ACT001通過(guò)抑制P65磷酸化降低膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞程序性死亡蛋白配體1的表達(dá)

張錦浩 劉沛東 張辰 李佳博 任梟 陳露露 孫錦章 王旭亞 張亮 楊學(xué)軍

膠質(zhì)瘤是臨床最常見(jiàn)的顱內(nèi)原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，其中以多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）惡性程度最高，約占原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的47.1%［1］。盡管以保護(hù)神經(jīng)功能為前提的最大范圍手術(shù)切除腫瘤，聯(lián)合術(shù)后同步放化療和替莫唑胺序貫化療，以及腫瘤電場(chǎng)治療（TTF）［2-3］的應(yīng)用可以改善預(yù)后，但遺憾的是，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者5年生存率僅為5.5%，其中位生存期也僅為14.6個(gè)月［4］，主要是由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)特有的血-腦屏障結(jié)構(gòu)和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤特殊的免疫抑制微環(huán)境所致。有研究顯示，免疫檢查點(diǎn)如細(xì)胞程序性死亡蛋白1（PD1）及其配體（PDL1）［5］、T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3（TIM-3）［6］在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中呈高表達(dá)，且與不良預(yù)后密切相關(guān)。因此，免疫治療仍是改善膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的重要策略。從白菊分離出來(lái)的小白菊內(nèi)酯（PTL）具有廣泛的抗炎癥和抗腫瘤作用［7］，但其在酸性和堿性條件下不穩(wěn)定，水溶性差，口服生物利用率低［8］，通過(guò)改進(jìn)其化學(xué)結(jié)構(gòu)獲得的含笑內(nèi)酯（MCL）及其衍生物二甲氨基含笑內(nèi)酯（DMAMCL）富馬酸鹽即ACT001，具有相對(duì)分子量低、穩(wěn)定性強(qiáng)、易溶于水、毒性作用小、血-腦屏障通透性高等優(yōu)點(diǎn)，可抑制膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)［9-10］。業(yè)已證實(shí)，PTL可以顯著抑制核因子-κB（NF-κB）和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性［11］。NF-κB作為轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)直接調(diào)控下游基因表達(dá)或與其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路交聯(lián)作用，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，已知其在乳腺癌和結(jié)腸癌中通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)以調(diào)控PDL1的表達(dá)［12-13］。鑒于此，本研究探究ACT001是否能夠通過(guò)抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性，下調(diào)PDL1表達(dá)，改善免疫抑制微環(huán)境，進(jìn)而抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤進(jìn)展。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.細(xì)胞來(lái)源 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，在天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所液氮中常規(guī)保存。

2.試劑與設(shè)備 （1）藥品與試劑：ACT001由南開(kāi)大學(xué)藥學(xué)院提供，DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，CCK-8試劑盒為上海東仁化學(xué)科技公司產(chǎn)品，Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，小干擾RNA（siRNA）由蘇州吉瑪基因股份有限公司提供，P65和兔抗人單克隆抗體（1∶200）為美國(guó)CST公司產(chǎn)品，Alexa Fluor 594標(biāo)記的驢抗兔熒光IgGⅡ抗（1∶1000）由美國(guó)Invitrogen公司提供，體積分?jǐn)?shù)為1%的TritonX-100溶液、RIPA裂解液［按1∶100比例加入蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（PMSF）和磷酸酶抑制劑］和BCA蛋白定量試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，Trizol溶液為美國(guó)Ambion公司產(chǎn)品，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）試劑盒（Master Mix試劑盒）和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品，Ⅰ抗工作液包括兔抗人P65和磷酸化P65（p-P65）單克隆抗體（1∶1000）購(gòu)自美國(guó)CST公司、兔抗人PDL1單克隆抗體（1∶1000）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司、內(nèi)參照物小鼠抗人β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體（1∶1000）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗鼠和山羊抗兔IgGⅡ抗（1∶3000）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。（2）儀器與設(shè)備：含5%二氧化碳的37℃恒溫培養(yǎng)箱由德國(guó)Heraeus公司提供，Synergy 2多功能酶標(biāo)儀由美國(guó)BioTek公司提供，IX73倒置相差熒光顯微鏡為美國(guó)Olympus公司產(chǎn)品，凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)BD公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.生物信息學(xué)分析 腫瘤基因組學(xué)圖譜計(jì)劃（TCGA）數(shù) 據(jù) 從 其 官 網(wǎng)（https：//cancergenome.nih.gov/）下載，包含695例膠質(zhì)瘤患者和5例正常對(duì)照者的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）結(jié)果及其中605例膠質(zhì)瘤患者的總生存期（OS）；中國(guó)腦膠質(zhì)瘤基因組學(xué)圖譜計(jì)劃（CGGA）數(shù)據(jù)從其官網(wǎng)（http：//www.cgga.org.cn/）下載，包含325例膠質(zhì)瘤患者的RNA-seq測(cè)序結(jié)果及其中222例患者的總生存期。采用R語(yǔ)言數(shù)據(jù)分 析 軟 件（R version 4.0.2，https：//www.R-project.org/）分析TCGA和CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)中膠質(zhì)瘤病理分級(jí)和預(yù)后與P65和PDL1 mRNA表達(dá)量的關(guān)系，其中，圖 形 繪 制 使 用ggplot程 序 包（https：//ggplot2.tidyverse.org），生存分析使用survival程序包（https：//CRAN.R-project.org/package=survival）和survminer程序 包 （https：//CRAN.R -project.org/package=survminer），統(tǒng)計(jì)分析使用ggsignif程序包（https：//CRAN.R-project.org/package=ggsignif）。

2.CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 將U87細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞接種數(shù)目為2000個(gè)/孔，每組置設(shè)6個(gè)平行孔，置于含5%二氧化碳的37℃恒溫培養(yǎng)箱中接種12 h，抽干原培養(yǎng)基，更換為含不同濃度ACT001的培養(yǎng)基100μl，ACT001終濃度分別為5、10、20、40、80、160和320μmol/L；同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組（無(wú)U87細(xì)胞）和正常對(duì)照組（含U87細(xì)胞但不滴加ACT001）。各組細(xì)胞均置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每孔加入CCK-8溶液10μl，靜置2 h后于酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm處光密度值（OD值），計(jì)算細(xì)胞抑制率，細(xì)胞抑制率（%）=［（正常對(duì)照孔OD450nm-實(shí)驗(yàn)孔OD450nm）/（正常對(duì)照孔OD450nm-空白對(duì)照孔OD450nm）］×100%，再采用GraphPad軟件（http：//www.graphpad.com/）繪制細(xì)胞抑制率與ACT001濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算ACT001半數(shù)抑制濃度（IC50）。

3.免疫熒光法檢測(cè)P65蛋白在U87細(xì)胞中的定位變化 經(jīng)50μmol/L ACT001處理的U87細(xì)胞和正常對(duì)照組U87細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，去除培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液（PBS）快速?zèng)_洗5 min（×3次），滴加體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛溶液固定10 min，磷酸鹽緩沖液搖洗5 min（×3次），加入體積分?jǐn)?shù)為1%的TritonX-100溶液室溫通透10 min，磷酸鹽緩沖液搖洗5 min（×3次），滴加體積分?jǐn)?shù)為5%的山羊血清于37℃封閉1 h，棄血清，加入兔抗人P65單克隆抗體（1∶200），4℃過(guò)夜孵育，次日棄Ⅰ抗，磷酸鹽緩沖液沖洗5 min（×3次）后加入Alexa Fluor 594標(biāo)記的驢抗兔熒光IgGⅡ抗（1∶1000），避光濕盒孵育1 h后，棄Ⅱ抗，磷酸鹽緩沖液沖洗5 min（×3次）后滴加4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），室溫靜置5 min，以抗熒光衰減劑封片，避光條件下于倒置相差熒光顯微鏡下觀察，呈紅色熒光的細(xì)胞即為P65蛋白的定位。

4.siRNA轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞 首先將U87細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞接種數(shù)目為（80～100）×103個(gè)/孔，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)60%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前，先將6孔板中完全培養(yǎng)基更換為無(wú)血清培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，每孔準(zhǔn)備2支1.50 ml無(wú)菌EP管，一支加入100μl無(wú)血清培養(yǎng)基+6μl Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑（A管），另一支加入100μl無(wú)血清培養(yǎng)基+150 pmol siRNA（B管）。將A管的轉(zhuǎn)染試劑培養(yǎng)基混合物滴加至B管的siRNA培養(yǎng)基混合物，混勻，室溫靜置15～20 min后立即轉(zhuǎn)染；將200μl混合物分別滴加至各自6孔板，混勻，P65 siRNA由蘇州吉瑪基因股份有限公司進(jìn)行設(shè)計(jì)合成，P65干擾序列1（si-P65-1組）為5'-GAUGAAGACUUCUCCUCCATT-3'、P65干擾序列2（si-P65-2組）為5'-CAGAUACAGACGAUCGUCATT-3'、 無(wú) 義 序 列 （si-NC 組 ） 為 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，轉(zhuǎn)染12 h后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

5.實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)P65蛋白敲低效率 經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染的U87細(xì)胞置于含5%二氧化碳的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，Trizol溶液提取RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，行qRT-PCR，PCR引物序列為，P65正向引物序列：5'-AAGATCTGCCGAGTGAACCG-3'、反向引物序列：5'-GCCTGGTCCCGTGAAATACA-3'，內(nèi)參照物甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）正向引物序列：5'-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3'、反 向 引 物 序列：5'-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3'。反應(yīng)體系共20μl，主要包括cDNA 1μl、正向和反向引物各為1μl、2×Master Mix 10μl、DEPC水7μl。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3 min，循環(huán)1次；95℃15 s，60℃1 min，共循環(huán)40次。以GAPDH為內(nèi)參照物計(jì)算P65蛋白相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算公式為：相對(duì)表達(dá)量=2-（ΔCT實(shí)驗(yàn)組目的RNA-ΔCT對(duì)照組目的RNA）。

6.Western blotting法檢測(cè)目的蛋白相對(duì)表達(dá)量 經(jīng)25和50μmol/L ACT001處理的U87細(xì)胞以及正常對(duì)照組U87細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，RIPA裂解液（按1∶100比例加入蛋白酶抑制劑PMSF和磷酸酶抑制劑）提取總蛋白，按照BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定總蛋白濃度后，行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），采用聚偏二氟乙烯（PVDF）轉(zhuǎn)膜以及牛奶封閉后，滴加Ⅰ抗工作液，包括兔抗人P65、p-P65和PDL1單克隆抗體以及內(nèi)參照物小鼠抗人β-actin單克隆抗體（均1∶1000），4℃孵育過(guò)夜，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠和山羊抗兔IgGⅡ抗（1∶3000）。凝膠成像分析系統(tǒng)采集P65、p-P65和PDL1條帶結(jié)果，并采用Image J軟件進(jìn)行量化分析，以β-actin作為內(nèi)參照物，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

7.統(tǒng)計(jì)分析方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較行LSD-t檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

生物信息學(xué)分析顯示，正常對(duì)照者P65和PDL1 mRNA表達(dá)量極低，膠質(zhì)瘤患者P65和PDL1 mRNA表達(dá)量增加且隨腫瘤病理分級(jí)的升高而呈上升趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05，圖1）；膠質(zhì)瘤患者中P65和PDL1高表達(dá)組生存率和生存期均低于低表達(dá)組且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05，圖2）。

圖1 生物信息學(xué)分析結(jié)果 1a TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中正常對(duì)照者P65和PDL1 mRNA表達(dá)量極低，膠質(zhì)瘤患者P65和PDL1 mRNA表達(dá)量增加且隨腫瘤病理分級(jí)的升高而呈上升趨勢(shì) 1b CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)中膠質(zhì)瘤患者P65和PDL1 mRNA表達(dá)量隨腫瘤病理分級(jí)的升高而增加Figure 1 Bioinformatics analysis results The mRNA expression levels of P65 and PDL1 in TCGA database were extremely low in normal controls,but increased in glioma patients and showed an upward trend with the increase of tumor pathological grade(Panel 1a).Gliomas with higher pathological grade showed higher P65 and PDL1 expression in CGGA database(Panel 1b).

圖2 生物信息學(xué)分析結(jié)果 2a TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中膠質(zhì)瘤患者P65 mRNA高表達(dá)組生存率和生存期均低于低表達(dá)組（P=0.05）2b TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中膠質(zhì)瘤患者PDL1 mRNA高表達(dá)組生存率和生存期均低于低表達(dá)組（P=0.000）2c CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)中P65 mRNA高表達(dá)組生存率和生存期均低于低表達(dá)組（P=0.001）2d CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)中PDL1 mRNA高表達(dá)組生存率和生存期均低于低表達(dá)組（P=0.000）Figure 2 Bioinformatics analysis results In TCGA database,the survival rate and survival time in the group with high P65 mRNA expression in glioma patients were lower than those in the group with low expression(P=0.05,Panel 2a).In TCGA database,the survival rate and survival time in the group with high PDL1 mRNA expression in glioma patients were lower than those in the group with low expression(P=0.000,Panel 2b).In CGGA database,the survival rate and survival time of the group with high P65 mRNA expression were lower than those of the group with low expression(P=0.001,Panel 2c).In CGGA database,the survival rate and survival time of the group with high PDL1 mRNA expression were lower than those of the group with low expression(P=0.000,Panel 2d).

細(xì)胞增殖活性檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)不同藥物濃度ACT001（5、10、20、40、80、160和320μmol/L）處理后，U87細(xì)胞抑制率分別為（9.01±4.75）%、（17.03±2.91）%、（28.50±4.85）%、（45.50±5.15）%、（67.67±8.46）%、（83.02±5.79）%和（94.33±1.59）%，從而最終得出ACT001對(duì)U87細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度為42.98μmol/L（圖3）。

圖3 細(xì)胞抑制率與ACT001濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示，隨著ACT001藥物濃度的升高，U87細(xì)胞抑制率逐漸升高Figure 3 CCK-8 results suggested that ACT001 inhibited the proliferation of U87 cells in a dose-dependent manner.

免疫熒光染色顯示，與正常對(duì)照組相比校，經(jīng)50μmol/L ACT001處理的U87細(xì)胞P65蛋白入核減少，表明ACT001主要通過(guò)減少P65蛋白入核以抑制NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性（圖4）。

圖4 倒置相差熒光顯微鏡顯示，正常對(duì)照組和ACT001 50μmol/L組P65蛋白的表達(dá)定位變化，經(jīng)50μmol/L ACT001處理后P65蛋白入核減少 免疫熒光染色 ×400Figure 4 Inverted phase contrast fluorescence microscopy showed the P65 expression and localization in U87 glioma cells in control group and ACT001 50μmol/L group:the nuclear translocation was reduced in the ACT001 50μmol/L group.Immunofluorescence staining ×400

qRT-PCR反應(yīng)顯示，不同siRNA轉(zhuǎn)染組U87細(xì)胞P65 mRNA表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000，表1）。兩兩比較結(jié)果顯示，si-P65-1組（t=13.290，P=0.000）和si-P65-2組（t=12.730，P=0.000）P65 mRNA表達(dá)量低于si-NC組。si-P65-1組與si-P65-2組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.852，P=0.427），表明si-P65-1組和si-P65-2組較si-NC組敲低P65蛋白的效果顯著。

表1 不同siRNA轉(zhuǎn)染組U87細(xì)胞P65 mRNA表達(dá)量的比較（±s）Table 1.Comparison of P65 mRNA expression in U87 cells transfected with different siRNA(±s)

表1 不同siRNA轉(zhuǎn)染組U87細(xì)胞P65 mRNA表達(dá)量的比較（±s）Table 1.Comparison of P65 mRNA expression in U87 cells transfected with different siRNA(±s)

組別 例數(shù)P65 mRNAF值P值si-NC組31.000 si-P65-1組30.152±0.007164.2000.000 si-P65-2組30.166±0.031

Western blotting法顯示，不同siRNA轉(zhuǎn)染組U87細(xì)胞P65（P=0.000）、p-P65（P=0.000）和PDL1（P=0.002）相對(duì)表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。兩兩比較顯示，si-P65-1組和si-P65-2組P65（P=0.000，0.000）、p-P65（P=0.000，0.000）和PDL1（P=0.004，0.003）相對(duì)表達(dá)量低于si-NC組，si-P65-1組與si-P65-2組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05；表3，圖5），表明減少U87細(xì)胞P65磷酸化水平，可以抑制PDL1的表達(dá)。不同濃度藥物處理組U87細(xì)胞P65相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.904），然而，p-P65（P=0.000）和PDL1（P=0.000）的相對(duì)表達(dá)量差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表4），其中，ACT001 25μmol/L組和50μmol/L組p-P65（P=0.000，0.000）和PDL1（P=0.000，0.000）相對(duì)表達(dá)量均低于正常對(duì)照 組 ，ACT001 50μmol/L組p-P65（P=0.006）和PDL1（P=0.046）相對(duì)表達(dá)量亦低于25μmol/L組（表5，圖6），表明ACT001對(duì)P65的表達(dá)無(wú)明顯影響，但抑制P65磷酸化和PDL1表達(dá)，且呈現(xiàn)藥物濃度依賴性。

圖6 Western blotting法結(jié)果顯示，ACT001 25μmol/L組和50μmol/L組p-P65和PDL1相對(duì)表達(dá)量均低于正常對(duì)照組且呈藥物濃度依賴性，而P65相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯變化Figure 6 Western blotting showed the relative expression of p-P65 and PDL1 in the ACT001 treatment groups were lower than those in the control group in a dose-dependent manner,while the relative expression of P65 showed no difference.

表4 不同濃度藥物處理組U87細(xì)胞P65、p-P65和PDL1蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）Table 4.Comparison of the relative expression of P65,p-P65 and PDL1 in U87 cells of different treatment groups

表4 不同濃度藥物處理組U87細(xì)胞P65、p-P65和PDL1蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）Table 4.Comparison of the relative expression of P65,p-P65 and PDL1 in U87 cells of different treatment groups

組別 例數(shù)P65p-P65PDL1正常對(duì)照組（1）31.0001.0001.000 ACT00130.979±0.0860.720±0.0200.571±0.048 25μmol/L組（2）ACT00130.957±0.1390.607±0.0230.444±0.041 50μmol/L（3）F值0.102269.700128.800 P值0.9040.0000.000

表5 不同濃度藥物處理組U87細(xì)胞P65、p-P65和PDL1相對(duì)表達(dá)量的兩兩比較Table 5.Pairwise comparison of the relative expression of P65,p-P65 and PDL1 among different treatment groups

圖5 Western blotting法顯示，si-P65-1組和si-P65-2組P65、p-P65和PDL1相對(duì)表達(dá)量均低于si-NC組Figure 5 Western blotting showed the relative expression of P65,p-P65 and PDL1 in si-P65-1 and si-P65-2 groups were lower than those in si-NC group.

表2 不同siRNA轉(zhuǎn)染組U87細(xì)胞P65、p-P65和PDL1相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）Table 2.Comparison of the relative expression of P65,p-P65 and PDL1 in U87 cells transfected with different siRNA(±s)

表2 不同siRNA轉(zhuǎn)染組U87細(xì)胞P65、p-P65和PDL1相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）Table 2.Comparison of the relative expression of P65,p-P65 and PDL1 in U87 cells transfected with different siRNA(±s)

p-P65，phospho-P65，磷 酸化P65；PDL1，programmed cell death protein ligand 1，細(xì)胞程序性死亡蛋白配體1。The same for tables below

組別 例數(shù)P65p-P65PDL1 si-NC組（1）31.0001.0001.000 si-P65-1組（2）30.290±0.0170.479±0.0300.568±0.102 si-P65-2組（3）30.266±0.0350.376±0.0660.522±0.100 F值681.300128.80020.470 P值0.0000.0000.002

表3 不同siRNA轉(zhuǎn)染組U87細(xì)胞P65、p-P65和PDL1相對(duì)表達(dá)量的兩兩比較Table 3.Pairwise comparison of the relative expression of P65,p-P65 and PDL1 among groups transfected with different siRNA

討 論

膠質(zhì)瘤尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤惡性程度高、預(yù)后差，許多針對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的靶向藥物均未能有效延長(zhǎng)患者的中位生存期，獨(dú)特的免疫抑制微環(huán)境發(fā)揮重要作用。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞表達(dá)的免疫檢查點(diǎn)PDL1通過(guò)與腫瘤微環(huán)境中T淋巴細(xì)胞表達(dá)的PD1結(jié)合，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。此外，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤還通過(guò)調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素-10（IL-10）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以促進(jìn)正常單核細(xì)胞的PDL1表達(dá)［14-15］。本研究對(duì)來(lái)自TCGA和CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)的膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)PDL1 mRNA表達(dá)量隨膠質(zhì)瘤病理分級(jí)的升高而呈上升趨勢(shì)，且高表達(dá)組生存率和總生存期均低于低表達(dá)組。免疫檢查點(diǎn)PDL1在膠質(zhì)瘤免疫抑制微環(huán)境中發(fā)揮重要作用，本研究進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，ACT001通過(guò)降低膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞PDL1的表達(dá)，以改善腫瘤免疫抑制微環(huán)境。

NF-κB作為轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)直接調(diào)控下游基因的表達(dá)或與其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的交聯(lián)作用，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮極其重要的作用［16］。NF-κB轉(zhuǎn)錄因子家族包括NF-κB1（P50）、NF-κB2（P52）、RelA（P65）、RelB和cRel，且這些亞基之間可以形成多種同二聚體和異二聚體，其中P50/P65是最常見(jiàn)的二聚體。多數(shù)情況下，P50/P65二聚體通過(guò)與胞質(zhì) 中 核 因 子-κB抑 制 蛋 白（IκB）抑 制 因 子 家 族（IκBα、IκBβ和IκBε）中的任一結(jié)合，而被錨定在胞質(zhì)中以無(wú)活性狀態(tài)存在；多種刺激如細(xì)菌脂多糖（LPS）或腫瘤壞死因子 α（TNF-α），使IκB激酶激活致IκB的絲氨酸磷酸化，引起IκB降解，繼而導(dǎo)致P50/P65二聚體磷酸化并移位入核，再與特定基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，參與其轉(zhuǎn)錄調(diào)控。激活的NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在膠質(zhì)瘤的進(jìn)展、遷移、多藥耐藥以及腫瘤相關(guān)免疫逃逸中發(fā)揮極其重要的作用［17］。NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路還通過(guò)與其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路如STAT3、Notch和P53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的交聯(lián)作用，間接影響腫瘤進(jìn)展［16，18］。本研究生物信息學(xué)分析亦顯示，P65 mRNA表達(dá)量隨膠質(zhì)瘤病理分級(jí)的升高而呈上升趨勢(shì)，且其發(fā)揮活性的是磷酸化形式即p-P65；Western blotting法顯示，不同siRNA轉(zhuǎn)染組U87細(xì)胞P65、p-P65和PDL1相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中，si-P65-1組和si-P65-2組P65、p-P65和PDL1相對(duì)表達(dá)量均低于si-NC組，表明減少U87細(xì)胞P65磷酸化水平，可以抑制PDL1的表達(dá)。

ACT001作為一種新型抗腫瘤藥物，業(yè)已完成中國(guó)和澳大利亞的膠質(zhì)瘤Ⅰ期臨床試驗(yàn)。目前由天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院牽頭，正在天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院、首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院等7所醫(yī)院開(kāi)展ACT001單藥以及ACT001聯(lián)合替莫唑胺治療復(fù)發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的Ⅱ期臨床試驗(yàn)。本研究為一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞增殖活性檢測(cè)顯示，經(jīng)不同藥物濃度ACT001（5、10、20、40、80、160和320μmol/L）處理后，U87細(xì)胞抑制率分別為（9.01±4.75）%、（17.03±2.91）%、（28.50±4.85）%、（45.50±5.15）%、（67.67±8.46）%、（83.02±5.79）%和（94.33±1.59）%，從而得出ACT001對(duì)U87細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度為42.98μmol/L。免疫熒光染色顯示，經(jīng)50μmol/L ACT001處理的U87細(xì)胞P65蛋白入核減少，表明ACT001通過(guò)減少P65蛋白入核以抑制NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性。Western blotting法顯示，不同濃度藥物處理組U87細(xì)胞p-P65和PDL1相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中，ACT001 25μmol/L組和50μmol/L組p-P65和PDL1相對(duì)表達(dá)量低于正常對(duì)照組，ACT001 50μmol/L組p-P65和PDL1相對(duì)表達(dá)量亦低于25μmol/L組，表明ACT001不僅可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，還可以通過(guò)抑制P65的磷酸化及核轉(zhuǎn)位，從而抑制PDL1的表達(dá)，以改善膠質(zhì)瘤的免疫抑制微環(huán)境。我們課題組的前期研究顯示，ACT001可以抑制STAT3的磷酸化［19-20］。提示ACT001可以作為一種多靶點(diǎn)藥物治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，從而為ACT001最終應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。

Lim等［12］和Liu等［13］針對(duì)乳腺癌和結(jié)腸癌的研究顯示，NF-κB（P65）作為轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)結(jié)合Cops5基因啟動(dòng)子，調(diào)控COP9信號(hào)小體5（CSN5）的表達(dá)。CSN5控制約1/5的蛋白質(zhì)降解過(guò)程，通過(guò)從Cullin RING E3泛素連接酶（CRLs）骨架移除激活蛋白NEDD8，使 其 失 去 活 性［21］。Lim等［12］業(yè) 已 證 實(shí)CSN5可以調(diào)控PDL1的去泛素化，減少其降解。因此，ACT001是否通過(guò)抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞P65的磷酸化，降低CSN5表達(dá)量，從而增加PDL1的泛素降解，將是我們進(jìn)一步的研究方向。

本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ACT001可以抑制P65的磷酸化，下調(diào)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞PDL1的表達(dá)，從而改善腫瘤免疫抑制微環(huán)境。后續(xù)將建立GL261腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞C57BL/6小鼠顱內(nèi)原位種植模型，驗(yàn)證ACT001對(duì)P65、CSN5和PDL1表達(dá)的調(diào)控。

利益沖突無(wú)