解決了許多季胺化試劑在衍生化完成后過(guò)量試劑對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)形成干擾這一問(wèn)題。同時(shí)，吡啶的穩(wěn)定同位素試劑氘代吡啶易于獲取，在衍生化實(shí)驗(yàn)中使用d0/d5-吡啶作為一對(duì)同位素標(biāo)記的衍生化試劑，可以為衍生化產(chǎn)物的鑒別和定量工作帶來(lái)便利。N-烷基吡啶季銨化反應(yīng)的化學(xué)方程式示于圖3。

圖3 N-烷基吡啶季銨化反應(yīng)方程式Fig.3 Chemical equation of N-alkylpyridinium quaternization

季胺化后的醇類代謝物極性大幅上升，且本身含有電荷，在ESI和MALDI離子源中都有較好的質(zhì)譜響應(yīng)。該衍生化反應(yīng)快速、簡(jiǎn)便且衍生化試劑成本低廉，本課題組進(jìn)一步將其應(yīng)用于醇類代謝物的LC-MS、MALDI-MS以及敞開(kāi)式質(zhì)譜，拓寬了該衍生化反應(yīng)的適用領(lǐng)域。具體應(yīng)用將在后續(xù)章節(jié)詳細(xì)介紹。

1.3 N-烷基吡啶氯季銨化(NCAPQ)試劑[53-54]

本課題組在N-烷基吡啶季銨化試劑的基礎(chǔ)上，針對(duì)脂肪醇和脂肪醛的檢測(cè)開(kāi)發(fā)了N-烷基吡啶氯季銨化試劑。該試劑將三氟甲磺酸酐替換成氯化亞砜，在乙腈為溶劑的體系下，對(duì)脂肪醛檢測(cè)的專一性較好，并生成脂肪醛的氯季銨化產(chǎn)物，由于天然同位素35Cl、37Cl的存在會(huì)使質(zhì)譜圖上出現(xiàn)質(zhì)量數(shù)相差2 u的同位素峰對(duì)，便于衍生化產(chǎn)物的辨別。在二氯甲烷為溶劑的體系下，可用于同時(shí)檢測(cè)脂肪醛和脂肪醇。此外，氯化亞砜是質(zhì)子敏感型試劑，可與去離子水反應(yīng)轉(zhuǎn)化為鹽酸和二氧化硫氣體，能夠通過(guò)氣體分離的方法從溶液體系中去除。與NAPQ試劑相同，NCAPQ試劑也不帶電荷，衍生化產(chǎn)物的電荷中心通過(guò)衍生化反應(yīng)生成，所以過(guò)量的衍生化試劑不會(huì)影響后續(xù)的檢測(cè)工作。N-烷基吡啶氯季銨化反應(yīng)的化學(xué)方程式示于圖4。

圖4 N-烷基吡啶氯季銨化反應(yīng)方程式Fig.4 Chemical equation of N-(1-Chloroalkyl)pyridinium quaternization

在NCAPQ衍生化試劑應(yīng)用方面，除了與傳統(tǒng)的LC-MS聯(lián)用外，本課題組還將其與離子淌度質(zhì)譜相結(jié)合，獲得多一維的漂移時(shí)間數(shù)據(jù)，可以對(duì)生物樣本中的化合物進(jìn)行更快速的鑒別。

1.4 ?；磻?yīng)試劑(酰氯，酸酐，羧酸)[9,44-49]

酰基化反應(yīng)試劑包含多種廣泛應(yīng)用的醇類代謝物化學(xué)衍生化試劑，其主要利用羥基與酰氯或酸酐發(fā)生酯化反應(yīng)，將衍生化試劑分子加入醇類代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)中。為了使衍生化產(chǎn)物的質(zhì)譜信號(hào)顯著增強(qiáng)，一般會(huì)在衍生化試劑分子骨架中加入季胺基團(tuán)。得益于羧酸、酰氯或酸酐配合酯化反應(yīng)縮合劑的高反應(yīng)活性，這類衍生化試劑對(duì)醇類代謝物的整體衍生化效率尚可。然而，正是由于其高反應(yīng)活性，該類試劑的化學(xué)選擇性較差，易與生物樣品中含量較多的胺類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，且反應(yīng)過(guò)程激烈，副反應(yīng)較多。同時(shí)，酰氯或酸酐類試劑對(duì)水十分敏感，存儲(chǔ)要求較高。另外，由于許多衍生化試劑骨架中含有帶電荷的季胺基團(tuán)，反應(yīng)后過(guò)量的衍生化試劑會(huì)對(duì)醇類代謝物的衍生化產(chǎn)物質(zhì)譜檢測(cè)造成干擾，需要通過(guò)特殊設(shè)計(jì)的反應(yīng)后處理流程加以改進(jìn)。

目前，常用的?；磻?yīng)試劑主要包括用于GC-MS的五氟苯甲酰氯，用于LC-MS的N-氯化甜菜堿酰氯(N-chlorobetainyl chloride)、N,N-二甲基甘氨酸(DMG)等，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式示于圖5。

1.5 Py+試劑[57-60]

2-氟-1-甲基吡啶鎓 (FMP) 對(duì)甲苯磺酸試劑可與伯醇、仲醇以及酚羥基反應(yīng)形成烷基 1-甲基吡啶鎓醚離子，示于圖6。由于其帶有正電荷，因此非常適合使用ESI和MALDI離子源進(jìn)行檢測(cè)分析。該試劑的反應(yīng)原理是一個(gè)簡(jiǎn)單的親和取代反應(yīng)，在室溫下即可進(jìn)行。在衍生化產(chǎn)物的二級(jí)質(zhì)譜中可以觀察到特征性的m/z110、m/z[M-109]、m/z[M-111]峰，便于衍生化產(chǎn)物的辨識(shí)和歸納。

注：a.五氟苯甲酰氯;b.N-氯化甜菜堿酰氯;c.N,N-二甲基甘氨酸圖5 常用的3種?；噭┑幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)Fig.5 Chemical structures of the commonly used acylation reagents

圖6 2-氟-1-甲基吡啶鎓甲苯磺酸試劑反應(yīng)方程式Fig.6 Chemical equation of 2-fluoro-1-methylpyridinium tosylate

目前，該試劑已廣泛應(yīng)用于表面活性劑、雌激素、丁丙諾啡、聚酰胺和甾醇的檢測(cè)，并已拓展到質(zhì)譜成像領(lǐng)域，對(duì)含酚羥基類目標(biāo)化合物進(jìn)行可視化分析，以揭示其在生物樣本中的空間分布。

1.6 硼酸類試劑[61-62]

人體內(nèi)存在一些特殊結(jié)構(gòu)的醇類代謝物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中存在相鄰的羥基基團(tuán)(如雙酚或頻哪醇)，比較典型的包括唾液酸、糖類、兒茶酚胺和甘油一酯。針對(duì)這類代謝物的化學(xué)衍生化可以采用特殊設(shè)計(jì)的硼酸類試劑。常用的硼酸類衍生化試劑在苯硼酸骨架上修飾質(zhì)譜行為較好的叔胺或季胺基團(tuán)后，通過(guò)硼酸與多元醇發(fā)生快速縮合反應(yīng)完成衍生化。該類衍生化反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)速度快，效率較高，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多元醇的定性定量分析以及質(zhì)譜成像中。硼酸類試劑與多元醇的衍生化反應(yīng)示于圖7。

圖7 硼酸類試劑衍生化反應(yīng)示例Fig.7 Illustration of the derivatization reaction of boronic acid with biological molecules containing polyhydroxyl motifs

2 醇類代謝物化學(xué)衍生化試劑在質(zhì)譜中的應(yīng)用

2.1 氣相色譜-質(zhì)譜法

直接使用GC-MS分析醇類物質(zhì)面臨難以汽化、背景干擾較大等問(wèn)題，研究人員開(kāi)發(fā)了一系列硅烷化試劑和?；噭﹣?lái)提高檢測(cè)靈敏度。

2009年，Richard課題組使用硅烷化試劑BSTFA、MSTFA對(duì)甾醇類代謝物進(jìn)行衍生化[42]，選用了13種常見(jiàn)的甾醇類物質(zhì)，包括一些類固醇激素，采用微波技術(shù)對(duì)衍生化反應(yīng)進(jìn)行加速。通過(guò)對(duì)不同試劑的各微波反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化調(diào)節(jié)，最終選定MSTFA作為衍生化試劑。在小于1 min的反應(yīng)后，達(dá)到與傳統(tǒng)加熱法30 min相同的衍生化效果。

2011年，David課題組使用一種全氟?；噭┪甯１郊柞Ｂ?PFBoylCl)對(duì)脂肪醇類物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)衍生化，然后使用GC-MS進(jìn)行分析[43]，衍生化反應(yīng)的方程式示于圖8。這項(xiàng)研究從3個(gè)方面對(duì)整個(gè)衍生化反應(yīng)流程進(jìn)行了改進(jìn)。首先，優(yōu)化了各醇類物質(zhì)的衍生化反應(yīng)時(shí)間和溫度；然后使用微波技術(shù)作為另一種加熱方式加速衍生化反應(yīng)；最后，嘗試增加一個(gè)衍生化反應(yīng)后處理步驟，通過(guò)溶劑提取消除過(guò)量的衍生化試劑對(duì)后續(xù)衍生化產(chǎn)物檢測(cè)分析的不利影響。最終確定的最優(yōu)條件為60 ℃加熱45 min。另外，微波技術(shù)可以顯著加快反應(yīng)速度，減少衍生化反應(yīng)時(shí)間至3 min。通過(guò)比較幾種用于反應(yīng)后處理提取的溶劑，最終選定二氯甲烷作為最優(yōu)的提取溶劑來(lái)提取衍生化產(chǎn)物，現(xiàn)已成功地將這一衍生化方法應(yīng)用于提取的小鼠血清中脂肪醇和膽固醇的分析。

圖8 PFBoylCl衍生化反應(yīng)方程式Fig.8 Chemical derivatization equation of PFBoylCl

2.2 電噴霧離子源-質(zhì)譜法

2.2.1常規(guī)衍生化ESI-MS/MS分析 通過(guò)化學(xué)衍生化可以在醇類代謝物分子骨架中加入有利于ESI離子化的基團(tuán)，大幅提高衍生化產(chǎn)物的離子化效率。同時(shí)，很多醇類代謝物缺乏特征性的碎裂基團(tuán)，在MS/MS質(zhì)譜中難以找到較穩(wěn)定的碎片離子。通過(guò)化學(xué)衍生化連上經(jīng)過(guò)特殊設(shè)計(jì)的化學(xué)基團(tuán)，可以顯著改善其在MS/MS中的質(zhì)譜行為，輔助找到多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)定量離子對(duì)，為使用LC-ESI-MS/MS分析醇類代謝物提供幫助。

2001年，Gary課題組報(bào)道了使用2-氟-1-甲基吡啶鎓對(duì)甲苯磺酸試劑(Py+試劑)對(duì)一級(jí)和二級(jí)醇酚進(jìn)行衍生化后ESI-MS分析[58-59]。Py+試劑中2位的F原子很容易被羥基取代，從而將醇類物質(zhì)加載到吡啶鎓骨架中，該衍生化方法已應(yīng)用于辣椒油和玫瑰精油中一級(jí)、二級(jí)醇的檢測(cè)，同時(shí)用于丁香油中酚類物質(zhì)的檢測(cè)。衍生化產(chǎn)物無(wú)需清洗等后處理操作，直接使用ESI-MS/MS即可得到較好的分析結(jié)果，同時(shí)MS/MS中前體離子和中性丟失也確證了該方法的可靠性。該衍生化方法快速靈敏、選擇性強(qiáng)，不足之處在于無(wú)法對(duì)三級(jí)醇進(jìn)行衍生化分析。2008年，Mario課題組將這一衍生化方法應(yīng)用于一種精神活性物質(zhì)丁丙諾啡的檢測(cè)分析中。丁丙諾啡是一種合成的嗎啡類似物，具有很強(qiáng)的鎮(zhèn)痛效果，但因?yàn)E用受到了廣泛關(guān)注。使用LC-MS/MS分析丁丙諾菲缺乏合適的前體離子，但因其分子結(jié)構(gòu)中存在1個(gè)游離的酚羥基，Py+試劑可以快速對(duì)其進(jìn)行衍生得到帶電荷的衍生化產(chǎn)物離子(m/z559)，并在MS/MS中生成診斷離子m/z443、450。

酰基化試劑在衍生化ESI-MS/MS分析領(lǐng)域的研究中同樣活躍。2012年，Saussereau課題組開(kāi)發(fā)了一種磺酰氯衍生化試劑，用于對(duì)納升級(jí)血液樣本中大麻酚類物質(zhì)進(jìn)行快速的LC-MS/MS分析[45]。大麻類代謝物極性較低，缺乏易于離子化的化學(xué)基團(tuán)，在ESI源中離子化效率較差。研究人員利用天然大麻類物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中存在的酚羥基與磺酰氯試劑發(fā)生反應(yīng)，成功地對(duì)納升級(jí)血液樣品中的5種大麻酚類物質(zhì)進(jìn)行快速靈敏的LC-MS/MS定量分析，反應(yīng)方程式示于圖9。經(jīng)過(guò)條件優(yōu)化后，最終可在8 min內(nèi)完成1個(gè)樣品的LC-MS分析，5種大麻酚類物質(zhì)的最低定量限(LOQ)為0.25～0.8 μg/L。

圖9 磺酰氯與大麻四氫酚(THC)衍生化反應(yīng)方程式Fig.9 Chemical equation of sulfonyl chloride with THC

2.2.2穩(wěn)定化學(xué)同位素標(biāo)記的LC-ESI-MS/MS靶向與非靶向分析 常規(guī)的LC-MS/MS分析靈敏度高、特異性好，廣泛應(yīng)用于代謝物的定量分析。定量分析方法一般分為外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法。外標(biāo)法定量分析的操作相對(duì)簡(jiǎn)單，但其結(jié)果受儀器影響波動(dòng)較大，而使用內(nèi)標(biāo)法在樣品中加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行輔助定量分析可以解決這一問(wèn)題。因此，選擇合適的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)十分重要，內(nèi)標(biāo)物選擇不當(dāng)會(huì)影響內(nèi)標(biāo)法定量的準(zhǔn)確性。一般來(lái)說(shuō)，同位素內(nèi)標(biāo)是最合適的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，但很多類型的代謝物同位素內(nèi)標(biāo)難以合成，十分昂貴。常規(guī)的LC-MS/MS主要是基于一種靶向的分析手段，即預(yù)先知道需要檢測(cè)的代謝物，然后針對(duì)性的進(jìn)行定性定量分析。目前代謝組學(xué)要求從大量復(fù)雜的生物樣品中非靶向地掃描感興趣的目標(biāo)代謝物。為了解決這些問(wèn)題，穩(wěn)定化學(xué)同位素標(biāo)記的衍生化試劑提供了一種很好的選擇，已成為代謝組脂質(zhì)組研究的前沿領(lǐng)域。穩(wěn)定化學(xué)同位素標(biāo)記技術(shù)即將衍生化試劑中部分原子使用其穩(wěn)定同位素標(biāo)記替換，與原衍生化試劑按照一定的比例混合進(jìn)行衍生化過(guò)程。

2014年，本課題組使用開(kāi)發(fā)的N-烷基吡啶季銨化試劑結(jié)合LC-ESI-MS/MS定量分析甲狀腺組織中的脂肪醇[52]，具體分析流程示于圖10。研究人員使用1對(duì)d0/d5-吡啶輕/重同位素試劑進(jìn)行衍生化實(shí)驗(yàn)，使用d0-吡啶進(jìn)行衍生化實(shí)際樣品，選用一系列脂肪醇標(biāo)準(zhǔn)品與d5-吡啶反應(yīng)作為穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)，將兩者混合送入LC-ESI-MS/MS分析。通過(guò)計(jì)算每種脂肪醇對(duì)應(yīng)的輕/重同位素衍生化產(chǎn)物質(zhì)譜信號(hào)比值，即可得出相應(yīng)的脂肪醇在甲狀腺組織中的含量水平。該方法快速靈敏、線性范圍寬，對(duì)各脂肪醇的最低檢測(cè)限在0.1 μg/L～0.25 ng/L之間，將該方法應(yīng)用于人正常甲狀腺組織和甲狀腺腫瘤組織中脂肪醇的定量分析比較，結(jié)果表明，多種脂肪醇的含量水平存在顯著性差異。

圖10 N-烷基吡啶季胺化反應(yīng)定量分析甲狀腺組織中脂肪醇的流程圖Fig.10 N-alkylpyridinium quaternization reaction for quantitative analysis of fatty alcohols in thyroid tissues

2016年，加拿大阿爾伯塔大學(xué)的Li Liang課題組開(kāi)發(fā)了一種C同位素標(biāo)記的磺酰氯試劑對(duì)醇類代謝物進(jìn)行廣譜非靶向的定量分析[47]。該方法同樣使用了一對(duì)輕/重同位素標(biāo)記衍生化試劑，即使用12C/13C標(biāo)記的1對(duì)衍生化試劑，具體分析流程示于圖11。使用輕標(biāo)同位素試劑對(duì)樣品衍生化，在衍生化反應(yīng)完成后，首先經(jīng)過(guò)一個(gè)液-液萃取過(guò)程，使用LC-UV對(duì)樣品中衍生化的醇類代謝物總含量進(jìn)行粗略的定量分析。接下來(lái)，根據(jù)得到的總含量信息向樣品中加入一定量的使用重標(biāo)衍生化試劑標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)品池，用于醇類代謝物的非靶向分析和相對(duì)定量分析。然后，將該混合物注入LC-MS，根據(jù)得到的輕重衍生化產(chǎn)物離子對(duì)信息和信號(hào)強(qiáng)度比，即可對(duì)生物樣品中的醇類代謝物進(jìn)行大規(guī)模的定量代謝組學(xué)分析。研究人員將該方法應(yīng)用于人類尿液樣品的分析中，結(jié)合HMDB等代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，鑒定出2 304個(gè)離子對(duì)對(duì)應(yīng)的代謝物信息，并對(duì)其中的20個(gè)代謝物使用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行相對(duì)定量分析。

圖11 12C/13C磺酰氯試劑對(duì)醇類代謝物進(jìn)行定量代謝組學(xué)分析的流程圖Fig.11 Workflow of 12C/13C sulfonyl chloride reagent for the quantitative metabolomics of alcohols

2.2.3電噴霧離子源結(jié)合離子淌度質(zhì)譜(ESI-IM-MS)相對(duì)定量分析 離子淌度譜(IMS)是近年來(lái)新興的一種物質(zhì)分離手段，可以基于氣相中電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)離子在幾百毫秒內(nèi)對(duì)多種不同類型的分子進(jìn)行分離，目前已用于復(fù)雜生物樣品中多種代謝物的快速鑒定。

2020年，本課題組使用一種N-烷基氯季銨化試劑結(jié)合ESI-IM-MS同時(shí)對(duì)甲狀腺組織中的脂肪醇、脂肪醛和甾醇類代謝物進(jìn)行分析[54]。這項(xiàng)工作將穩(wěn)定同位素衍生化試劑標(biāo)記技術(shù)與離子淌度質(zhì)譜有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，具體的實(shí)驗(yàn)流程示于圖12?？梢?jiàn)，N-烷基氯季銨化試劑是一種多功能衍生化試劑，可以同時(shí)對(duì)羥基和羰基進(jìn)行衍生化反應(yīng)。在這項(xiàng)工作中，通過(guò)輕/重同位素衍生化試劑標(biāo)記技術(shù)，用輕標(biāo)試劑標(biāo)記正常甲狀腺組織，用重標(biāo)試劑標(biāo)記甲狀腺腫瘤組織，可以對(duì)正常組織和腫瘤組織中的脂肪醇、脂肪醛和甾醇進(jìn)行相關(guān)性分析。另外，使用IM-MS進(jìn)行分離，增加一維分離度，可以最大限度地消除雜質(zhì)信號(hào)，提高方法的可靠性，示于圖13。

圖12 N-烷基氯季銨化反應(yīng)結(jié)合IM-MS同時(shí)分析脂肪醇，脂肪醛和甾醇Fig.12 N-(1-Chloroalkyl)pyridinium quaternization combined with IM-MS for simultaneous analysis of fatty alcohol, fatty aldehyde and sterol

圖13 NCAPQ反應(yīng)衍生化產(chǎn)物淌度分離圖Fig.13 IM paragraph of the derivatized metabolites after NCAPQ reaction

2.3 基質(zhì)輔助激光解吸附離子源-質(zhì)譜法

色譜分離技術(shù)需要將被分析的樣品進(jìn)行提取純化等前處理步驟，較為繁瑣，且當(dāng)被分析對(duì)象為生物樣本時(shí)，可能面臨著樣品量少而不易提取等問(wèn)題，因此，基于MALDI的檢測(cè)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。然而，一般的醇類代謝物是中性分子，在MALDI 中的電離效率并不理想，近年來(lái)，研究者們開(kāi)發(fā)了許多基于MALDI對(duì)醇類化合物的衍生化試劑。

2.3.1衍生化MALDI-MS定性和定量分析

注：a.正常人毛發(fā)；b.吸毒人員毛發(fā)；c.正常組和吸毒組毛發(fā)樣本經(jīng)NAPQ反應(yīng)后所測(cè)得脂肪醇含量的比較；○表示d0/d5-PD-16:1;●表示d0/d5-PD-16:0;△表示d0/d5-PD-17:0;▲表示d0/d5-PD-18:2;□表示d0/d5-PD-18:1;★表示d0/d5-PD-18:0;▽表示d0/d5-PD-19:0;■表示d0/d5-PD-20:1;☆表示d0/d5-PD-20:0;◇表示d0/d5-PD-21:0;▼表示d0/d5-PD-22:1;◆表示d0/d5-PD-22:0;◎表示d0/d5-PD-23:0;◢表示d0/d5-PD-24:1;◥表示d0/d5-PD-24:0圖14 正常人和吸毒人員毛發(fā)內(nèi)脂肪醇的定性定量檢測(cè)Fig.14 Qualitative and quantitative detection of fatty alcohols from the hair of normal and drug addicts

本課題組將NAPQ衍生化試劑與基質(zhì)輔助激光解吸離子化-傅里葉變換質(zhì)譜(MALDI-FTMS)相結(jié)合，用于生物樣本毛發(fā)中脂肪醇和膽固醇的定性和定量分析，以及尿液樣本中醇類和α，β-不飽和酮的類固醇激素的定性分析[55-56]。鑒于FTMS高質(zhì)量分辨率、高準(zhǔn)確度、高靈敏度等特點(diǎn)，利于待測(cè)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)解析，另外，MALDI的前處理步驟較簡(jiǎn)便，無(wú)需樣品純化和色譜分離等操作，可滿足高通量直接檢測(cè)的需求，因此，MALDI-FTMS非常適用于復(fù)雜生物樣本中代謝物的檢測(cè)。由于在NAPQ試劑中使用了吡啶和氘代吡啶這1對(duì)同位素試劑，因此可以通過(guò)比較衍生化產(chǎn)物的d0/d5峰進(jìn)行相對(duì)定量分析。本課題組使用該方法成功對(duì)正常人和吸毒人員毛發(fā)中的脂肪醇進(jìn)行定量分析，揭示了吸毒人員毛發(fā)內(nèi)脂肪醇含量的降低，為司法鑒定提供了有力的技術(shù)支持，示于圖14。此外，運(yùn)用MALDI-FTMS結(jié)合NAPQ試劑對(duì)正常人尿液樣本中類固醇激素進(jìn)行定性分析，顯示出比傳統(tǒng)Girard-T更高的靈敏度，為尿液樣本分析開(kāi)拓了新方法。

除NAPQ試劑外，Anthony等[63]使用甲硅烷基化試劑三甲基甲硅烷基咪唑選擇性衍生化碳水化合物中的游離羥基，衍生化產(chǎn)物在質(zhì)譜圖上的質(zhì)荷比相差72 u，這是由于羥基的氫原子被三甲基甲硅烷基取代的結(jié)果，這一現(xiàn)象便于在質(zhì)譜圖中識(shí)別衍生化產(chǎn)物。此后，該課題組又使用醋酸乙烯酯選擇性地衍生化碳水化合物中的羥基，運(yùn)用MALDI-TOF MS分析O-乙酰化產(chǎn)物，由于1個(gè)羥基中的氫原子被乙酰基取代，質(zhì)譜顯示出連續(xù)的相差42 u的離子峰，目前該方法已經(jīng)用于分析多糖和多元醇的單組分和多組分混合物[64]。Vladimir等[65]使用N,O-雙(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺和辛酰氯對(duì)聚乙二醇和聚1,2-丙二醇的端基羥基進(jìn)行衍生化，證實(shí)了三甲氧基甲硅烷基化和?；诖_定活性氧基團(tuán)如(—OH)數(shù)量以及聚合物結(jié)構(gòu)解析方面的能力。Zhilyaev等[66]在叔胺存在下用溴甲基氯二甲基硅烷對(duì)脂肪醇、萜醇和甾醇進(jìn)行硅烷基化，以產(chǎn)生含有固定電荷的衍生化產(chǎn)物，便于MALDI分析。Ostah等[67]將異氰酸苯酯用于選擇性靶向聚醚多元醇中存在的羥基，以確定活性羥基的數(shù)量。Borisov等[68]提出了一種將薄層色譜法和 MALDI 質(zhì)譜法相結(jié)合的色譜后衍生化方法，用于分析醇類和酚類混合物。在過(guò)量堿(吡啶或三乙胺)存在下，用 3-溴丙酰氯處理薄層色譜圖上的洗脫區(qū)，從而完成分析物的化學(xué)改性。生成的衍生物包含具有恒定電荷的殘留物(銨片段)，確保在 MALDI 期間衍生化分析物從吸附劑層有效解吸。

2.3.2MALDI-質(zhì)譜成像 質(zhì)譜成像作為近幾年新興的成像技術(shù)，憑借其無(wú)需標(biāo)記、高靈敏度、高通量等優(yōu)勢(shì)提供各種體內(nèi)代謝物在組織內(nèi)的空間分布，受到研究人員的青睞。MALDI質(zhì)譜成像由于技術(shù)相對(duì)成熟、兼具高靈敏度和高空間分辨率，是使用最廣泛的質(zhì)譜成像技術(shù)之一。但是，對(duì)于MALDI離子源來(lái)說(shuō)，其對(duì)含有—OH的中性分子離子化效率較差，因此，開(kāi)發(fā)適合的衍生化試劑對(duì)生物樣本內(nèi)的代謝物進(jìn)行可視化分析極為重要。合適的組織上衍生化試劑與直接在樣品管內(nèi)與生物樣本反應(yīng)的普通衍生化試劑不同，組織上衍生化試劑需要能與生物樣本切片中的目標(biāo)分子發(fā)生即時(shí)的原位反應(yīng)，反應(yīng)后生成衍生化產(chǎn)物的分子質(zhì)量最好能避開(kāi)基質(zhì)分子的出峰區(qū)間，且衍生化產(chǎn)物需要比較穩(wěn)定、易與基質(zhì)形成結(jié)晶便于后續(xù)的激光解吸與電離。此外，最佳結(jié)晶的大小需控制在20～50 μm之間，為質(zhì)譜成像提供更好的空間分辨率。

2011年，Caprioli課題組使用1,1′-硫代羰基二咪唑成功地對(duì)小鼠腎臟組織內(nèi)3-甲氧基水楊胺的空間分布進(jìn)行可視化研究[69]。Bassindale等[57]運(yùn)用Py+試劑實(shí)現(xiàn)了單根頭發(fā)內(nèi)Δ9-四氫大麻酚、大麻二酚、大麻酚以及其在體內(nèi)代謝物四氫大麻酚酸，11-羥基-Δ9-四氫大麻酚和四氫大麻酚葡糖苷酸等大麻素類化合物的MLADI質(zhì)譜成像，示于圖15。Shariatgorji等[70]開(kāi)發(fā)了氟甲基吡啶鎓-8、-9和-10作為衍生化反應(yīng)的基質(zhì)試劑，對(duì)含有酚羥基的多巴胺能和血清素能系統(tǒng)的幾種神經(jīng)遞質(zhì)(包括其代謝物)進(jìn)行成像檢測(cè)，并將該策略應(yīng)用于帕金森病大鼠和靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型，以及人類帕金森病大腦的組織切片模型中。除了以上2種試劑外，Lee等[71]運(yùn)用4-(二甲氨基)苯基硼酸(DBA)帶有叔胺基團(tuán)的硼酸衍生化試劑對(duì)玉米莖、根和葉中的鄰二醇代謝物進(jìn)行衍生化成像，成功檢測(cè)出10種鄰二醇代謝物，并顯著提高了其在MALDI中的響應(yīng)，示于圖16。

圖15 單根頭發(fā)中大麻類化合物的衍生化成像Fig.15 Derivative imaging of cannabis compounds in a single hair

圖16 玉米葉中鄰二醇代謝物的光學(xué)圖像和質(zhì)譜圖像Fig.16 Optical image and mass spectrometry image of the metabolites of diols in corn leaves

2.4 衍生化直接質(zhì)譜分析

20世紀(jì)初，隨著解吸電噴霧離子源(DESI)和實(shí)時(shí)直接分析離子源(DART)的開(kāi)發(fā)，給質(zhì)譜研究注入了新的生命力，并由此掀起了敞開(kāi)式質(zhì)譜研究的熱潮。敞開(kāi)式離子源的離子化過(guò)程在開(kāi)放的大氣環(huán)境下即可進(jìn)行，無(wú)需或僅需簡(jiǎn)單的樣品前處理，對(duì)樣品的性狀、種類兼容性高，且可進(jìn)行在線原位分析。本課題組相繼開(kāi)發(fā)了一系列敞開(kāi)式質(zhì)譜離子化方法[72-73]。

目前，對(duì)于敞開(kāi)式離子源和原位化學(xué)衍生化分析聯(lián)用來(lái)說(shuō)，主要有以下幾方面的應(yīng)用：1) 在線監(jiān)測(cè)化學(xué)反應(yīng)的過(guò)程和機(jī)理；2) 收集化學(xué)反應(yīng)的中間體；3) 使分析物的化學(xué)衍生化與電離同時(shí)發(fā)生，以產(chǎn)生具有良好特性的產(chǎn)物，用于后續(xù)的質(zhì)譜分析。Cooks課題組利用解吸電噴霧離子源質(zhì)譜，實(shí)現(xiàn)了通過(guò)甜菜堿醛與膽固醇發(fā)生親核加成反應(yīng)形成半縮醛，且以氘代膽固醇為內(nèi)標(biāo)，定量分析血清和動(dòng)物組織切片中的膽固醇[74-75]。一般的生物樣品中能獲得的量通常為μL級(jí)甚至nL級(jí)。目前，在各種質(zhì)譜離子源中，最適合用于分析微量樣品的離子化方法是nano-ESI，其分析的樣品所需體積小，去除了ESI的霧化氣設(shè)置，金屬電極施加2～4 kV高壓，樣品經(jīng)過(guò)電噴霧解脫附帶上電荷完成離子化過(guò)程。但是，在ESI以及Nano-ESI過(guò)程中容易發(fā)生氧化還原反應(yīng)，主要是因?yàn)闃悠啡芤号c金屬電極發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)。鑒于此，本課題組基于原有的碳纖維(CFI)離子源技術(shù)，開(kāi)發(fā)了非接觸式微型碳纖維離子化(noncontact nano-CFI)，示于圖17。該裝置對(duì)極性與非極性樣品都具有較好的離子化能力，且在一定程度上彌補(bǔ)了基于ESI原理的離子源帶來(lái)的樣品易發(fā)生氧化還原反應(yīng)的缺點(diǎn)。利用這一特點(diǎn)，本課題組將noncontact nano-CFI與NAPQ試劑聯(lián)用，提出了一種“on-probe”的快速衍生化方法，并將其應(yīng)用于單細(xì)胞內(nèi)甾醇的衍生化分析，該衍生化反應(yīng)直接在Pico-Glass-probe內(nèi)部進(jìn)行，無(wú)需任何反應(yīng)后處理。選擇CH2Cl2作為單細(xì)胞代謝物甾醇和磷脂的萃取溶劑，對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行最大程度地提取，避免信號(hào)損失，極大地提高了甾醇檢測(cè)的靈敏度和數(shù)據(jù)的可靠性。另外，衍生化也改善了甾醇代謝物的二級(jí)質(zhì)譜行為，有助于甾醇的定量分析[53]。

圖17 非接觸式微型碳纖維on probe衍生化用于分析單細(xì)胞內(nèi)甾醇 Fig.17 On probe noncontact Nano-CFI derivatization for the analysis of sterols in single-cell level

Borisov等[76]使用實(shí)時(shí)直接分析離子源質(zhì)譜(DART-MS) 對(duì)伯/仲醇和含氮堿(吡啶、喹啉)進(jìn)行原位分析反應(yīng)，為檢測(cè)和鑒定不同來(lái)源的單個(gè)一元醇、分析不同基質(zhì)中的植物甾醇和其他甾醇提供了快速、靈敏的方法。

3 總結(jié)與展望

醇類代謝物廣泛存在于生物體內(nèi)，對(duì)其分析研究是代謝組學(xué)的重要組成部分。目前，借助于各種化學(xué)衍生化試劑和質(zhì)譜儀，大幅提升了對(duì)醇類代謝物的檢測(cè)能力。通過(guò)新興的穩(wěn)定同位素衍生化技術(shù)，可以快速、簡(jiǎn)便地對(duì)醇類代謝物進(jìn)行內(nèi)標(biāo)法定量、非靶向的代謝組學(xué)分析。衍生化質(zhì)譜成像技術(shù)的引入，使檢測(cè)組織表面各區(qū)域醇類物質(zhì)含量的變化成為可能。各種直接分析質(zhì)譜技術(shù)與衍生化試劑相結(jié)合，使醇類代謝物的質(zhì)譜分析變得更加快速簡(jiǎn)便，大規(guī)模、高通量的生物樣品分析成為可能。最后，微量質(zhì)譜分析技術(shù)的發(fā)展甚至能夠在單細(xì)胞水平分析醇類代謝物的變化。這些研究成果使人欣喜，同時(shí)也激勵(lì)著研究人員繼續(xù)開(kāi)發(fā)更先進(jìn)的質(zhì)譜衍生化技術(shù)，更全面地對(duì)生物樣品中醇類代謝物進(jìn)行分析研究。