高滲鹽水保護(hù)血腦屏障減輕腦出血大鼠腦水腫的相關(guān)機制研究

第五飛虎,趙志靖,鄧毅恒

(1.長安醫(yī)院神經(jīng)外科,西安710016;2.長安醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,西安710016)

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是臨床常見危重癥之一，其致殘率和致死率較高，因此ICH治療成為神經(jīng)外科領(lǐng)域研究的一個重點。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，有效控制腦水腫的形成是提高ICH患者救治成功率的關(guān)鍵［1-2］。血腦屏障的破壞是ICH后腦水腫形成的始動因素，ICH后局部基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）與基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1（metallopeptidase inhibitor-1，TIMP-1）比 例 下降，可減少緊密連接蛋白如claudins、occludin和zonula occludens（ZO）蛋白的表達(dá)，促進(jìn)血腦屏障的破壞［3-4］。

眾多研究表明，高滲鹽水（hypertonic saline）在治療多種病因所致的腦水腫和顱內(nèi)高壓方面均較經(jīng)典的甘露醇效果更顯著［5］。盡管國內(nèi)外關(guān)于高滲鹽水減輕腦水腫的相關(guān)研究較多，例如國內(nèi)胡曉露等［6］證明高滲鹽水可通過上調(diào)緊密連接蛋白o(hù)ccudin的表達(dá)，抑制ICH大鼠血腦屏障通透性升高，減輕腦水腫；然而，高滲鹽水是否能夠通過影響MMP-9/TIMP-1比例，改善ICH后血腦屏障破壞的相關(guān)研究尚少。因此，本研究組制作大鼠ICH模型，并施加高滲鹽水干預(yù)，然后對比各組大鼠腦組織病理學(xué)、MMP-9/TIMP-1比例及緊密連接蛋白表達(dá)的差異，旨在為將來HS治療ICH后腦水腫提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及主要試劑儀器

成年雄性清潔級SD大鼠60只，體質(zhì)量（250±50）g，購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心［SCXK（陜）2019-001］。大鼠飼養(yǎng)于屏障設(shè)施［SYXK（陜）2019-001］，相對濕度50%～60%，溫度（21±2）℃，通風(fēng)良好，自由飲食。動物實驗在空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院藥劑科實驗室進(jìn)行，符合相關(guān)倫理要求并給予人道關(guān)懷。本實驗方案得到空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心福利與倫理委員會的批準(zhǔn)（IACUC-20200417）。

用濃氯化鈉注射液作為高滲鹽水，購自正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司（規(guī)格為10 mL/支）；腹腔麻醉用水合氯醛，購自青島宇龍海藻有限公司（國藥準(zhǔn)字H37022673）；HE染色試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所（批號分別為C0105）；組織總蛋白提取試劑盒購自陜西西安安美生物公司；山羊抗兔IgG二抗、兔抗大鼠MMP-9、TIMP-1、claudin-5、occludin以及ZO-1抗體均購自英國Abcam公司（批號分別為ab31412、ab55875、ab24362、ab43542和ab56714）。聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置和凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；酶標(biāo)儀購自美國Bio-Tek公司；微量移液器購自德國Eppendorf公司。

1.2 動物模型的建立與分組

根據(jù)文獻(xiàn)［7］方法制作大鼠ICH模型：用30 mg/kg水合氯醛腹腔麻醉后，將實驗大鼠固定于立體定位儀，暴露實驗大鼠前囟，旁開在前囟右側(cè)3 mm處將顱骨鉆開，微量注射器注射20 μL常溫10%胎牛血清，深度為5 mm，注射速度為1μL/min。最終40只大鼠造模成功，隨機分為模型組及治療組，每組各20只。其中，治療組實驗大鼠造模后，按0.3 mL/h經(jīng)尾靜脈泵入10%高滲鹽水，共48 h。另外設(shè)置對照組，即選取實驗大鼠20只，同模型組步驟鉆開顱骨后，僅微量注射20μL生理鹽水（即0.9%氯化鈉溶液），未出現(xiàn)死亡。造模后48 h以脊椎脫臼法處死3組大鼠，收集腦組織，提取總蛋白后置于－70℃冰箱中保存。

1.3 腦含水量測定

采用干濕質(zhì)量法［8］，將腦組織稱濕重后，立即放入恒溫電烤箱內(nèi)，設(shè)置溫度為120℃，烘烤8 h后稱取干質(zhì)量。按公式計算腦含水量：腦含水量＝（濕質(zhì)量－干質(zhì)量）/濕質(zhì)量×100%。

1.4 腦組織學(xué)觀察

實驗結(jié)束后，冰上迅速切取受壓中心部位腦組織，用體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醛溶液固定，梯度乙醇溶液脫水，二甲苯溶液浸泡透明，浸蠟包埋，使用切片機切成5μm薄片，置入60℃烤箱中烘烤后脫蠟，進(jìn)行蘇木精和伊紅染色，水洗后脫水，二甲苯溶液浸泡透明，封固，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5 蛋白免疫印跡法測定腦組織相關(guān)蛋白表達(dá)的變化

腦組織總蛋白用100 g/L聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜、室溫封閉后，分別加入兔抗MMP-9、兔抗TIMP-1、兔抗claudin-5、兔抗occludin及兔抗ZO-1抗體（均按1∶1 000比例配制），4℃孵育過夜，洗膜后加入羊抗兔二抗（體積稀釋比例為1∶2 500）孵育2 h，洗膜后，用增強化學(xué)發(fā)光法顯色、顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)攝像分析各條帶灰度值，并以β-actin為內(nèi)參，計算各目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 26.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料服從正態(tài)分布，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s表示；多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠死亡率、腦組織含水量以及肉眼觀察差異

造模過程中因麻醉效果不佳，大鼠掙扎，造成腦損傷死亡20只。造模后實驗過程中，模型組大鼠死亡8只，死亡率為40.00%；治療組大鼠死亡5只，死亡率為25.00%；對照組大鼠死亡0只，死亡率為0.00%。結(jié)果說明，治療組大鼠死亡率明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

模型組大鼠腦組織含水量為（80.89±0.25）%，高于治療組大鼠腦組織含水量（78.44±0.32）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

肉眼觀察結(jié)果顯示，模型組大鼠腦中線明顯從病灶側(cè)移向?qū)?cè)，治療組大鼠腦中線未見明顯偏移（圖1A、B）。

顯微鏡下可見模型組大鼠腦組織水腫明顯，炎性細(xì)胞滲出較多；而治療組大鼠腦組織水腫明顯減輕，炎性細(xì)胞滲出明顯減少（圖1C、D）。

2.2 各組大鼠腦組織中MMP-9/TIMP-1蛋白表達(dá)比例差異

與對照組相比，模型組與治療組大鼠腦實質(zhì)MMP-9/TIMP-1比例均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，治療組大鼠腦實質(zhì)MMP-9/TIMP-1比例明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。

圖2 各組大鼠腦組織中TIMP-1、MMP-9蛋白表達(dá)差異Figure2 Differencesin theexpression of TIMP-1 and MMP-9 proteinsin thebrain tissuesof theratsin each group

2.3 各組大鼠腦組織中claudin-5、occludin以及ZO-1蛋白表達(dá)差異

與對照組相比，模型組與治療組大鼠腦實質(zhì)claudin-5、occludin以及ZO-1蛋白表達(dá)水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，治療組大鼠腦實質(zhì)claudin-5、occludin以及ZO-1蛋白表達(dá)水平明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。

圖3 各組大鼠腦組織中claudin 5、occludin以及ZO-1蛋白表達(dá)差異Figure 3 Difference of claudin 5，occludin and ZO-1 protein expressions in brain tissues of rats in each group

3 討論

血腦屏障主要是以腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞及緊密連接蛋白作為基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，基底膜輔以周細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞結(jié)構(gòu)，專門負(fù)責(zé)維持血腦屏障最基本生理功能，讓大腦組織免受外周血液循環(huán)中病原體以及有毒物質(zhì)的侵犯，并可將營養(yǎng)物質(zhì)輸送至大腦各處，穩(wěn)定神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境及微循環(huán)。在發(fā)生ICH損傷后，能量代謝紊亂、自由基的生成、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、功能細(xì)胞凋亡等等均可造成膠質(zhì)細(xì)胞腫脹、內(nèi)皮細(xì)胞水腫、基底膜斷裂以及細(xì)胞間連接發(fā)生解離，最終導(dǎo)致血腦屏障完整性與功能遭受破壞［9-10］。血腦屏障完整性被破壞進(jìn)一步導(dǎo)致腦水腫形成失控，血腫周圍水腫在4～5 d后仍持續(xù)增加，甚至延續(xù)至14 d左右，這是ICH后致殘致死的重要病理基礎(chǔ)。因此，穩(wěn)定血腦屏障狀態(tài)及完整性是改善ICH患者預(yù)后的關(guān)鍵策略。

MMP-9是金屬蛋白酶類超家族中的一員，它可通過特異性地與細(xì)胞外基質(zhì)成分結(jié)合來降解細(xì)胞外基質(zhì)，在發(fā)生血管源性水腫的過程中起關(guān)鍵作用。而TIMP-1是具有抑制MMP-9活性作用的一組多功能因子家族，其通過對MMP-9的抑制，參與正常細(xì)胞外基質(zhì)改建，在多種病理過程包括ICH過程中發(fā)揮舉足輕重的作用。眾多研究顯示，MMP-9/TIMP-1比例動態(tài)變化可影響血腦屏障的穩(wěn)定性［11-13］。本研究結(jié)果也表明，模型組MMP-9/TIMP-1比例明顯高于對照組（P＜0.05）。另外有研究表明，高滲鹽水在治療多種病因所致的腦水腫和顱內(nèi)高壓時均較經(jīng)典的甘露醇效果更顯著。然而，高滲鹽水是否能通過影響MMP-9/TIMP-1比例改善ICH預(yù)后，這在國內(nèi)外相關(guān)研究中涉及甚少。本研究結(jié)果表明，高滲鹽水能明顯減少ICH大鼠腦組織中MMP-9/TIMP-1比例（P＜0.05），且治療組大鼠死亡率明顯降低（P＜0.05）；另外，治療組大鼠腦組織含水量（78.44±0.32）%明顯低于模型組腦組織含水量（80.89±0.25）%，差異有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；肉眼觀察結(jié)果顯示，模型組大鼠腦中線明顯從病灶側(cè)移向?qū)?cè)，治療組大鼠腦中線未見明顯偏移。以上結(jié)果顯示，高滲鹽水能明顯降低MMP-9/TIMP-1比例，從而減輕造模后大鼠腦水腫程度及ICH大鼠的死亡率。

內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接蛋白包括claudins、occludin和ZO蛋白，均是血腦屏障重要的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)成分，是保證血腦屏障功能穩(wěn)定與結(jié)構(gòu)完整性的關(guān)鍵要素，其表達(dá)水平和功能下降在腦水腫形成過程中起重要作用［14］。其中緊密連接蛋白claudin-5、occludin是影響血腦屏障通透性的重要蛋白。ZO-1的表達(dá)是穩(wěn)定細(xì)胞間TJs結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和功能完整的重要保證，在連接跨膜蛋白與細(xì)胞骨架蛋白之間起著重要作用［15］。研究表明，MMP-9/TIMP-1比例改變會引起內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接蛋白claudins、occludin和ZO表達(dá)水平發(fā)生改變［16］。因此筆者推測，高滲鹽水可能也影響緊密連接蛋白如claudin-5、occludin以及ZO-1蛋白的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，ICH大鼠腦組織claudin-5、occludin和ZO-1蛋白表達(dá)水平明顯降低，而通過HS治療后ICH大鼠腦組織claudin-5、occludin和ZO-1蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。以上研究結(jié)果提示，高滲鹽水可影響血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接蛋白claudin-5、occludin和ZO-1的表達(dá)，該機制可能是通過影響MMP-9/TIMP-1比例的改變所實現(xiàn)。

綜上所述，高滲鹽水可通過降低MMP-9/TIMP-1比例，穩(wěn)定緊密連接蛋白claudin-5、occludin和ZO-1的表達(dá)，維持血腦屏障結(jié)構(gòu)完整性，從而改善ICH后腦水腫的嚴(yán)重程度，降低實驗?zāi)Ｐ痛笫蟮乃劳雎?。本研究為日后用高滲鹽水治療ICH后腦水腫提供了重要的理論依據(jù)。