氨基酸輔助合成棒狀羥基磷灰石及其載銀抑菌性能的研究

王建榮 陳金弟

摘要：羥基磷灰石是一種磷酸鈣生物陶瓷， 與人體自然骨和牙齒等硬組織中的無(wú)機(jī)質(zhì)在化學(xué)成分和晶體結(jié)構(gòu)上具有相似性，是一類重要的骨修復(fù)材料。本文以CaCl2·2H2O、NaH2PO2·2H2O為原料合成羥基磷灰石，以L-胱氨酸為表面修飾劑對(duì)羥基磷灰石進(jìn)行表面修飾，將納米銀負(fù)載在其表面。通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度法研究載銀后羥基磷灰石的抑菌性，并通過(guò)X射線衍射（XRD），掃描電鏡（SEM），紅外光譜（FT-IR）對(duì)樣品的結(jié)構(gòu)與成分進(jìn)行表征分析。結(jié)果顯示，用氨基酸修飾后得到的羥基磷灰石顆粒呈棒狀，尺寸均勻，負(fù)載納米銀前后結(jié)構(gòu)沒(méi)有發(fā)生變化，通過(guò)抑菌實(shí)驗(yàn)表明在其表面負(fù)載納米銀后，材料的抑菌性得到極大改善，從而大大提高了醫(yī)學(xué)使用價(jià)值。因此，載銀后的棒狀羥基磷灰石在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵字：? 羥基磷灰石? 生物復(fù)合材料? 表面修飾 抑菌性

1.前言

羥基磷灰石（Hydroxyapatite，HA）是天然骨的主要無(wú)機(jī)成分，其基本單元是羥基磷灰石晶體，長(zhǎng)度為20-40 nm。厚度為1.5-3nm[1]。HA具有良好的生物活性和生物相容性，植入人體后能在短時(shí)間內(nèi)與人體的軟硬組織形成緊密結(jié)合，是一種性能非常優(yōu)良的骨修復(fù)材料[2]。臨床研究證明，羥基磷灰石顆粒過(guò)松散，不能凝結(jié)成形，使用時(shí)操作極為不便，在骨創(chuàng)面易發(fā)生植入材料的流失，且力學(xué)性能較差，抗彎強(qiáng)度和斷裂韌性指標(biāo)均低于人體致密骨，限制了它們單獨(dú)在人體負(fù)重部位的使用[3]。本文對(duì)表面修飾劑修飾后的羥基磷灰石進(jìn)行研究。

2. 實(shí)驗(yàn)部分

2.1.羥基磷灰石復(fù)合材料的制備

（1）羥基磷灰石的制備

稱取適量3.7435g NaH2PO2·2H2O溶于12ml水中，再取8.7645gCaCl2·2H2O加入上述溶液，（按比例稱取CaCl2·2H2O、NaH2PO2·2H2O，使得Ca/P的比例為1.67）待其完全溶解后配置一定濃度的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH=9，在磁力攪拌器上攪拌24h，燒杯口用保鮮膜密封。將上述的反應(yīng)產(chǎn)物至于鼓風(fēng)干燥箱里干燥，完全干燥后在研缽中研細(xì)，再在馬弗爐中900℃煅燒45min。

（2）羥基磷灰石的表面修飾

稱取適量3.7435g NaH2PO2·2H2O溶于12ml水中，再取8.7645gCaCl2·2H2O加入上述溶液，（按比例稱取CaCl2·2H2O、NaH2PO2·2H2O，使得Ca/P的比例為1.67）待其完全溶解后配置一定濃度的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH=9，在加入適量L-胱氨酸后充分?jǐn)嚢?，在磁力攪拌器上攪?4h，燒杯口用保鮮膜密封。將上述的反應(yīng)產(chǎn)物至于鼓風(fēng)干燥箱里干燥，完全干燥后在研缽中研細(xì)，再在馬弗爐中900℃煅燒45min。

（3）負(fù)載納米銀

取上述產(chǎn)物0.9085g溶于一定量的蒸餾水中，置于超聲清洗器中超聲30min，在冰浴中冷卻至4℃，按5：1稱取AgNO3溶于水中配成溶液加入上述溶液中;取0.1319gNaBH4溶于20ml水中（水的溫度應(yīng)控制在4℃），用膠頭滴管緩慢將NaBH4溶液加入使其在40min內(nèi)滴完。

將反應(yīng)后的混合液轉(zhuǎn)移至離心管中進(jìn)行離心，將下層沉淀用水清洗兩遍后于真空干燥箱中干燥，待完全干燥后密封保存。

3.分光光度法測(cè)抑菌性

用移液槍移取60ml的液體培養(yǎng)基于2個(gè)錐形瓶中，經(jīng)高壓滅菌鍋滅菌后，用接種環(huán)取少量菌放于錐形瓶中，恒溫培養(yǎng)一段時(shí)間，即得到二代菌液（以上操作均在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行）。

用移液槍分別移取40ml的液體培養(yǎng)基于6個(gè)錐形瓶中，編號(hào)為1、2、3、4、5、6，用報(bào)紙密封后置于高壓滅菌鍋滅菌。然后放到凈化臺(tái)中待用。

其中，將未加入藥品的1、4組為對(duì)照組，將6個(gè)錐形瓶用棉塞塞緊，置于37℃的恒溫振蕩器中培養(yǎng)，每隔30min取上清液測(cè)一次OD600，在測(cè)定過(guò)程中，盡量避免培養(yǎng)液在空氣中的暴露時(shí)間。記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，然后以O(shè)D600 為縱坐標(biāo)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。

4.結(jié)果與分析

4.1 紅外光譜分析（FT-IR）

圖1為樣品的紅外光譜圖，如圖所示，三組樣品的紅外光譜的波形相似，譜中主要峰的位置相同。譜線a與b在3431、1631、1084、1049、608、561 cm-1等位置出現(xiàn)了較強(qiáng)的峰，其中1631、608、561cm-1處為強(qiáng)而窄的峰。c曲線與其他兩條不同，雖然出峰位置相同，但是在再3431cm-1處為寬而弱的峰。理論上，PO4-3有四種振動(dòng)方式，分別在紅外光譜中會(huì)出現(xiàn)四組峰，v1峰在960 cm-1附近，ν2峰位于470-440 cm-1區(qū)域，ν3位于1190-976 cm-1 區(qū)域，ν4峰位于600-560 cm-1區(qū)域[4]。因此，561、608、1049和1084 cm-1的強(qiáng)峰是nHA中PO4-3產(chǎn)生的特征峰。1631 cm?1處特征峰是H2O的振動(dòng)峰，表明粉末樣品表面吸附少量的水分。3431cm?1 位置的峰可能歸因于樣品中的-OH、-NH2、H2O等，譜線b在3431 cm-1處的峰寬而強(qiáng)，-NH2的特征峰理論上在1400-1420 cm?1區(qū)間，可能的原因是經(jīng)過(guò)煅燒后樣品表面的氨基酸沒(méi)有被煅燒完全或者是氨基酸在表面轉(zhuǎn)化-NH4+，但是在譜圖1400-1420 cm?1區(qū)間內(nèi)中沒(méi)有出現(xiàn)峰，說(shuō)明LC-HA樣品中大量的氨基酸在煅燒后被除去，。譜線c中在3431 cm-1、1631 cm?1的峰與b、c相比，強(qiáng)度較弱，說(shuō)明Ag- LC-HA中的結(jié)晶水含量較少。

4.2掃描電鏡譜圖分析

圖2為羥基磷灰石（HAP）、用L-胱氨酸表面修飾后的羥基磷灰石LC-HA （HAP-Aa）、負(fù)載了納米銀的羥基磷灰石（Ag- LC-HA） 的掃描電鏡，從圖a可以看出羥基磷灰石的形貌均一，尺寸均勻。圖b用L-胱氨酸表面修飾后的羥基磷灰石的形狀趨向于長(zhǎng)為40-60nm，寬為20nm的棒狀，說(shuō)明L-胱氨酸作為表面修飾劑修飾的效果比較好。圖c為將納米銀負(fù)載在LC-HA表面，可以觀察到納米銀顆粒附著在Ag-HA的表面，且分布稀疏。與圖b相比，其棒狀的結(jié)構(gòu)沒(méi)有發(fā)生變化，說(shuō)明載銀前后對(duì)羥基磷灰石的結(jié)構(gòu)并未產(chǎn)生影響。

4.3 X射線衍射（XRD）

圖3為羥基磷灰石（HA）、用L-胱氨酸表面修飾后的羥基磷灰石（LC-HA）、負(fù)載了納米銀的羥基磷灰石（Ag- LC-HA）的X衍射圖譜。圖中a、b、c譜線在2θ為25.7、32、33、47、50附近均出現(xiàn)衍射峰，理論上，羥基磷灰石的XRD圖譜中，2θ=25.7、31.6、32.7、33.8、40、47.1、49.8、53，表示一個(gè)完整的羥基磷灰石結(jié)構(gòu)[5-8]，說(shuō)明三組樣品中均含有羥基磷灰石晶體。a、b中譜線X射線衍射峰較弱且峰形相似，說(shuō)明此時(shí)結(jié)晶程度較差，用L-胱氨酸表面修飾后樣品的本身結(jié)構(gòu)沒(méi)有變化，表面改性只是發(fā)生在納米材料的表面，只是表面形貌發(fā)生了變化。經(jīng)查PDF卡片[8]可知，銀的衍射峰大約2θ為28、34、37、43處，c中譜線較為尖銳，說(shuō)明其結(jié)晶程度較好。

4.4抑菌性實(shí)驗(yàn)分析

圖4細(xì)菌生長(zhǎng)曲線，細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)呈現(xiàn)S形對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，包含四個(gè)階段，即誘導(dǎo)期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期、衰減期。生長(zhǎng)曲線直觀的反映了細(xì)菌的量隨時(shí)間而變化的過(guò)程與規(guī)律，同時(shí)包含了許多種群生態(tài)學(xué)的信息與特征。根據(jù)生長(zhǎng)曲線可以求出瞬時(shí)生長(zhǎng)率，利用生長(zhǎng)曲線的變化可以揭示藥物的抑菌效果，反映微生物群體生長(zhǎng)規(guī)律，從生長(zhǎng)曲線可知微生物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)快慢程度、微生物對(duì)培養(yǎng)基成分的利用情況、藥物中不同成分對(duì)微生物產(chǎn)生的不同作用以及藥物最強(qiáng)與最弱的時(shí)間等多種有意義的信息。

根據(jù)圖中細(xì)菌生長(zhǎng)曲線，對(duì)羥基磷灰石表面修飾后其抑菌性能并沒(méi)有變化，說(shuō)明L-胱氨酸對(duì)羥基磷灰石修飾后的產(chǎn)物沒(méi)有抑菌性能，將納米銀負(fù)載到其表面后，細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線趨近于直線，液體培養(yǎng)基中的細(xì)菌數(shù)量沒(méi)有變化，說(shuō)明負(fù)載了銀后的樣品可以作為一種新型的材料運(yùn)用到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

5.結(jié)論

通過(guò)化學(xué)沉淀法，以CaCl2·2H2O、NaH2PO2·2H2O為原料制備得到羥基磷灰石，添加L-胱氨酸后得到的樣品在馬弗爐中900℃煅燒45min后，有利于獲得尺寸均勻，形狀為棒狀的納米羥基磷灰石顆粒。表征后證實(shí)L-胱氨酸并不存在于樣品中，說(shuō)明經(jīng)過(guò)熱處理后L-胱氨酸被完全除去了。通過(guò)化學(xué)還原法在棒狀納米羥基磷灰石表面負(fù)載納米銀，其中以NaBH4為還原劑，AgNO3為反應(yīng)前軀體得到納米銀溶膠，然后將納米銀溶膠轉(zhuǎn)移到用L-胱氨酸修飾后的羥基磷灰石的表面上，載銀前后羥基磷灰石的結(jié)構(gòu)基本沒(méi)有發(fā)生改變， Ag+部分吸附在 HA表面或進(jìn)入HA晶格， 取代了Ca2+， 另一部分形成了Ag3PO4晶體。在細(xì)菌生長(zhǎng)環(huán)境中加入負(fù)載了銀的藥品后，細(xì)菌生長(zhǎng)曲線趨近于直線，表明細(xì)菌在添加了載銀羥基磷灰石后的培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)被抑制，表明復(fù)合材料對(duì)于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有很強(qiáng)的抗菌性能。

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