基于高效液相色譜法的黏-7丸蒙藥制劑中大葉茜草素含量測定

王麗，趙欣，馬靜，成志平△，寶山，那松巴乙拉

（1包頭市食品藥品檢驗檢測中心，內(nèi)蒙古 包頭；2內(nèi)蒙古自治區(qū)國際蒙醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特）

0 引言

黏-7丸由草烏葉、訶子、茜草、多葉棘豆、沒藥、麝香、鬧樣花7味藥材組成，茜草是其中的主要藥味之一。黏-7丸主要功能為清瘟解毒、消“粘”、止痛、散瘀、止痢。用于瘟疫盛熱、腦膜炎、赤白痢疾、白喉、音啞、甲性肝炎、胸刺痛、轉筋[1-3]。文獻考證及歷版標準收載，“黏-7丸”處方來源于《醫(yī)療手冊》（內(nèi)蒙古人民出版社1973年蒙文版第1281頁）。最早收載本方的法定標準為《內(nèi)蒙古蒙成藥標準》1984年版第336頁收載，該品種項下僅有性狀及丸劑的通項檢查，無其主要成分大葉茜草素含量的測定，所以有必要對其質(zhì)量標準進行完善，以全面有效地控制藥材質(zhì)量[4-6]。

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器

島津LC-20AT高效液相色譜儀；色譜柱:Phenomen C18 ：4.6mm×250mm，5μm；Diamonsil C18：250mm×4.6mm，5μm；Sartorius BP 211D十萬分之一電子分析天平；Sartorius AL 204-IC萬分之一電子分析天平；KQ-500DE數(shù)控超聲清洗器。

1.2 試劑與試藥

大葉茜草素對照品（110884-200604），購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇為色譜純（Fisher Scientific），水為超純水；黏-7丸為由內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院提供，批號20200301，20200305，20200423。規(guī)格：2g/10丸。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水（85∶15）為流動相；檢測波長為250nm；柱溫30℃。理論板數(shù)按大葉茜草素峰計算應不低于5000。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液的制備

取大葉茜草素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含50μg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備

取本品適量，研細，取約4g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100ml，密塞，稱定重量，放置5-8h，超聲處理（功率250W，頻率40kHz）30min，放冷再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液50ml，蒸干，殘渣加甲醇-25%鹽酸（4∶1）混合溶液20ml溶解，置水浴中加熱水解30min，立即冷卻，加入三乙胺3ml，混勻，轉移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 測定法

分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20μl，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.4 專屬性考察

按供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液（缺茜草），按確定的色譜條件分別精密吸取供試品溶液、陰性對照溶液、大葉茜草素對照品溶液各20μl，注入液相色譜儀。陰性樣品對大葉茜草素的測定沒有干擾。

2.5 線性范圍

取精密稱取大葉茜草素對照品，用甲醇溶解并制成每1ml含有大葉茜草素116.5μg的溶液，作為對照品溶液。吸取該對照品溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、10ml，分別至7個10ml量瓶中，分別用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。以上系列溶液的濃度分別為11.65、23.30、34.95、46.60、58.25、69.90、116.5μg/ml。吸取以上的系列溶液各20μl，分別注入液相色譜儀中，按上述色譜條件測定，記錄各圖譜的大葉茜草素峰面積積分值（Y）。以進樣量（X：μg）對峰面積積分值（Y）進行回歸分析。結果顯示，大葉茜草素在0.233-2.33μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關系，回歸方程為Y=6300.6X-267.53（R2=0.9978）。

2.6 精密度

取大葉茜草素對照品（濃度56.8μg/ml），連續(xù)進樣6次。其RSD為0.95% (n=6)，表明儀器的精密度良好。

2.7 重復性

取同一批號供試品（批號20200301）6份，各約4.0g，精密稱定，分別按上述供試品溶液的制備和色譜條件進行測定，在250nm波長處測定峰面積，按外標峰面積計算。測定每份樣品的含量，進樣量各20μl，計算得RSD為2.00% (n=6)，表明該方法重復性良好。

2.8 穩(wěn)定性

取同一份供試品（批號20200301）溶液，按上述色譜條件，分別在0h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、24h進行測定，記錄峰面積。24h的RSD 為0.89% (n=6)。從數(shù)據(jù)中可見，大葉茜草素在24h內(nèi)的面積積分值基本穩(wěn)定不變。

2.9 準確度

取含量已知的黏-7丸樣品（內(nèi)蒙古內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院提供，批號為20200301，含量為0.800mg/g），研細，精密稱取約2g，取3份，每份加入一定量大葉茜草素對照品，與供試品含有量的比值約為80%；同法再稱取3份樣品，每份加入一定量大葉茜草素對照品，與供試品含有量的比值約為100%；同法再稱取3份樣品，每份加入一定量大葉茜草素對照品，與供試品含有量的比值約為120%。制備供試品溶液，按上述色譜條件進行操作，進樣體積為20μl。結果顯示，80%、100%、120%的回收試驗結果的均值為99.3%，平均的RSD為1.94%。方法的準確度好。

2.10 耐用性試驗

換不同廠家、不同型號的色譜柱，取樣品（20200301），精密稱定，按供試品制備方法制備樣品，在250nm波長處測定峰面積，按外標峰面積計算，測定含量，結果見表1。結果顯示，Phenomenex C18柱的峰窄而高，Diamonsil C18柱的峰寬且矮，兩個柱子均能達到與相鄰峰的基線分離，按大葉茜草素的峰計算理論塔板數(shù)均大于10000，兩個柱子的含量測定結果基本一致。故實驗對柱子的型號不做要求。

表1 不同色譜柱的試驗結果

2.11 樣品測定

依據(jù)建立的大葉茜草素含量測定方法，對3批次黏-7丸中的大葉茜草素含量進行考察，其大葉茜草素含量分別為3.84 mg/g、2.24 mg/g、2.23mg/g。

3 討論

3.1 流動相的選擇

按《中國藥典》2015年版中“茜草”項下方法制備供試品溶液，對以下三種流動相進行了比較研究：甲醇-乙腈-0.2%磷酸溶液（25:50:25）、甲醇-乙腈-水（6：3:1）和甲醇-水（85:15）。結果表明，以甲醇-水（85：15）作為流動相時，保留時間適中，且分離效果好。

3.2 檢測波長的選擇

在200-800nm范圍內(nèi)對大葉茜草素進行光譜掃描，結果顯示，大葉茜草素在218.00nm、246.50nm、273.00nm、281.50nm、392.00nm處有吸收。將黏-7丸供試品溶液和大葉茜草素對照品溶液分別注入高效液相色譜儀，對紫外檢測器設定不同檢測波長的情況下，對大葉茜草素峰進行檢測，并計算黏-7丸中大葉茜草素的含量。結果表明在250nm波長處，大葉茜草素含量最高，故確定250nm作為檢測波長，與《中國藥典》2015年版一部茜草項下的檢測波長一致[7]。

3.3 提取方法的選擇

分別采用不同的提取方法超聲（先浸泡過夜）、回流（先浸泡過夜）、索氏提取，制備供試品溶液，按照《中國藥典》2015年版中茜草的含量測定方法測定大葉茜草素的含量，三組試驗結果顯示，甲醇超聲的提取效率高，且操作簡便，故選用甲醇超聲提取的方法，其方法與《中國藥典》2015年版一部的茜草項下的方法相同。

3.4 提取溶劑的選擇

在HPLC法測定茜草中大葉茜草素的含量時，《中國藥典》2015年版一部采用的提取溶劑是甲醇。為比較不同極性溶劑對大葉茜草素含量的影響，對不同的提取溶劑甲醇、乙醇、80%乙醇進行了比較研究，結果顯示，用甲醇作為提取溶劑時的提取效率最高，故確定甲醇為提取溶劑。

3.5 提取時間的選擇

分別選取提取時間為15min、30min、45min、60min進行試驗，結果顯示，從15-30min，隨著提取時間的延長，提取效率增加；30min以后，提取時間的延長使含量有下降趨勢。故將超聲時間確定為30min。

3.6 浸泡時間的選擇

針對《中國藥典》2015年一部版茜草含量測定項下的浸泡時間，設置了不同的浸泡時間1h、3h、5h、8h、12h、18h，對浸泡時間對測定結果的影響進行了考察，結果顯示浸泡時間在0-5h范圍內(nèi)，隨浸泡時間增加，大葉茜草素含量逐漸增大；浸泡5-8h之間，大葉茜草素含量穩(wěn)定；浸泡時間大于8h時，大葉茜草素含量有下降趨勢，可能的原因是大葉茜草素在甲醇溶液中不穩(wěn)定[8]。故浸泡時間以5-8h為宜。

綜上所述，本文建立了黏-7丸蒙藥制劑中大葉茜草素含量的高效液相色譜測定法，該方法科學、簡便、專屬性較強，為促進蒙藥標準化、提高蒙藥發(fā)展水平具有一定的積極意義。