外源NO對鋁脅迫下蘿卜種子萌發(fā)及幼苗生理特性的影響

雷 陽， 劉 釗， 王生武， 白 揚(yáng)， 魏 曄

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院， 太原 030031；2.山西省科技情報與戰(zhàn)略研究中心， 太原 030012)

鋁是植物體內(nèi)的非必需元素，雖然土壤中存在大量的鋁元素，但主要以難溶的三氧化二鋁、鋁的硅酸鹽等形式存在，并不會對植物造成生理脅迫。但隨著我國城市化和工業(yè)化的進(jìn)行，酸雨、酸性的工業(yè)廢水、廢渣攜帶著大量氫離子進(jìn)入土壤中，以陽離子交換的形式將穩(wěn)定的鋁元素替換為植物體易于吸收的Al3+。同時很多農(nóng)藥和化肥都呈酸性，無節(jié)制的施用也導(dǎo)致了農(nóng)田土壤中鋁含量急劇增加。耕地中鋁元素的不斷增加, 已經(jīng)成為影響我國農(nóng)作物生產(chǎn)及食品安全的重要隱患。卻志群[1]研究發(fā)現(xiàn)，蘿卜在鋁脅迫下種子萌發(fā)受到嚴(yán)重影響，進(jìn)而抑制了幼苗根和葉的生長; 葉義全等[2]研究表明，鋁脅迫會降低杉木幼苗的光和色素含量從而影響光合作用；劉強(qiáng)等[3]研究發(fā)現(xiàn)，鋁離子可使煙草細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量O2·-和H2O2等活性氧，從而損傷植物胞質(zhì)膜，產(chǎn)生鋁脅迫反應(yīng)。

一氧化氮(NO)是植物體內(nèi)重要的信號分子，能夠調(diào)控植物體內(nèi)多途徑、多基因表達(dá)。目前已經(jīng)證實(shí)的通路包括NO合成酶途徑、硝酸還原酶、亞硝酸還原酶途徑，并廣泛參與到其他信號通路中[4]。研究表明，適宜濃度的外源NO可以有效提高植物種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、幼苗根長和莖長，增加植物體內(nèi)光合色素的含量，增強(qiáng)植物的光合作用[5-6]。在鋁脅迫下，NO可以通過提高抗氧化酶的活性來減弱鋁離子脅迫對植物體產(chǎn)生的負(fù)作用[7-8]；同時通過激活光合色素表達(dá)途徑，增加葉綠素、類胡蘿卜素含量從而增強(qiáng)植物光合作用，抵消鋁脅迫的影響[9-10]。近年來，鋁污染的情況越來越嚴(yán)重，因此，本研究開展了外源 NO緩解蘿卜幼苗鋁脅迫的效應(yīng)試驗(yàn)，通過測定蘿卜種子萌發(fā)及葉片生理變化等指標(biāo)，研究可緩解蘿卜鋁脅迫的最適硝普鈉(SNP)濃度，以期為鋁污染防治和土壤修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試蘿卜品種為春紅1號，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所蘿卜團(tuán)隊(duì)提供。鋁離子供體為Al(NO3)3，購自山西森躍商貿(mào)有限公司。NO供體為Na2[Fe(CN)5NO]·2 H2O(SNP)，購自山西森躍商貿(mào)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1種子萌發(fā)試驗(yàn)

選取均勻無病害的春紅1號蘿卜種子，用滅菌水在室溫下浸泡6～8 h，然后用75%乙醇沖洗30 s，15% 的NaClO沖洗20 min，滅菌水洗滌3次，放入真空干燥箱40 ℃烘干1 h。試驗(yàn)分成對照組(ck)(處理液為滅菌水)和6個處理組，處理組中均添加0.5 mmol·L-1(187.57 mg·kg-1)的Al(NO3)3，pH值控制在5.4，并分別添加濃度為0 μmol·L-1、25 μmol·L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1、150 μmol·L-1、200 μmol·L-1SNP溶液，將6個處理分別命名為SNP-0、SNP-25、SNP-50、SNP-100、SNP-150、SNP-200。將蘿卜種子置于直徑為9 cm培養(yǎng)皿中的濾紙上，濾紙上浸滿不同濃度的處理液，每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)200粒種子。蘿卜種子于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，避光催芽3 d，進(jìn)而光照12 h/黑暗12 h、相對濕度70%。此后每天以滅菌水補(bǔ)充蒸發(fā)掉的液體。培養(yǎng)10 d后測定蘿卜幼苗莖長、根長、葉長和葉寬等形態(tài)指標(biāo)。

1.2.2種子萌發(fā)指標(biāo)的測定

培養(yǎng)5 d后測定發(fā)芽勢：

發(fā)芽勢(%)=(發(fā)芽種子粒數(shù)/200)×100%。

1.2.3形態(tài)指標(biāo)的測量

培養(yǎng)10 d后測定春紅1號蘿卜幼苗莖長、根長、葉長和葉寬等形態(tài)指標(biāo)。

1.2.4幼苗生理指標(biāo)的測定

培養(yǎng)12 d后測定春紅1號蘿卜幼苗的各項(xiàng)生理指標(biāo)。

葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量的測定:避光條件下在丙酮中破碎春紅1號蘿卜幼苗葉片，然后分別在470 nm、649 nm和665 nm波長下測定吸光度值。

SOD活性采用張慧杰等[11]的方法測定;POD活性采用尹桂彬等[12]的方法測定;CAT活性采用劉亞光等[13]的方法測定；APX活性采用張倩等[14]的方法測定。根尖O2·-和H2O2含量均采用Zhou等[15]的方法，取根尖1 cm測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2016軟件整理數(shù)據(jù)和作圖;SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù)，Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源NO對鋁脅迫下蘿卜種子發(fā)芽勢的影響

由圖1可知，添加了鋁離子SNP-0較未添加鋁離子的ck處理，發(fā)芽勢降低了22.58%，說明鋁離子對蘿卜種子的萌發(fā)起到了抑制作用。SNP-50、SNP-100兩個處理顯著提高了蘿卜種子發(fā)芽勢，較ck增加15.86%和27.42%，較同為鋁脅迫下的SNP-0分別增加了49.65%和64.58%。說明適量的SNP不僅可以抵消鋁離子對蘿卜種子的毒害，還可以有效提高蘿卜種子的發(fā)芽勢。當(dāng)SNP濃度在200 μmol·L-1時，蘿卜種子的發(fā)芽勢比同樣添加鋁離子但未添加SNP的SNP-0處理低12.15%。

2.2 外源NO對鋁脅迫下蘿卜幼苗形態(tài)指標(biāo)的影響

由圖2可知，6個添加了鋁離子的處理在10 d的根長和莖長均顯著短于未添加鋁離子的ck處理，說明鋁脅迫對蘿卜的根長和莖長有較強(qiáng)的抑制作用。在鋁脅迫的6個處理中，SNP-25、SNP-50、SNP-100、SNP-150等4個處理的根長和莖長均大于未添加SNP的SNP-0，根長增幅分別為26.07%、68.24%、114.94%和1.88%；莖長增幅為24.49%、61.66%、103.94%和18.74%。說明 SNP可有效緩解鋁離子脅迫對蘿卜根長和莖長的影響。其中SNP-100處理的根長和莖長最長，分別為11.84 cm和6.09 cm。SNP-200處理的蘿卜根長和莖長小于SNP-0，降幅分別為13.27%和10.54%，說明較高的SNP濃度反而會降低其緩解鋁脅迫的作用。

由圖3可知， 6個添加了鋁離子的處理的葉長較ck處理均有下降，可見鋁脅迫對蘿卜的葉長有一定的抑制作用。SNP-25、SNP-50、SNP-100、SNP-150和SNP-200的葉長均大于未添加SNP的處理SNP-0，增幅分別為15.79%、35.09%、56.73%、19.30%和4.68%。說明添加SNP可緩解鋁離子脅迫對蘿卜葉長的影響。其中SNP-100處理的葉長最長，為0.89 cm。同樣，6個添加了鋁離子的處理的葉寬較ck處理均有下降，說明在鋁脅迫下，蘿卜的葉寬會有一定程度的降低。處理SNP-25、SNP-50、SNP-100、SNP-150、SNP-200的葉寬均大于未添加SNP的處理SNP-0，增幅分別為8.11%、18.06%、36.49%、9.01%、4.50%，說明SNP可有效緩解鋁脅迫對蘿卜葉寬的影響。

2.3 外源NO對鋁脅迫下蘿卜幼苗葉片光合色素含量的影響

由圖4可知，處于鋁脅迫下的6個處理在葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量上均顯著少于未添加鋁離子的ck處理。說明鋁脅迫對蘿卜葉片的光合色素含量有較強(qiáng)的抑制作用。在相同濃度的鋁離子脅迫下，施加SNP的濃度為100 μmol·L-1時，蘿卜幼苗葉片的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量有顯著提高。其中葉綠素a含量較未添加SNP 處理SNP-0增加55.18%，葉綠素b含量升高了48.31%，類胡蘿卜素含量升高了88.06%。SNP-150和SNP-200兩個處理的蘿卜幼苗葉片各色素含量顯著下降，說明這兩個濃度的SNP對蘿卜的光合作用產(chǎn)生了抑制作用。

2.4 外源NO對鋁脅迫下蘿卜幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

由圖5可知，SNP-0、SNP-25、SNP-50、SNP-100、SNP-150、SNP-200這6個處理的SOD活性均不同程度的低于ck處理，降幅分別為38.24%、29.40%、19.93%、5.77%、38.83%和47.29%，說明鋁離子對蘿卜體內(nèi)的SOD活性有較強(qiáng)的抑制作用。且在鋁脅迫下，不同濃度的SNP對蘿卜葉片中的SOD含量有顯著的影響。其中SNP-25、SNP-50、SNP-100較SNP-0的SOD活性均有提高，增幅為14.30%、29.63%、52.56%。SNP-200 處理的SOD活性相比SNP-0有較大的下降，降幅為14.66%，說明較高濃度的SNP會造成SOD活性的降低。

由圖6可知，SNP-0、SNP-25、SNP-50、SNP-100、SNP-150、SNP-200這6個處理的CAT活性均不同程度的低于ck處理，降幅分別為51.24%、43.58%、27.29%、8.41%、35.81%、50.27%。且在鋁脅迫下，不同濃度的SNP對蘿卜葉片中的CAT含量有顯著的影響。SNP-25、SNP-50、SNP-100、SNP-150和SNP-200等5個處理的CAT含量較SNP-0均有不同程度的增加，增幅為15.84%、49.28%、88.04%和31.78%和2.10%。

由圖7可知，SNP-0、SNP-25、SNP-50、SNP-100、SNP-150、SNP-200這6個處理的POD活性均不同程度的低于ck處理，降幅分別為47.54%、40.00%、31.74%、23.19%、39.42%和48.41%，且在鋁脅迫下，不同濃度的SNP對蘿卜葉片中的POD含量有顯著的影響。SNP-25、SNP-50、SNP-100、SNP-150這4個處理的POD含量較SNP-0均有增加，增幅分別為14.05%、29.75%、46.01%、15.15%。

由圖8可知，鋁脅迫下，處理SNP-0相對于ck有顯著下降，降幅為42.01%，說明鋁脅迫對蘿卜葉片中APX活性有明顯的抑制作用。處于鋁脅迫下的處理SNP-100的APX活性顯著高于ck處理，增幅為40.52%，SNP-50相比于ck略有上升，增幅為6.01%。說明適量的SNP不僅可以抵消鋁脅迫下對蘿卜葉片中APX活性的影響，還可以大幅提升APX活性。

由圖9可知，SNP-0、SNP-25、SNP-50、SNP-100、SNP-150、SNP-200這6個處理的葉片O2·-產(chǎn)生速率均不同程度的高于ck處理，增幅分別為90.37%、74.35%、57.76%、35.49%、66.97%和89.23%。且在鋁脅迫下，不同濃度的SNP對蘿卜根部中的O2·-產(chǎn)生速率也有顯著的影響。SNP-25、SNP-50、SNP-100、SNP-150和SNP-200這5個處理的O2·-產(chǎn)生速率較SNP-0均有不同程度的增加，增幅分別為8.42%、17.14%、28.83%、12.30%和0.60%。

由圖10可知，SNP-0、SNP-25、SNP-50、SNP-100、SNP-150、SNP-200這6個處理的葉片H2O2含量均不同程度的高于ck處理，增幅分別為60.82%、46.85%、32.88%、13.92%、40.42%和50.62%，且在鋁脅迫下，不同濃度的SNP對蘿卜根部中的H2O2含量也有顯著的影響。SNP-25、SNP-50、SNP-100、SNP-150和SNP-200這5個處理的H2O2含量較SNP-0均有不同程度的降低，降幅分別為8.69%、17.38%、29.16%、12.69%和6.34%。

3 討 論

鋁是植物體內(nèi)的非必要元素，會對植物體的正常生長起到抑制作用，降低植物的產(chǎn)量和品質(zhì)[16]。鋁離子會損害植物的根系，降低主根的生長長度和側(cè)根的數(shù)量，甚至?xí)斐筛康幕螇乃繹17]。同時鋁離子也會破壞植物的光合系統(tǒng)，降低葉綠素和類胡蘿卜素的含量，抑制植物體的光合作用[18]。NO是廣泛存在于植物體內(nèi)的重要的信號分子[19]，張旭強(qiáng)等[6]研究表明，添加適量的外源NO可以有效提高植物種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、幼苗根長和莖長。吳佩等[20]研究表明，適量的外源NO可增加植物體內(nèi)葉綠素的含量，增加葉綠素相關(guān)基因的表達(dá)量，從而增強(qiáng)植物的光合作用。

本研究結(jié)果表明，較高濃度的鋁脅迫對蘿卜種子的發(fā)芽勢、幼苗根長、莖長、葉長、葉寬產(chǎn)生明顯的抑制作用。而適當(dāng)濃度的外源NO可以有效促進(jìn)蘿卜種子萌發(fā)，減弱鋁脅迫下對蘿卜幼苗根長、莖長、葉長、葉寬產(chǎn)生的副作用。這與侯文娟等[21]、孫成亮[22]、張澤勇等[23]的研究結(jié)果相一致。本研究發(fā)現(xiàn)，較高濃度鋁離子會嚴(yán)重?fù)p害蘿卜的光合系統(tǒng)，而添加100 μmol·L-1SNP可以有效緩解鋁脅迫，提高植物光合色素的含量，改善其蘿卜葉片的光合作用。一方面可能是因?yàn)樾盘柗肿覰O提高類囊體膜蛋白的穩(wěn)定性，從而降低了鋁脅迫對類囊體膜的破壞作用，另一方面可能是由于NO激活了蘿卜葉片中的葉綠素表達(dá)基因，從而提高了光合色素的含量[19]。本研究表明，在鋁脅迫下蘿卜幼苗葉片中的POD、SOD、CAT和APX活性顯著下降，根尖的O2·-產(chǎn)生速率和H2O2含量顯著上升，這可能是高濃度的鋁離子會占據(jù)或替換保護(hù)酶和抗氧化物酶的活性中心，從而降低酶活性，無法行使正常功能。而通過加入100 μmol·L-1SNP可有效提高蘿卜幼苗葉片中的保護(hù)酶和抗氧化物酶活性，降低活性氧含量。這與王芳妹[24]、陳萌[25]、劉強(qiáng)等[26]的研究結(jié)果相一致。

本研究以在高濃度鋁脅迫下的春紅1號為材料，探究了不同濃度SNP對蘿卜幼苗各項(xiàng)生理指標(biāo)的影響。研究結(jié)果表明，適宜濃度的外源NO可以促進(jìn)蘿卜種子萌發(fā)，增加葉片中光合色素含量，提高POD、SOD、CAT和APX活性，降低根尖的O2·-產(chǎn)生速率和H2O2含量，從而有效緩解鋁脅迫對蘿卜造成的傷害。