腐植酸對(duì)干旱脅迫下燕麥葉片碳同化酶活性及產(chǎn)量的影響

朱珊珊,米俊珍,趙寶平,孫夢(mèng)媛,李英浩,劉景輝

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010019)

燕麥?zhǔn)俏覈?guó)特色糧飼兼用型作物，具有營(yíng)養(yǎng)成分高，抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在我國(guó)西北、華北、西南等干旱半干旱少雨地區(qū)種植面積較大，干旱是限制其生長(zhǎng)發(fā)育和高產(chǎn)的重要因素[1]。干旱脅迫會(huì)抑制作物旗葉光合作用的酶活性[2]，影響光合碳同化，導(dǎo)致作物減產(chǎn)[3]。嚴(yán)重干旱會(huì)導(dǎo)致植物葉片碳同化酶活力降低[4-5]。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)可通過植物內(nèi)部釋放的二氧化碳和氮來提供碳骨架以進(jìn)行生物合成，緩解干旱脅迫[6-7]。光合產(chǎn)物的積累量和作物產(chǎn)量與其葉片中甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPD)和乙醇酸氧化酶(GO)活性有關(guān)[4,8]。核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)、GO、PEPC及GAPD是植物碳同化的關(guān)鍵酶，提高其效率和活力是促進(jìn)植物光合作用的重要途徑[4,8-10]。腐植酸是存在于土壤、河泥和煤炭之中的天然有機(jī)混合物[11]，有促進(jìn)作物生長(zhǎng)、節(jié)肥增效、增強(qiáng)作物抗逆性等功效，是一種多功能葉面肥[12]。張志芬[13]研究發(fā)現(xiàn)，噴施腐植酸可抑制燕麥葉片的氣孔開度，增加氣孔阻力，降低蒸騰作用，緩解燕麥干旱脅迫。腐植酸能夠緩解干旱對(duì)麻黃葉片中葉綠體片層結(jié)構(gòu)的破壞，增加葉片的葉綠素含量和凈光合速率，顯著減輕由干旱脅迫造成的氧化損傷，提高麻黃的耐旱性，從而提高其產(chǎn)量[14]。梁太波[15]研究發(fā)現(xiàn)，腐植酸肥料可以提高旱作小麥旗葉實(shí)際光化學(xué)效率和光合電子傳遞速率，延緩衰老，提高水分利用效率。以上研究表明，干旱脅迫下，腐植酸類物質(zhì)能通過改變作物葉綠素?zé)晒鈪?shù)和光合參數(shù)、降低電子傳輸通量、提高植物體內(nèi)氣體交換率，顯著提高作物光合作用、抗旱能力以及產(chǎn)量[16-18]。但有關(guān)干旱脅迫下腐植酸對(duì)燕麥葉片的碳同化酶活性及產(chǎn)量影響的研究鮮有報(bào)道。本研究以燕科2號(hào)為材料，分析不同程度干旱脅迫下噴施腐植酸對(duì)燕麥不同生育時(shí)期葉片碳同化酶活性和產(chǎn)量的影響，以期為燕麥抗旱、增產(chǎn)措施的制定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及設(shè)計(jì)

試驗(yàn)材料為燕科2號(hào)，由內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院提供。腐植酸水溶肥料采購(gòu)于內(nèi)蒙古永業(yè)農(nóng)豐生物技術(shù)有限責(zé)任公司，其水溶腐植酸含量≥50 g·L-1，N+P+K≥200 g·L-1，微量元素(錳、硼、鉬、鋅等)≥10 g·L-1。于2019年4月至8月在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)燕麥產(chǎn)業(yè)研究中心溫室進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。試驗(yàn)選用直徑為23 cm、高18 cm的塑料盆進(jìn)行，內(nèi)裝混合土5 kg(河沙∶泥炭土體積比1∶1)，泥炭土中N+P+K> 10 g·kg-1，有機(jī)質(zhì)含量> 50 g·kg-1，pH值為5.5～8.5，土壤含水率為9%。播種前每盆施入2 g磷酸二銨(N 18%，P2O546%)做底肥。設(shè)置3個(gè)水分處理：正常供水(田間最大持水量的75%，M1)、中度干旱脅迫(田間最大持水量的45%，M2)和重度干旱脅迫(田間最大持水量的30%，M3)；2個(gè)噴施處理：噴施500倍稀釋的腐植酸水溶肥料(HA)和等量清水(CK)，共6個(gè)處理。采用隨機(jī)區(qū)組排列，每個(gè)處理重復(fù)3次，每重復(fù)種植10盆，每盆播種30株，三葉期定苗為20株。2019年4月14日播種，8月21日收獲。從拔節(jié)期(5月18日)開始控水至成熟期，控水方法采用稱重差值法[19]。分別在拔節(jié)期、抽穗期、灌漿期的上午 9：00-11:00進(jìn)行HA和CK處理，在植株葉片均勻噴施至葉面濕透無滴水，每盆噴施量約14 mL；噴施7 d后取燕麥中上部葉片，投入液氮速凍后，放入-80℃冰箱冷藏，用于碳同化酶活性的測(cè)定。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1 碳同化酶測(cè)定

核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和乙醇酸氧化酶(GO)活性均采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司試劑盒測(cè)定，3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPD)活性采用上海繼錦化學(xué)科技有限公司試劑盒測(cè)定。

1.2.2 地上部干物質(zhì)積累量和產(chǎn)量及其構(gòu)成因素測(cè)定

地上部干物質(zhì)積累量：分別于拔節(jié)、抽穗、灌漿期葉面噴施處理后7 d取樣，每個(gè)重復(fù)取10株，放入紙袋，烘箱105℃殺青30 min，80℃烘干到恒重。

產(chǎn)量及構(gòu)成因素：燕麥成熟時(shí)收獲、考種，每個(gè)處理取5株， 測(cè)定主穗長(zhǎng)、單株小穗數(shù)、穗粒數(shù)、穗粒重和千粒重，并測(cè)每盆的籽粒產(chǎn)量，重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用SPSS 22.0進(jìn)行顯著性和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐植酸對(duì)不同水分處理燕麥葉片Rubisco活性的影響

由圖1可見，從拔節(jié)期到灌漿期，不同水分處理燕麥葉片的Rubisco活性均呈先升高后降低趨勢(shì)。干旱脅迫導(dǎo)致葉片Rubisco活性顯著降低。M1水分條件下，HA處理拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期燕麥葉片Rubisco活性較CK分別增加 5.62%、2.79%、6.88%，僅在灌漿期差異達(dá)到顯著水平。M2水分條件下，HA處理各時(shí)期葉片Rubisco活性較CK均顯著提高，拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期分別增加了22.38%、25.83%、 19.17%。水分條件為M3下，拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期HA較CK處理葉片Rubisco活性分別增加了28.45%、34.41%、32.22%，差異均達(dá)到顯著水平。以上結(jié)果說明，干旱脅迫顯著降低了燕麥葉片Rubisco活性；噴施腐植酸可有效緩解干旱脅迫對(duì)燕麥葉片Rubisco活性的影響，尤其在M3水分條件下效果更佳。

2.2 腐植酸對(duì)不同水分處理下燕麥葉片GAPD活性的影響

隨著干旱程度的加深，各時(shí)期葉片中的GAPD活性均呈降低趨勢(shì)(圖2)。與CK相比，M1水分條件下噴施腐植酸可以提高GAPD活性，但只在抽穗期效果顯著；在M2和M3水分條件下，噴施腐植酸均能使各時(shí)期GAPD活性顯著增加，其中在M3水條件下增加的幅度最大，拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期分別增加36.55%、31.80%、39.60%。這說明噴施腐植酸可不同程度地減小干旱脅迫對(duì)燕麥葉片GAPD活性的影響，在M3處理下效果較好。

2.3 腐植酸對(duì)不同水分處理下燕麥葉片PEPC活性的影響

由圖3可知，燕麥葉片的PEPC活性在抽穗期達(dá)到最高。在M1水分條件下，噴施腐植酸后燕麥葉片PEPC活性與CK相比僅在拔節(jié)期差異顯著；當(dāng)水分條件為M2和M3時(shí)，噴施腐植酸后葉片中的PEPC活性較CK在各時(shí)期均顯著增加，其中在M2水分條件下，拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期噴施腐植酸較CK分別增加了21.43%、 24.04%、25.42%，M3水分條件下，拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期噴施腐植酸較CK分別增加了 38.24%、32.96%、33.81%。這說明噴施腐植酸提高了干旱脅迫下燕麥葉片的PEPC活性，且M3水分條件下提升幅度最大。

2.4 腐植酸對(duì)不同水分處理下燕麥葉片GO活性的影響

從拔節(jié)期到灌漿期，燕麥葉片GO活性先降低后升高(圖4)。干旱脅迫導(dǎo)致燕麥葉片GO活性升高，且隨著干旱程度的加劇而增加。在M1水分條件下，噴施腐植酸后燕麥葉片GO活性與CK相比差異均未達(dá)到顯著水平；當(dāng)水分條件為M2和M3時(shí)，噴施腐植酸后葉片GO活性在各時(shí)期與CK相比均顯著降低，其中M2條件下，拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期較CK分別降低16.18%、13.64%、14.65%，M3條件下，拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期分別降低16.85%、16.75%、18.39%。這表明干旱脅迫顯著提高了燕麥葉片 GO的活性，噴施腐植酸能有效緩解這種增長(zhǎng)趨勢(shì)。

表1 不同處理下燕麥地上部干物質(zhì)積累量的影響Table 1 Effect of different treatments on above-ground dry matter mass of oat g·10-1 plants

2.5 腐植酸對(duì)不同水分處理下燕麥地上部干物質(zhì)積累量的影響

由表1可知，隨著干旱程度的加深，燕麥地上部干物質(zhì)積累量顯著減少。與CK相比，在M1水分條件下，HA處理對(duì)燕麥各時(shí)期地上部干物質(zhì)積累量沒有顯著影響；在M2和M3水分條件下，拔節(jié)期、抽穗期、灌漿期HA處理燕麥地上部干物質(zhì)積累量均較CK顯著增加，增幅分別為10.64%、 3.82%、2.09%和16.56%、4.20%、 2.43%。

2.6 腐植酸對(duì)不同水分處理下燕麥產(chǎn)量及其構(gòu)成因素的影響

表2顯示，干旱脅迫導(dǎo)致燕麥產(chǎn)量及其構(gòu)成因素均顯著下降，且均表現(xiàn)為M1>M2>M3。與CK相比，噴施腐植酸能使燕麥產(chǎn)量增加，M1、M2、M3水分條件下分別增加2.63%、8.46%和10.26%，其中在M2和M3水分條件下差異達(dá)到顯著水平。從產(chǎn)量構(gòu)成因素來看，噴施腐植酸后，穗長(zhǎng)、穗粒重和千粒重較CK均增加，增加幅度均表現(xiàn)為M3>M2>M1，其中穗粒重和千粒重在M2和M3水分條件下增加顯著，分別增加 15.38%、16.07%和10.74%、15.67%；與CK相比，噴施腐植酸可以提高燕麥單株小穗數(shù)、穗粒數(shù)、穗數(shù)，但差異均不顯著。說明噴施腐植酸主要通過降低干旱對(duì)千粒重的影響而增加產(chǎn)量。

2.7 碳同化酶活性與產(chǎn)量及其構(gòu)成因素的相關(guān)性分析

Rubisco活性與穗粒重和產(chǎn)量的相關(guān)性均達(dá)到極顯著水平，與千粒重呈顯著正相關(guān)，與穗粒重的相關(guān)性最大。PEPC和GAPD活性與穗粒重、千粒重和產(chǎn)量均呈極顯著正相關(guān)，與穗粒重的相關(guān)性最大。GO活性與穗粒重、千粒重和產(chǎn)量均極顯著負(fù)相關(guān)，與產(chǎn)量的相關(guān)性最大。穗粒重與千粒重與產(chǎn)量呈極顯著正相關(guān)(表3)。

表2 不同處理對(duì)燕麥產(chǎn)量及其構(gòu)成因素的影響Table 2 Effect of different treatments on oat yield and its components

表3 燕麥葉片碳同化酶活性與產(chǎn)量及其構(gòu)成因素的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of carbon assimilating enzyme activity in oat leaves with yield and its components

3 討 論

植物的光合作用是干物質(zhì)積累和產(chǎn)量形成的基礎(chǔ)，較高的光合碳同化能力是獲得高產(chǎn)的前提?？栁难h(huán)中，Rubisco 是影響光合碳同化的關(guān)鍵酶，能使逆境脅迫中的植物維持光合作用[20]。干旱脅迫會(huì)導(dǎo)致 Rubisco 活性降低，光合作用產(chǎn)生限制[16,21-22]，本研究結(jié)果與此相似，隨著干旱脅迫程度的增加，Rubisco活性逐漸下降，可能干旱脅迫使相應(yīng)酶量降低，進(jìn)而導(dǎo)致 Rubiso 活性下降，影響了光合碳同化[23]。在重度干旱脅迫中，作物葉片光合能力的降低主要受非氣孔因素限制，葉片光合放氧能力降低，光合磷酸化解偶聯(lián)，阻礙CO2擴(kuò)散，RuBP羧化酶活性下降，光合器官的生理功能遭到破壞，影響作物光合作用[24-25]，噴施腐植酸使植物在干旱脅迫下維持光合系統(tǒng)的穩(wěn)定和相對(duì)較高的光合作用，對(duì)非氣孔因素引起的光合限制具有緩解作用[26-27]。有研究表明，在氮脅迫下添加腐植酸比未添加處理RuBPCase活性顯著提高[28]。Jannin等[29]提出，腐殖質(zhì)處理后的植物Rubisco活性增加可能是由于細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)量增加所致。本研究表明，重度干旱脅迫下，噴施腐植酸后燕麥葉片中Rubisco酶活性與CK相比提高幅度最大，中度脅迫條件下其活性雖有提高，但幅度較小。這可能是由于腐植酸在重度干旱脅迫下更能緩解干旱對(duì)葉綠體的傷害[13]，增加RuBP羧化酶固定CO2的量，進(jìn)而提高Rubisco的羧化效率，提高作物的光合能力。

GAPD是糖異生和糖酵解過程中的關(guān)鍵酶，催化3-磷酸甘油酸(3-PGA)還原成3-磷酸甘油醛，影響光合環(huán)的運(yùn)轉(zhuǎn)效率及光合產(chǎn)物的積累[30]。Ziaf等[31]發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下GAPD基因的表達(dá)減輕了植物膜脂過氧化的程度。有研究表明，隨著水分脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)和脅迫強(qiáng)度的加劇，小麥旗葉的GAPD活性逐漸降低[23]，與本研究結(jié)果一致。在逆境條件下，生物體中GAPD基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平不穩(wěn)定，大多數(shù)生物體都增加表達(dá)GAPD[32]。郭子平[33]研究表明，干旱脅迫下，小麥葉片總GAPD活性隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。在本研究中，隨著干旱脅迫程度的加劇，葉片中的GAPD活性逐漸降低，與上述研究結(jié)果不同，可能是因?yàn)椴煌购殿愋妥魑锸艿礁珊得{迫時(shí)GAPD基因的表達(dá)調(diào)控因子和信號(hào)傳遞途徑存在差異，也可能是不同作物、不同品種的GAPD蛋白在植物細(xì)胞的失水耐受過程中作用不同[34]。有研究表明，腐植酸可以誘發(fā)含有NADP依賴性甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPN)蛋白產(chǎn)生[35]。在本研究中，兩種干旱脅迫條件下噴施腐植酸，燕麥葉片的GAPD活性均能提高，但在重度脅迫下變化幅度較大?？赡苁且?yàn)楦菜嵩谥参锛?xì)胞過度失水時(shí)誘導(dǎo)了GAPDH蛋白的大量表達(dá)，導(dǎo)致酶活性提高，促進(jìn)光合產(chǎn)物的積累，最終增加燕麥的穗粒重，使產(chǎn)量增加。

PEPC在CAM和C4植物中的主要生理作用是初級(jí)CO2的固定還原[36]。有研究表明，C3植物中也存在PEPC[37]，在大部分C3植物體內(nèi)中，PEPC具有回補(bǔ)作用，補(bǔ)充三羧酸循環(huán)，其中間產(chǎn)物能被用于多種生物合成及氮同化消耗[36]。關(guān)于干旱脅迫對(duì)PEPC活性的影響，各試驗(yàn)結(jié)果有所不同。有研究表明，在水分虧缺下，小麥PEPC活性明顯增強(qiáng)[18]；而張 旭等[38]認(rèn)為，干旱導(dǎo)致小麥旗葉PEPC活性下降。玉米葉片中PEPC活性在水分脅迫下先升后降[39]。在本研究中，隨著干旱脅迫程度的加劇，PEPC活性均逐漸降低，有可能是不同種類的植物應(yīng)答干旱的生態(tài)適應(yīng)性機(jī)制不同[40]。噴施腐植酸后，PEPC活性均有所提高，且土壤水分含量低時(shí)提升效果更佳，可能是在過度失水下，腐植酸在一定程度上更能誘導(dǎo)PEPC酶蛋白的表達(dá)，具體原因還需進(jìn)一步探討。

GO在植物光呼吸代謝中具有關(guān)鍵作用，能提高植物光合效率[41]。隨著干旱脅迫的加劇，檸條中GO活性逐漸增強(qiáng)[42]，與本研究研究結(jié)果相似。這說明隨著干旱程度加劇，乙醇酸氧化酶活性也隨之升高。乙醇酸氧化酶催化乙醇酸的氧化過程中伴隨著 H2O2的生成，是H2O2總數(shù)的70%[43]。水分脅迫能夠增加GO活性，誘導(dǎo)大量H2O2的累積[44]。Garcar等[45]研究發(fā)現(xiàn)，腐植酸可通過降低水稻H2O2的含量，提高膜的通透性，對(duì)干旱引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)起到保護(hù)作用。本研究結(jié)果表明，腐植酸能使干旱條件下燕麥葉片GO活性降低，其中在重度干旱脅迫時(shí)，噴施腐植酸較CK處理相比降低幅度更大。這說明腐植酸可能是通過減少過氧化氫的生成來抑制乙醇酸氧化酶的活性，降低燕麥的光呼吸，增加作物的光合作用。

綜上，干旱脅迫通過改變碳同化酶活性，降低光合碳同化能力，從而影響燕麥的干物質(zhì)積累和產(chǎn)量形成，噴施腐植酸能顯著提高燕麥葉片Rubisco、GAPD和PEPC活性，提高碳的同化能力，降低GO活性，促進(jìn)光合作用，增加產(chǎn)量，當(dāng)田間最大持水量為30%提升幅度更大。