貴州地方高粱種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

胡小蘭, 任明見,2, 曾慶鴻, 申 濤, 邱紅波

(1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 貴陽 550025； 2.國家小麥改良中心貴州分中心, 貴陽 550025;3.貴州省農(nóng)業(yè)科技發(fā)展中心， 貴陽 550001)

高粱(Sorghumbicolor(L.) Moench)屬于禾本科高粱屬，為一年生草本植物。是我國重要的糧食作物，因其水分利用率高、抗旱性強(qiáng)，具有很強(qiáng)的抗逆性和適應(yīng)性，在我國東北、華北、西北等干旱地區(qū)廣泛種植[1]。高粱種類豐富，用途廣泛，是重要的糧食、飼料和生物能源原料。據(jù)統(tǒng)計，中國高粱種植面積有70萬～80萬hm2[2]。在貴州，高粱具有很高的經(jīng)濟(jì)價值，主要用于釀造高檔醬香白酒[3]。目前，貴州高粱育種主要面臨種質(zhì)資源貧乏、遺傳基礎(chǔ)狹窄、品種退化、抗性差、育種技術(shù)相對落后等問題[4]，因此，對地方種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析及聚類十分必要，明確不同種質(zhì)資源間的親緣關(guān)系可以為優(yōu)良品種的篩選和針對性引進(jìn)優(yōu)良品種提供基礎(chǔ)參考。

隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，SSR分子標(biāo)記技術(shù)由于具備多態(tài)性高、重復(fù)性好、穩(wěn)定可靠等特點，廣泛應(yīng)用于多種作物的研究中[5]。邵健豐等[6]利用SSR分子標(biāo)記構(gòu)建了包含12個連鎖群的帚高粱遺傳連鎖圖譜；Atta Ullah等[7]通過SSR分子標(biāo)記對56個大豆品種間的分子多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示存在顯著差異；倪先林等[8]利用26對SSR引物對29份糯高粱種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，將29份糯高粱品種聚為兩大類。在作物的遺傳差異研究中，聚類分析是一種將研究對象分為相對同質(zhì)的群組的統(tǒng)計分析技術(shù)，主要應(yīng)用于探索性的研究[9]，具有簡單、直觀的優(yōu)點，在作物研究中常被用來對表型或基因進(jìn)行分類，獲取對種群固有結(jié)構(gòu)的認(rèn)識。趙慶勇等[10]采用SSR分子標(biāo)記和表型性狀2種聚類方法對30個雜交粳稻親本的遺傳多樣性進(jìn)行比較研究，并分析了這些親本的遺傳差異；田承華等[1]利用SSR分子標(biāo)記與表型性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析找出了高粱中與5個表型性狀相關(guān)聯(lián)的4個標(biāo)記。胡齊贊等[11]基于表型和分子標(biāo)記對85份芥菜地方種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析，豐富了芥菜的遺傳基礎(chǔ)。

本研究通過對26份貴州地方高粱種質(zhì)材料進(jìn)行SSR分子標(biāo)記和表型性狀的遺傳多樣性分析，為貴州地方高粱雜交親本選配和分子標(biāo)記輔助育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的26份貴州地方高粱種質(zhì)材料由國家小麥改良中心貴州分中心等單位提供，材料編號、名稱及來源詳見表1。

表1 26份貴州高粱地方種質(zhì)資源及來源

1.2 試驗方法

1.2.1田間設(shè)計

2020年6月將供試材料種植于貴陽市花溪區(qū)，國家小麥改良中心貴州分中心試驗田，試驗田選址環(huán)境、水肥管理一致。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，每區(qū)3行，設(shè)3次重復(fù)，株距18 cm,行距12 cm。

1.2.2田間表型性狀調(diào)查

成熟后進(jìn)行表型性狀調(diào)查，每份材料中間隨機(jī)取10株，記錄樣株株高、穗長、穗寬、葉片數(shù)、旗葉寬。收獲后對調(diào)查樣株進(jìn)行試驗室考種并記錄單穗粒重和千粒重。

1.2.3DNA提取

采用CTAB法[12]提取DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量和濃度合格后-20 ℃保存?zhèn)溆?。?0對SSR引物中篩選出13對多態(tài)性引物，標(biāo)記序列信息來源于文獻(xiàn)[1]、文獻(xiàn)[12]、文獻(xiàn)[13]。PCR反應(yīng)體系20.0 μL：模板DNA 4 μL、10×PCR buffer(mg2+Plus)2 μL、dNTPs 0.4 μL、5 UTaqDNA聚合酶0.5 μL、上下引物各1 μL, 加ddH2O補(bǔ)足20 μL。引物名稱及序列詳見表2。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用10%非變性聚丙烯酰胺電泳進(jìn)行檢測，銀染并拍照[14]。

表2 13對引物名稱及序列

1.3 統(tǒng)計分析

采用Excel 2003軟件、SPSS 21.0軟件對各表型性狀進(jìn)行變異性分析和相關(guān)性分析，用系統(tǒng)聚類組內(nèi)聯(lián)接法進(jìn)行聚類分析, 聚類結(jié)果樹狀圖采用歐式距離繪制。根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果，對條帶進(jìn)行統(tǒng)計，相同遷移位置上，有條帶記為1，無條帶記為0，建立0/1矩陣，應(yīng)用NTSYS 2.10 e軟件中UPGM法進(jìn)行聚類分析。根據(jù)軟件需要將初始數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換，利用POPGENE軟件、PIC Cale 0.6軟件計算SSR分子標(biāo)記引物的Shannon信息指數(shù)(I)、等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、及平均多態(tài)性信息量 (PIC)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR分子標(biāo)記結(jié)果

對SSR分子標(biāo)記結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析(表3)，數(shù)據(jù)顯示：13對SSR引物共檢測出26個等位基因，平均等位基因為2個；有效等位基因數(shù)變幅為2.00～1.35，均值為1.68，表明等位基因在群體中分布較均勻；Shannon信息指數(shù)變幅為0.43～0.67，均值為0.58；多態(tài)性信息含量變幅為0.23～0.37，均值為0.31；觀測雜合度變幅為0.49～0.73，均值為0.60，表明雜合位點比例較高；期望雜合度變幅為0.27～0.51，均值為0.40，表明參試材料存在雜合。

表3 13對引物的多態(tài)性

2.2 基于SSR分子標(biāo)記的高粱種質(zhì)聚類分析

利用UPGM法對26份供試材料進(jìn)行聚類分析(圖1)，結(jié)果顯示，26份高粱種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)范圍在0.31～0.93之間，在遺傳相似系數(shù)為0.457時將高粱材料分為四個類群，第Ⅰ類群包含19份材料，遺傳相似系數(shù)范圍在0.53～0.92之間；8、15、16號材料聚為第Ⅱ類群，遺傳相似系數(shù)范圍在0.46～0.54之間；20號材料單獨(dú)劃分為第Ⅲ類群；第Ⅳ類群包含3份材料，遺傳相似系數(shù)范圍在0.54～0.62之間。數(shù)據(jù)表明，第Ⅳ類群與其他三個類群間的遺傳相似性較低，表明類群中種質(zhì)資源的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，可以為雜交親本的選擇提供參考；19號茅粱糯2號是通過貴州省農(nóng)作物品種審定委員會審定的品種(編號：黔審粱2016001)，與21號茅臺紅1號是近似品種(系)材料，遺傳相似系數(shù)為0.92，二者的聚類結(jié)果與其親緣關(guān)系相符。

2.3 表型性狀變異性及相關(guān)性分析

對供試高粱材料的株高、穗長、穗寬、葉片數(shù)、旗葉長、旗葉寬、單穗粒重和千粒重8個表型性狀進(jìn)行變異性分析(表4)。結(jié)果顯示，株高、穗長和千粒重的偏度小于0，說明這三個表型性狀調(diào)查結(jié)果分布呈負(fù)偏態(tài)，而其余表型性狀偏度均大于0，說明分布呈正偏態(tài)。供試材料表型性狀變異系數(shù)均在10%以上，變異系數(shù)范圍在13.09%～44.46%之間，均值為22.70%，其中穗粒重變異系數(shù)最大，高達(dá)44.46%。數(shù)據(jù)表明供試高粱材料存在遺傳變異，且穗粒重存在較大程度的遺傳變異，性狀選擇潛力最大，在選育品種籽粒大小方面有更多的選擇，在今后的遺傳育種中具有較高的應(yīng)用價值。

表4 26份高粱種質(zhì)資源的表型性狀表現(xiàn)與分布

對各表型性狀進(jìn)行相關(guān)性分析(表5)，結(jié)果顯示：株高、穗長、葉片數(shù)、旗葉長和旗葉寬都與穗粒重呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.311、0.324、0.353、0.302、0.277；千粒重與穗寬呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.111，與株高呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.128，與穗粒重呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.291。以上說明供試高粱的株高、穗長、葉片數(shù)、旗葉長和旗葉寬對穗粒重的增加有重要影響，穗粒重隨著株高、穗長、葉片數(shù)、旗葉長和旗葉寬的增加而增加，千粒重隨著株高和穗粒重的增加而增加。

表5 高粱8個表型性狀間的 Pearson 相關(guān)系數(shù)

2.4 基于表型性狀的高粱種質(zhì)聚類分析

基于表型性狀進(jìn)行聚類分析, 用歐式距離繪制聚類結(jié)果樹狀圖(圖2)，結(jié)果顯示，26份高粱材料在歐式距離為13.5處被分為五大類群，由圖2可看出，8、15、16號聚為第Ⅰ類群，這3份材料均屬于矮桿、短穗、穗粒重和千粒重中等的種質(zhì)；第Ⅱ類群有14份材料，均為高桿、長穗、穗粒重和千粒重中等的種質(zhì)；第Ⅲ類群有7份材料，均為高桿、長穗、穗粒重和千粒重較高的種質(zhì)；23號材料單獨(dú)聚為第Ⅳ類群，為高桿、長穗、穗粒重和千粒重高的種質(zhì)；6號材料也單獨(dú)聚為第Ⅴ類群，為中高桿、短穗、單粒重和千粒重較低的種質(zhì)。

3 討 論

種質(zhì)資源遺傳多樣性是進(jìn)行品種遺傳改良的重要前提，目前研究植物遺傳多樣性多以單獨(dú)表型性狀或分子標(biāo)記為切入點。前人研究表明，在遺傳多樣性分析過程中，將表型性狀與分子標(biāo)記相結(jié)合進(jìn)行遺傳多樣性分析的結(jié)果更具有客觀性及準(zhǔn)確性[15]。本研究通過SSR分子標(biāo)記和表型性狀分析2種方法對貴州地方26份高粱種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行研究。對兩種聚類結(jié)果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，聚類結(jié)果相似，分子標(biāo)記聚類方法將26份參試高粱材料分為四個類群，第Ⅰ類群的材料包含在表型性狀聚類的第Ⅱ類群和第Ⅲ類群中，第Ⅱ類群的材料與表型性狀聚類的第Ⅰ類群完全相同，第Ⅳ類群的材料包含了表型性狀聚類的第Ⅳ類群和第Ⅴ類群。但兩種聚類方法又有所不同，分子標(biāo)記的第Ⅲ類群單獨(dú)聚為一類，與表型聚類結(jié)果不同，第Ⅳ類群中有一個材料與表型性狀聚類結(jié)果完全不同，原因在于表型性狀是基因型和環(huán)境互作的結(jié)果，基因在品種引種、選配過程中受環(huán)境和人為因素等外部條件影響會產(chǎn)生表達(dá)差異，這與趙文杰等[16]研究結(jié)果一致。

分子標(biāo)記結(jié)果顯示，每對SSR引物平均檢測到2個等位基因，其平均H為0.39，平均PIC為0.31，與田承華等[1]、王芳等[13]的研究結(jié)果相比，所檢測到的平均SSR位點及PIC均偏低，可能與本研究供試的高粱種質(zhì)資源較少且遺傳基礎(chǔ)狹窄有關(guān)。表型性狀分析結(jié)果顯示，株高對高粱穗粒重和千粒重有重要影響，穗粒重與千粒重呈極顯著正相關(guān)，表明在適當(dāng)范圍內(nèi)增加植株高度可以提高高粱產(chǎn)量，這一結(jié)果與高杰等[17]研究結(jié)果一致。

本研究目的在于通過分子標(biāo)記和表型性狀兩方面對貴州地方高粱種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，為后續(xù)高粱的雜交親本選配和分子標(biāo)記輔助育種提供參考，但由于供試材料較少，只能提供少數(shù)種質(zhì)的參考，若需要了解更多品種間的遺傳多樣性及親緣關(guān)系，則需要進(jìn)一步研究。