黑磷納米片應(yīng)用及生物毒性研究進(jìn)展

向思靚，曾潔，阮鋒凱，左正宏，何承勇

廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，細(xì)胞應(yīng)激生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門 361102

黑磷(black phosphorus, BP)是納米材料家族的新成員，主要包括黑磷量子點(diǎn)(black phosphorus quantum dot, BPQD)、黑磷納米顆粒(black phosphorus nanoparticle, BPNP)和黑磷納米片(black phosphorus nanosheet, BPNS)。2014年，Li等[1]將二維層狀BPNS從塊狀黑磷(Bulk-BP)中剝離出后，便引起了研究人員的廣泛關(guān)注。BPNS是二維結(jié)構(gòu)材料，由單原子層厚度的納米片堆積而成。BPNS的層狀結(jié)構(gòu)賦予其較大表面積，有利于在醫(yī)學(xué)上用于藥物運(yùn)載[2]。BPNS可通過機(jī)械剝離[3]、液相剝離[4]或電化學(xué)剝離[5]等方法制備。隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展和人們對BP材料的研究深入，BPNS在生產(chǎn)生活中的應(yīng)用會愈加廣泛，我們可能頻繁接觸到BPNS，或使用BPNS制成的藥物，因此，有必要深入了解BPNS對人體和生物體潛在的影響。近期Qu等[6]全面詳細(xì)地綜述了BP相關(guān)研究進(jìn)展，從BP的物理化學(xué)特性、合成、鈍化、生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，到BP與生物分子、細(xì)胞、動物間的相互作用，以及BP潛在的生態(tài)風(fēng)險和BP的改性修飾。這篇綜述對BP納米材料實(shí)驗(yàn)研究的開展及未來發(fā)展方向，提供了重要的指導(dǎo)。本文主要關(guān)注和論述BPNS的生物毒性研究進(jìn)展，試圖更詳細(xì)地分析BPNS對人體和環(huán)境生物的影響，闡述BPNS生物安全性研究的現(xiàn)狀與不足，為將來的研究提供方向和思路。

本文首先簡要介紹BPNS在電子、光電、電化學(xué)、環(huán)境和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用前景，并從BPNS的環(huán)境危害和健康危害的角度進(jìn)行綜述。通過對環(huán)境生物包括細(xì)菌及單細(xì)胞水生生物的毒性檢測，來評估BPNS潛在生態(tài)風(fēng)險。通過對哺乳動物體內(nèi)外毒理實(shí)驗(yàn)綜述，以期評估BPNS對人類的健康風(fēng)險。由于哺乳動物的結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜、生命周期更長，BPNS與其之間的相互作用更加繁雜。但不管是哺乳動物還是單細(xì)胞生物，BPNS對它們的毒性機(jī)制可能存在一定的相似之處，比如BPNS與生物膜界面的相互作用方式、BPNS體內(nèi)降解產(chǎn)物誘發(fā)毒性損傷等。本文重點(diǎn)論述國內(nèi)外在BPNS生物毒性方面的研究進(jìn)展，為開發(fā)應(yīng)用更加安全、更加環(huán)境友好的BP納米材料提供科學(xué)依據(jù)。

1 BPNS的結(jié)構(gòu)性能及應(yīng)用(Structural performance and application of BPNS)

1.1 BPNS的結(jié)構(gòu)性能

BP屬于磷的一種同素異形體，相比于白磷和紅磷，它的活性較弱，在空氣中不易自燃，比較穩(wěn)定[7]。BP晶體具有層狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)是由正交晶體中的褶皺六邊形環(huán)組成[8]。而BPNS是BP的單層或幾層形式，在其層狀結(jié)構(gòu)中，每個磷原子都與相鄰的3個磷原子通過共價鍵結(jié)合，從而形成了沿鋸齒狀方向的雙層結(jié)構(gòu)和沿扶手椅方向的皺縮結(jié)構(gòu)。層間靠范德華力維系[9]。這種結(jié)構(gòu)對于BPNS的光學(xué)特性、力學(xué)特性、導(dǎo)電性能以及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)都有重要影響。

相比其他二維材料，BPNS擁有獨(dú)特的優(yōu)勢。石墨烯近10年來發(fā)展迅速，但其零帶隙結(jié)構(gòu)特點(diǎn)限制了石墨烯在半導(dǎo)體領(lǐng)域的應(yīng)用[10]。而BPNS的帶隙取決于它的層數(shù)，可剝離成少數(shù)幾層，故它擁有可調(diào)節(jié)的帶隙寬度，若應(yīng)用于光電設(shè)備，可優(yōu)化設(shè)計，提高靈活性[11]。BPNS在平面內(nèi)還有極高的各向異性，可應(yīng)用于生物傳感[12]。同時，BPNS能夠廣泛吸收可見光、紅外光以及紫外光，擁有優(yōu)異的光學(xué)性能[13]。BPNS還有很高的開關(guān)電流比，可應(yīng)用于場效應(yīng)晶體管傳感[14]。相比于MoS2，BPNS有很高的載流子遷移率，可應(yīng)用于氣體傳感器等領(lǐng)域[14]。此外，BPNS還擁有很高的生物相容性，在體內(nèi)可降解為對人體無害的磷酸鹽，這是其他無機(jī)納米材料所不具備的，具有應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的良好前景。總的來說，BPNS具有直接帶隙、高度各向異性、廣譜光吸收性、高開關(guān)電流比、高載流子遷移率和高生物相容性等優(yōu)點(diǎn)。因此，BPNS在電子、光電、電化學(xué)、環(huán)保和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景(圖1)。

圖1 黑磷納米片(BPNS)結(jié)構(gòu)及應(yīng)用領(lǐng)域Fig. 1 The structure and applications of black phosphorus nanosheet (BPNS)

1.2 BPNS的應(yīng)用

1.2.1 BPNS在電子、光電及電化學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

在2014年，新型的BPNS二維半導(dǎo)體材料出現(xiàn)后，由于其場效應(yīng)與硅相似，有望代替硅，應(yīng)用于制作場效應(yīng)晶體管。研究發(fā)現(xiàn)，BPNS場效應(yīng)管可進(jìn)行雙極操作[15]，優(yōu)化傳輸性能[16]。另外，納米BPNS對周圍環(huán)境非常敏感，當(dāng)處于氣體環(huán)境或有氣體吸附其上時，電阻率會發(fā)生變化，因此可用于制備氣體傳感器[17-18]。

由于有可調(diào)帶隙，BPNS吸收能量后，可以光子形式將能量再釋放出來。因此，BPNS能夠高效地將電信號轉(zhuǎn)化為光信號。BPNS還可廣泛吸收紅外光、可見光以及紫外光，可制備優(yōu)良的光電元件[19-20]。

BPNS的可調(diào)帶隙特性使得它還可作為電化學(xué)裝置中的電極材料。以BPNS作為電極材料，制備的超級電容器，具有快速的充電/放電速率，高功率密度以及長循環(huán)壽命等優(yōu)勢[21]。BPNS也可用于鋰離子電池的陽極，如此制得的電池具有高容量、高導(dǎo)電性和長壽命[22]。

1.2.2 BPNS在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

由于BPNS尺寸較小，它可以利用腫瘤的增強(qiáng)滲透滯留效應(yīng)，在腫瘤部位富集。同時，相比于小分子藥物，BPNS又不至于因?yàn)槌叽缣《荒I臟過濾排出[2]。除此之外，由于BPNS的本質(zhì)是磷元素，而磷元素是生物體的大量元素之一，故BPNS擁有出色的生物相容性。BPNS還擁有良好的光敏和光動力特征。因此，BPNS在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域擁有巨大的應(yīng)用前景。

BPNS被光照射后，能將其吸收的光子能量以熱能形式散發(fā)，然后引起溫度迅速升高。而當(dāng)溫度升高到一定時，腫瘤細(xì)胞可被誘導(dǎo)凋亡。因此BPNS可制成高效的光熱制劑，用于光熱療法(photothermal therapy, PTT)。通過對腫瘤細(xì)胞BPNS富集部位局部照射，抑制腫瘤的生長，同時減少周圍正常細(xì)胞的損傷[23-24]。BPNS還可以制成光敏劑，用于光動力治療(photodynamic therapy, PDT)。研究表明，在整個可見光區(qū)域里，超薄BPNS在腫瘤細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species, ROS)[25]，進(jìn)一步抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡。相比其他光敏劑，BPNS所需量更少，產(chǎn)生ROS需要光照時間更短[26]。更重要的是，BPNS在光照下可以轉(zhuǎn)化為生物相容性良好的磷酸鹽化合物，生物殘留少。另外，在Yang等[27]研究中，BPNS可與糖酵解抑制劑協(xié)同作用，可以抑制自噬和能量代謝，有望在腫瘤饑餓治療中發(fā)揮重要作用。

由于BPNS的比表面積大，它還可以作為藥物載體，與帶正電的小分子藥物結(jié)合。相比其他二維納米材料，BPNS載藥量較大[28]。而且，在酸性腫瘤微環(huán)境下，BPNS能快速釋放藥物；以BPNS作為藥物載體，還可保持藥物的穩(wěn)定狀態(tài)且對生物體副作用較小[29-30]。

研究表明，BPNS可用于治療金屬離子濃度過高導(dǎo)致的神經(jīng)退行性疾病。由于BPNS可以選擇性地捕獲Cu2+，降低神經(jīng)毒性。而且在近紅外光(near infrared, NIR)照射下，BPNS透過血腦屏障比例顯著提高，還能抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡[31]。BPNS所制成的復(fù)合支架在輕度氧化應(yīng)激刺激下，可誘導(dǎo)血管和神經(jīng)生成，促進(jìn)軸突伸長和髓鞘增厚[32]。除了神經(jīng)損傷修復(fù)以外，BPNS還可用于骨再生[33]，修復(fù)腫瘤引起的骨缺損；還可作為傷口敷料，在NIR照射下，能顯著促進(jìn)傷口愈合和皮膚再生[34]。

1.2.3 BPNS在環(huán)境與能源領(lǐng)域的應(yīng)用

太陽能產(chǎn)氫是綠色環(huán)保的新方法，但需要非常高效的光催化劑。BPNS具有可調(diào)帶隙和高載流子遷移特性，可利用以BPNS為原料設(shè)計的光催化劑來實(shí)現(xiàn)電子有效遷移，驅(qū)動水分解反應(yīng)[35]。BPNS經(jīng)過可見光和NIR活化，可催化氫氣產(chǎn)生，快速析出氫氣[36-37]。BPNS作為光催化劑，還可用于污染物降解，解決環(huán)境污染問題[38-40]。

2 BPNS的環(huán)境危害(Environmental hazard of BPNS)

2.1 BPNS對細(xì)菌毒性

Xiong等[41]研究了BPNS對2種模式細(xì)菌——大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的毒性，結(jié)果表明，BPNS的毒性呈現(xiàn)時間和劑量依賴性。當(dāng)BPNS濃度為100 μg·mL-1時，其對大腸桿菌的殺菌效果最大可達(dá)91.65%，對枯草芽孢桿菌可達(dá)99.69%。相比于枯草芽孢桿菌，BPNS處理6 h時對大腸桿菌的毒性更強(qiáng)，隨后毒性減弱。其原因可能是大腸桿菌的細(xì)胞壁相較薄，對BPNS更敏感，在更早期就表現(xiàn)出毒性反應(yīng)。另外，由于大腸桿菌外膜有自我修復(fù)能力，使得毒性部分逆轉(zhuǎn)，隨著暴露時間推移BPNS對大腸桿菌的毒性降低。BPNS的殺菌機(jī)制主要是產(chǎn)生ROS和破壞細(xì)胞膜。Ouyang等[42]用銀納米粒子(Ag nanoparticles, AgNP)修飾BPNS，構(gòu)建了Ag@BP納米雜化物。Ag@BP經(jīng)NIR照射，可在短時間內(nèi)通過局部高溫殺死金黃色葡萄球菌，顯示出良好的殺菌能力。

2.2 BPNS對水生單細(xì)胞生物毒性

綜上所述，BPNS對于環(huán)境生物具有較顯著的毒性，可破壞生物膜結(jié)構(gòu)，甚至導(dǎo)致死亡。其次，BPNS會通過吞噬內(nèi)在化或降解成磷酸鹽，干擾水生生物的正常生長、代謝和繁殖等，以上研究表明BPNS對環(huán)境生物具有毒性效應(yīng)，可能對生態(tài)環(huán)境造成不良影響(表1)。

表1 BPNS對環(huán)境生物的毒性Table 1 Toxicity of BPNS on environmental organisms

3 BPNS健康危害(Health risks of BPNS)

納米材料尺寸較小，易穿透各種屏障。但同時，納米材料在人體內(nèi)半衰期長、不易被清除，容易積累在特定的細(xì)胞或組織，可能對機(jī)體造成損害。而且，納米材料的組成、橫向尺寸、厚度、表面功能化和晶體結(jié)構(gòu)等都能影響其在生物界面上的作用[45]。BPNS由于其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域被寄予厚望。隨著BPNS將來廣泛應(yīng)用，BPNS對哺乳動物毒性研究是必不可少的。

3.1 BPNS體外毒性

BPNS毒性主要集中在體外細(xì)胞毒性研究。我們將主要從BPNS的細(xì)胞毒性及修飾對細(xì)胞毒性影響進(jìn)行論述。

Qiu等[46]為了檢測BPNS細(xì)胞毒性，用不同濃度BPNS處理MDA-MB-231、A549、HeLa和B16這4種細(xì)胞，結(jié)果顯示，即使在200 μg·mL-1高濃度下，也幾乎沒有觀察到毒性作用。Chen等[28]將BPNS與紅細(xì)胞共培養(yǎng)8 h，溶血率<5%；然后又測試了BPNS對4T1、HeLa、L929和A549這4種細(xì)胞的毒性，發(fā)現(xiàn)當(dāng)BPNS濃度高達(dá)200 μg·mL-1時，也幾乎沒有毒性作用。相反地，Latiff等[47]將不同濃度BPNS處理A549細(xì)胞，BPNS細(xì)胞毒性具有劑量依賴性，50 μg·mL-1BPNS可將細(xì)胞存活率降至48% (WST-8法檢測)和34% (MTT法檢測)，細(xì)胞毒性介于石墨烯和MoS2之間；他們還觀察到，高濃度的BPNS由于對光具有顯著的吸收作用，對WST-8和MTT這類通過檢測吸光度值的實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在干擾。在后續(xù)研究中[48]，比較了磷其他同素異形體(紫磷和紅磷)，以及氣相生長的BP (BP VPG)和高壓轉(zhuǎn)化的BP (BP HPC)細(xì)胞毒性，發(fā)現(xiàn)BP細(xì)胞毒性較紫磷和紅磷更高，較薄的BP HPC比BP VPG毒性大，另外氧化比例高的磷材料毒性更大。

Zhang等[49]的研究證明BPNS的細(xì)胞毒性還有材料尺寸大小和靶細(xì)胞類型依賴性。橫向尺寸和厚度最大的BPNS表現(xiàn)出最強(qiáng)細(xì)胞毒性，而尺寸過大的BPNS可直接破壞細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物釋放，甚至細(xì)胞死亡。并且不同細(xì)胞系敏感性有所差異，該實(shí)驗(yàn)中對BPNS的敏感度順序?yàn)?93T>NIH3T3>HCoEpiC。Song等[50]研究了BPNS對成纖維細(xì)胞L-929的毒性，結(jié)果表明，毒性與BPNS濃度及暴露時間成比例，且毒性機(jī)制是氧化應(yīng)激介導(dǎo)的代謝活性降低與膜完整性破壞。Sun等[51]的BPNS體外研究結(jié)果表明，BPNS會降低人支氣管上皮細(xì)胞活力，且具有時間和劑量依賴性。機(jī)制研究表明，BPNS會降低線粒體電位，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS增加，進(jìn)而活化caspase-3，引起細(xì)胞凋亡。

另外，Mo等[53]的研究證明，血漿蛋白會吸附到BPNS上，形成BP納米材料-蛋白冠復(fù)合物，這會影響巨噬細(xì)胞的攝取，且復(fù)合物激活了NF-κB通路，使得促炎細(xì)胞因子分泌增加，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的促炎和免疫干擾作用。為了進(jìn)一步開發(fā)可有效用于生物醫(yī)學(xué)的BPNS，后續(xù)應(yīng)更加關(guān)注BPNS的修飾，控制蛋白冠的形成。另一方面，Zhang等[54]研究了BPNS與牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)和牛血紅蛋白(bovine hemoglobin, BHB)的結(jié)合機(jī)理，結(jié)果表明，BPNS抑制了BSA和BHB的固有熒光，誘導(dǎo)了蛋白質(zhì)肽鏈的延伸，改變了BHB的三級結(jié)構(gòu)，破壞了BHB與膽紅素的結(jié)合域。Tao等[55]的研究表明，聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)修飾的BPNS可使自噬體數(shù)量顯著增加，誘導(dǎo)癌細(xì)胞自噬。

在環(huán)境條件下，BPNS較不穩(wěn)定性，對氧氣和水具有很高的反應(yīng)性，導(dǎo)致化學(xué)變化、發(fā)生降解[56]。BPNS降解速率也影響它的毒性，而降解速率與BPNS的厚度和表面修飾關(guān)系密切，較薄的BPNS降解速度更快[57]。目前，針對BPNS的不穩(wěn)定性，研究人員已從多個方面進(jìn)行改良。例如，Zhao等[58]使用幾種不同的離子溶液，再結(jié)合研磨與超聲處理，剝離到厚度分別為3.58、5.50和8.90 nm的多層BPNS。Zhao等[56]將磺酸鈦配體(TiL4)用于BPNS的表面配位，配位后的BPNS在水環(huán)境中或長期暴露于空氣時，均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，顯著延長了BPNS壽命。Qu等[59]的研究表明，TiL4配位的BPNS可逃避巨噬細(xì)胞的攝取，并減少細(xì)胞毒性和抑制促炎作用。還有聚多巴胺[60]、尼羅藍(lán)染料[61]等也被應(yīng)用于BPNS的表面修飾，增強(qiáng)其穩(wěn)定性。

細(xì)胞毒性機(jī)制可能是BPNS誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS，進(jìn)而致使其凋亡，還可破壞生物膜的完整性。而且BPNS進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，還可能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。除此之外，BPNS可形成蛋白冠影響免疫細(xì)胞的功能，還可導(dǎo)致某些特定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變。

總而言之，BPNS的體外毒性呈現(xiàn)出劑量、時間、尺寸以及靶細(xì)胞類型依賴性，且與BPNS降解速率相關(guān)。為了更加準(zhǔn)確地測定BPNS毒性，需要運(yùn)用多種標(biāo)準(zhǔn)方法綜合評價其體外毒性，以減少不同方法間的系統(tǒng)誤差。研究細(xì)胞毒性時，為了減少細(xì)胞敏感性差異，還需要采用多種細(xì)胞系綜合判定。而且，有必要區(qū)別BPNS對腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的影響，如果BPNS在治療腫瘤方面應(yīng)用，應(yīng)對腫瘤細(xì)胞有較好的抑制作用，而對正常細(xì)胞的影響可忽略不計[62]。目前，納米材料體外毒性評價主要是利用二維培養(yǎng)的細(xì)胞系，可以利用原代細(xì)胞[63]、干細(xì)胞[64]、誘導(dǎo)性多潛能細(xì)胞[65]，以及類器官等模型進(jìn)行毒性評估。其中，類器官在體外環(huán)境下培育形成，具備類似真實(shí)器官的三維結(jié)構(gòu)，能部分模擬來源組織或器官的生理功能，類器官比二維培養(yǎng)細(xì)胞更具代表性，具有類似組織的三維結(jié)構(gòu)和細(xì)胞間相互作用，維持細(xì)胞對藥物、污染物的代謝能力，因此在納米材料生物安全性評價等方面具有誘人的應(yīng)用前景[66]。我們前期成功構(gòu)建出小鼠腎類器官，并利用它篩選發(fā)現(xiàn)BPQD具有腎臟毒性，其敏感性顯著高于二維培養(yǎng)的人近曲小管上皮細(xì)胞株HK-2，同時還發(fā)現(xiàn)BPQD會引起胰島素敏感度下降以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。類器官將來也可應(yīng)用于BPNS生物安全性評價和毒性機(jī)制研究[67]。針對不同尺寸、電荷和修飾的納米材料，需要充分比較這些物理化學(xué)特征及其對BPNS毒性影響，可以運(yùn)用計算毒理學(xué)的技術(shù)手段找到影響生物安全性的關(guān)鍵影響因素。關(guān)于BPNS毒性效應(yīng)機(jī)制的研究，需要區(qū)分是BPNS本身還是其降解產(chǎn)生的磷酸鹽導(dǎo)致的毒性[43]。此外，僅僅有體外毒性評價遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，需要進(jìn)行開展體內(nèi)暴露實(shí)驗(yàn)，才能更全面的評價BPNS的生物安全性。表2歸納了相關(guān)文獻(xiàn)中有關(guān)BPNS的細(xì)胞毒性的實(shí)驗(yàn)及結(jié)論。

表2 BPNS對不同細(xì)胞的毒性Table 2 Toxicity of BPNS to different cells

3.2 BPNS體內(nèi)毒性

關(guān)于BPNS的體內(nèi)暴露實(shí)驗(yàn)較少，對于其體內(nèi)毒性效應(yīng)還不甚清楚。本文也將從目前僅有的BPNS毒性效應(yīng)和機(jī)制進(jìn)行論述。

Shao等[68]制備了結(jié)合BPNS的溫度敏感水凝膠(BP@PLEL)，可用于PTT治療癌癥。單次皮下注射BP@PLEL到小鼠的背部，20 d后，主要器官無明顯病變。Chen等[28]在給健康小鼠單次注射BPNS，7 d后未檢測到肝腎功能的明顯變化。Jin等[69]合成了負(fù)載有藥物氟西汀(fluoxetine, Flu)的BPNS用來治療抑郁癥，體內(nèi)毒性研究結(jié)果顯示，小鼠的血液生化指標(biāo)均正常，肝腎功能無顯著變化。Hou等[70]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BPNS會優(yōu)先積累在腎臟，在生物體內(nèi)最終降解為PxOy離子，對心、肝、脾、肺和腎均無明顯損傷。Sun等[71]向小鼠靜脈注射100 μg PEG修飾的BPNP，通過組織病理學(xué)分析，沒用觀察到明顯的器官損傷。然而在Sun等[51]的研究中，單次注射的BPNS(20 mg·kg-1)對小鼠器官沒有明顯損傷，但當(dāng)3次注射BPNS后，小鼠的肝臟和腎受損，不過一定時間后可恢復(fù)正常。Kong等[72]的研究表明，低劑量時BPNS可用于抑制腫瘤和藥物負(fù)載，當(dāng)小鼠靜脈注射過高劑量的BPNS(30 mg·kg-1)時，肝臟與腎臟內(nèi)的ROS增加，并觀察到水腫現(xiàn)象，炎性細(xì)胞浸潤導(dǎo)致的凝固性壞死，淋巴細(xì)胞浸潤，腎小球萎縮以及腎小管腫脹。在表3中歸納了以上關(guān)于BPNS急性暴露后體內(nèi)毒性損傷效應(yīng)。

表3 BPNS體內(nèi)毒性Table 3 In vivo toxicity of BPNS

總體而言，目前BPNS體內(nèi)毒性試驗(yàn)一般都是單次急性暴露，大部分結(jié)果顯示BPNS相對比較安全，但劑量過高會引起組織損傷和炎癥反應(yīng)。另外，Qu等[59]發(fā)現(xiàn)當(dāng)給小鼠按500 μg·kg-1靜脈注射暴露于BPQD后，短時間內(nèi)會出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，例如嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量增加，一部分炎癥細(xì)胞因子濃度升高。長時間后癥狀消失。Mu等[73]評估了BPQD對機(jī)體的毒性，其體內(nèi)研究表明，BPQD可短暫地誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)和脂質(zhì)過氧化，降低過氧化氫酶活性，誘發(fā)DNA斷裂以及骨髓有核細(xì)胞損傷，但這些損傷可逐漸恢復(fù)。這些BPQD相關(guān)的體內(nèi)毒性研究結(jié)果可能對于BPNS毒性研究具有一定參考價值，但是否完全相似有待后續(xù)研究比較。

然而，僅有急性毒性數(shù)據(jù)不足以全面評價BPNS生物安全性，需要繼續(xù)開展體內(nèi)急性重復(fù)暴露、亞急性、亞慢性、慢性暴露實(shí)驗(yàn)，以及遺傳毒性、生殖毒性、代謝動力學(xué)等方面實(shí)驗(yàn)。另外，目前組織病理實(shí)驗(yàn)主要是觀察肝、腎、心、肺、脾。而之前有研究表明，一些無機(jī)納米材料可對腸道或胰腺產(chǎn)生損傷，可能促進(jìn)炎癥性腸病，導(dǎo)致腸道屏障功能異常，以及影響腸膜的正常結(jié)構(gòu)，致使腸道通透性增加，損害胰腺的正常功能，從而影響代謝[74-77]。BPNS如果長期重復(fù)暴露，也可能會對腸道及胰腺產(chǎn)生不良作用。除了小鼠之外，也還需對其他模式動物如爪蟾、斑馬魚、四膜蟲和線蟲等，進(jìn)行BPNS的潛在毒性研究。

4 總結(jié)與展望(Summary and prospect)

近些年來，BPNS在很多領(lǐng)域成為熱門，與此相關(guān)的研究也日益增多。雖然BPNS在電子學(xué)、光電學(xué)、電化學(xué)、環(huán)境以及生物醫(yī)學(xué)尤其是腫瘤治療方面取得了可喜的進(jìn)展，但還必須考慮BPNS對機(jī)體以及環(huán)境可能存在的毒性效應(yīng)。影響B(tài)PNS毒性的因素有很多(圖2)，BPNS對不同類型的細(xì)胞引起的毒性效應(yīng)可能不盡相同，不同尺寸的BPNS對同種細(xì)胞的毒性效果也存在差異，文獻(xiàn)結(jié)果表明尺寸大的BPNS毒性可能更大[49]。暴露時間、材料濃度和降解速率也是影響B(tài)PNS毒性的重要因素。另外，檢測方法在一定程度上也可影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。對BPNS進(jìn)行表面修飾可改變其毒性大小，如PEG、水凝膠、聚多巴胺和TiL4等，修飾后可中和BPNS表面部分負(fù)電荷，增強(qiáng)納米材料穩(wěn)定性，降低毒性效應(yīng)。

圖2 BPNS毒性作用和毒性影響因素注：ROS表示活性氧。Fig. 2 The toxic effects of BPNS and its influencing factorsNote: ROS means reactive oxygen species.

在毒性機(jī)制方面(圖3)，BPNS可在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS，引起氧化應(yīng)激、相關(guān)酶活性下降和DNA損傷，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[51, 72]。BPNS進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)還可導(dǎo)致自噬體數(shù)量增加，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[55]。層狀的BPNS還可破壞細(xì)胞膜的完整性，釋放內(nèi)容物，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[50]。BPNS還能對免疫細(xì)胞[53]和血漿蛋白[54]產(chǎn)生影響，導(dǎo)致溶血現(xiàn)象[28]。

圖3 BPNS生物毒性機(jī)制Fig. 3 Mechanisms of BPNS’s biotoxicity

目前，關(guān)于BPNS的生物毒性和機(jī)制均未完全了解。在毒性評估過程中，細(xì)胞類型會影響B(tài)PNS毒性檢測結(jié)果，所以將來研究要以多種細(xì)胞系作為研究對象。還可以用原代細(xì)胞[63]、干細(xì)胞[64]以及類器官[65-66]等更接近人體細(xì)胞或真實(shí)體內(nèi)環(huán)境的模型，評估BPNS納米材料生物毒性效應(yīng)和作用機(jī)制。其次，在研究BPNS細(xì)胞毒性時，最好運(yùn)用多種標(biāo)準(zhǔn)的方法綜合評估，以減少不同方法間的系統(tǒng)誤差。再者，還要分析比較BPNS材料本身物理化學(xué)性質(zhì)對生物毒性的影響，例如尺寸、形狀、聚集狀態(tài)、電荷密度和帶隙等。表面修飾也會影響B(tài)PNS穩(wěn)定性和降解速率。例如，有研究通過粒子摻雜和表面鈍化等方式設(shè)計出更安全的納米材料[78]，這也為解決BPNS將來在臨床轉(zhuǎn)化中的安全性問題提供了一個思路。

動物實(shí)驗(yàn)對于全面評估BPNS毒性至關(guān)重要，現(xiàn)有關(guān)于BPNS體內(nèi)毒性研究還不夠全面、深入。(1)目前BPNS體內(nèi)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)較少，實(shí)驗(yàn)對象也局限在小鼠上，缺乏對BPNS在其他脊椎動物體內(nèi)的研究，如魚類、兩棲類等。Peng等[79]將體外建立的氧化應(yīng)激模式應(yīng)用于水生生物斑馬魚體內(nèi)，以此來評估納米顆粒對生物的潛在損傷作用。(2)BPNS缺乏急性重復(fù)、亞急性和慢性暴露實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，目前實(shí)驗(yàn)多數(shù)采取的是單次急性暴露。將來BPNS大量投入使用，人們勢必在日常生產(chǎn)、生活中通過接觸、攝入、吸入等多種方式頻繁暴露于BPNS。因此，有必要開展多種途徑、長期毒性暴露實(shí)驗(yàn)。(3)還要研究BPNS對不同器官、組織的影響，尋找BPNS的毒性靶器官，全面評估BPNS生物安全性，深入研究揭示BPNS的毒性機(jī)制。(4)在對BPNS納米材料進(jìn)行風(fēng)險評估時，應(yīng)該將暴露特征與潛在危害綜合起來分析。如同Lin等[80]總結(jié)了納米材料進(jìn)入水環(huán)境的潛在接觸途徑、納米材料的命運(yùn)、在不同介質(zhì)間的轉(zhuǎn)移，以及使用模式生物進(jìn)行的毒性測試，以此對納米材料進(jìn)行更系統(tǒng)的風(fēng)險評估。

總而言之，BPNS與生物大分子及生態(tài)環(huán)境之間的相互影響和作用機(jī)制亟待開展研究，BPNS生物安全性研究有助于其未來的安全應(yīng)用，可促進(jìn)BP納米材料的產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化，保障人群和生態(tài)環(huán)境健康。