1，25-二羥維生素D3對(duì)川崎病患兒T細(xì)胞Wnt信號(hào)通路的影響

尚曉麟，孟瑞榮，王穎

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，內(nèi)蒙古呼和浩特010059

川崎病（Kawasaki disease）是一種以中小動(dòng)脈炎癥病變?yōu)橹饕±砀淖兊淖陨砻庖咝匝苎拙C合征，是以全身血管炎癥為主要病變特征的小兒疾病［1-2］。1，25-二羥維生素D3［1，25（OH）2D3］的生物活性作用是通過(guò)結(jié)合和激活其胞內(nèi)特異維生素D受體（vitamin D receptor，VDR）實(shí)現(xiàn)的［3］。Wnt／β-catenin通路對(duì)機(jī)體細(xì)胞的增殖、分化和凋亡均具有重要調(diào)節(jié)作用。MicroRNAs（miRNAs）是一類由20~25個(gè)核苷酸構(gòu)成的單鏈非編碼RNA，能夠不完全互補(bǔ)于mRNA 3′端的非編碼區(qū)，從而抑制靶mRNA的翻譯或促進(jìn)靶mRNA的裂解，多種miRNA表達(dá)的失調(diào)與Wnt密切相關(guān)［4-6］。miR-154可使Wnt／β-catenin通路激活，而miR-154對(duì)Wnt／β-catenin通路的調(diào)控作用在T細(xì)胞增殖中的作用尚需進(jìn)一步研究。

本文就1，25（OH）2D3對(duì)T細(xì)胞抑制增殖作用的Wnt機(jī)制及miR-154的表達(dá)進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 樣本 采集2015年1月—2017年4月在內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院就診的川崎病患兒靜脈血40份，作為實(shí)驗(yàn)組，設(shè)對(duì)照組（該院體檢健康兒童20名）。所有人員均簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑及儀器1，25（OH）2D3、Facollin液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；蛋白提取試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗人Wnt、β-catenin、GAPDH多抗及堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自美國(guó)CST公司；定量PCR試劑盒（批號(hào)：SIGS0002861-1）購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；ECL試劑盒、酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；T細(xì)胞分離柱、T細(xì)胞過(guò)濾柱購(gòu)自美國(guó)RD公司。

1.3 外周血T細(xì)胞的分離 采用T細(xì)胞分離柱分離外周血T細(xì)胞，將2倍血液體積的Facollin液加至血液中，1 500×g離心15 min；收集中間部分的絮狀物，PBS洗滌1次，用2 mL紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，1 000×g離心5 min；棄上清，將細(xì)胞加至T細(xì)胞過(guò)濾柱中，靜置15 min；加入洗液8 mL，800×g離心2 min；收集細(xì)胞。

1.4 T細(xì)胞的體外培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基37℃，5% CO2培養(yǎng)24 h。

1.5 不同濃度1，25（OH）2D3對(duì)T細(xì)胞增殖作用影響的檢測(cè) 采用MTT法。制備T細(xì)胞懸液，將其加至96孔板中，100 μL／孔，37℃培養(yǎng)；換1次液后，分別加入不同濃度（0、10-1、10-2、10-3、10-4和10-5μmol／L）1，25（OH）2D3，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，作用24 h；加入50 μL MTT，作用4 h；棄孔內(nèi)液體，加入DMSO，100 μL／孔，于酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值，并按下式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

細(xì)胞增殖抑制率（%）=（A藥物／A對(duì)照）×100%

1.6 實(shí)驗(yàn)分組 共分為3組。1，25（OH）2D3組：將最佳1，25（OH）2D3濃度作用于川崎病患兒T細(xì)胞；川崎病組：川崎病患兒T細(xì)胞；對(duì)照組：健康兒童T細(xì)胞。

1.7 1，25（OH）2D3對(duì)T細(xì)胞Wnt通路影響的檢測(cè)采用Western blot法。用總濃度為10-3μmol／L的1，25（OH）2D3作用于T細(xì)胞，分別于0、30和60 min收集細(xì)胞，PBS洗滌3次，每管加入含PMSF的裂解液裂解30 min，用蛋白提取試劑盒提取T細(xì)胞蛋白。將蛋白樣品與等體積上樣緩沖液混合，100℃水浴5 min，經(jīng)12% SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至NC膜上，以GAPDH為內(nèi)參，加入兔抗人多抗（Wnt：1∶800稀釋；β-catenin：1∶600稀釋；GAPDH：1∶900稀釋），4℃過(guò)夜；PBST洗滌2次，每次10 min，PBS洗滌1次，10 min，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶2 000稀釋），室溫振蕩孵育1 h；PBST洗滌2次，每次10 min，PBS洗滌1次，10 min，將ECL試劑盒中兩種底物液按1∶1比例混合，滴加至NC膜的蛋白面上作用2 min，拍照。試驗(yàn)重復(fù)5次。

1.8 1，25（OH）2D3對(duì)miR-154表達(dá)量影響的檢測(cè)采用定量PCR法。用總濃度為10-3μmol／L的1，25（OH）2D3作用于T細(xì)胞，分別于0、30和60 min收集細(xì)胞，檢測(cè)miR-154的表達(dá)量，具體操作按定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。miR-154上游引物序列：5′-CACTCCAGCTGGGAATCATACACGGTTGA-3′，下游引物序列：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGG-3′；引物由廣州銳博生物科技有限公司合成。反應(yīng)條件為：95℃30 s，95℃10 s，60℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)重復(fù)5次。

2 結(jié)果

2.1 1，25（OH）2D3對(duì)T細(xì)胞增殖作用的影響MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，從加入1，25（OH）2D3開(kāi)始，細(xì)胞增殖抑制率逐漸降低，10-3μmol／L 1，25（OH）2D3對(duì)T細(xì)胞增殖抑制作用最強(qiáng)，為（98.05±0.37）%，見(jiàn)表1。

表1 不同濃度1，25（OH）2D3作用于T細(xì)胞24 h的細(xì)胞增殖抑制率（%，±s，n=5）Tab.1 Inhibitory rates of T cells treated with 1，25（OH）2D3 at various concentrations for 24 h（%，±s，n=5）

表1 不同濃度1，25（OH）2D3作用于T細(xì)胞24 h的細(xì)胞增殖抑制率（%，±s，n=5）Tab.1 Inhibitory rates of T cells treated with 1，25（OH）2D3 at various concentrations for 24 h（%，±s，n=5）

注：a表示與0 μmol／L 1，25（OH）2D3組比較，P＜0.05；b表示與10-1 μmol／L 1，25（OH）2D3組比較，P＜0.05；c表示與10-2 μmol／L 1，25（OH）2D3組比較，P＜0.05。

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2.2 1，25（OH）2D3對(duì)T細(xì)胞Wnt通路的影響Western blot分析顯示，川崎病組T細(xì)胞Wnt和β-catenin的表達(dá)基本無(wú)變化，且明顯高于對(duì)照組（FWnt分別為11.24和14.68，F(xiàn)β-catenin分別為13.42和15.17，P均＜0.05）。1，25（OH）2D3作用30、60 min后，Wnt和βcatenin表達(dá)明顯降低，與川崎病組和對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FWnt分別為12.4和14.6，F(xiàn)β-catenin分別為16.1和13.5，P均＜0.05）。見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 Western blot分析10-3 μmol／L 1，25（OH）2D3作用T細(xì)胞不同時(shí)間Wnt（A）和β-catenin（B）的表達(dá)情況Fig.1 Western blotting of expressions of Wnt（A）and βcatenin（B）in T cells treated with 10-3 μmol／L 1，25（OH）2D3 for various minutes

圖2 10-3 μmol／L 1，25（OH）2D3作用T細(xì)胞不同時(shí)間對(duì)Wnt（A）及β-catenin（B）表達(dá)的影響Fig.2 Effect of treatment of T cells with 10-3 μmol／L 1，25（OH）2D3 for various minutes on expressions of Wnt（A）and β-catenin（B）

2.3 1，25（OH）2D3對(duì)T細(xì)胞miR-154表達(dá)量的影響PCR檢測(cè)結(jié)果表明，加入10-3μmol／L 1，25（OH）2D3后，隨作用時(shí)間延長(zhǎng)，miR-154表達(dá)量逐漸降低（F30vs0為12.34，F(xiàn)60vs0為17.14，F(xiàn)60vs30為15.2；P均＜0.05）；而川崎病組miR-154表達(dá)量基本無(wú)變化，且明顯高于對(duì)照組（F分別為4.2、3.37和3.14，P均＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 PCR法檢測(cè)1，25（OH）2D3對(duì)T細(xì)胞miR-154表達(dá)量的影響（±s，n=5）Tab.2 Determination of effect of 1，25（OH）2D3 on miR-154 expression level in T cells by PCR（±s，n=5）

表2 PCR法檢測(cè)1，25（OH）2D3對(duì)T細(xì)胞miR-154表達(dá)量的影響（±s，n=5）Tab.2 Determination of effect of 1，25（OH）2D3 on miR-154 expression level in T cells by PCR（±s，n=5）

注：a表示與0 min比較，P＜0.05；b表示與30 min比較，P＜0.05。

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3 討論

川崎病是一種常見(jiàn)的免疫性兒科疾病。近年該病發(fā)生率呈上升趨勢(shì)，已取代風(fēng)濕病成為引起兒童后天性心臟病的主要疾病，嚴(yán)重威脅患者生命安全［7-8］。1，25（OH）2D3的生物活性作用是通過(guò)結(jié)合和激活其胞內(nèi)特異維生素D受體（vitamin D receptor，VDR）實(shí)現(xiàn)的［3］。在川崎病治療中，1，25（OH）2D3具有重要作用。有學(xué)者報(bào)道將白細(xì)胞與1，25（OH）2D3共溫育，發(fā)現(xiàn)這種激素使殺傷性T細(xì)胞失活［7，9-10］。在本研究中，用總濃度10-3μmol／L的1，25（OH）2D3作用于T細(xì)胞后，Western blot分析結(jié)果表明，Wnt和β-catenin隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量逐漸降低，而miR-154表達(dá)量也逐漸降低。表明1，25（OH）2D3對(duì)T細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用是通過(guò)抑制Wnt、β-catenin及miR-154的表達(dá)量來(lái)實(shí)現(xiàn)的。有研究表明，氯化鋰對(duì)T細(xì)胞的細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，這與抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān)［10-12］。本研究發(fā)現(xiàn)，1，25（OH）2D3具有與氯化鋰相似的作用，為1，25（OH）2D3的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。