β-氨基丙腈聯(lián)合血管緊張素Ⅱ改良法建立小鼠主動(dòng)脈夾層模型

程玲霞,陳 琳,楊 帆,劉 英,陳睦虎,胡迎春,宋其泰,鐘 武,2

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院急診科,瀘州646000;2.瀘州市人民醫(yī)院,瀘州646000)

主動(dòng)脈夾層（aortic dissection）是一種極其兇險(xiǎn)的主動(dòng)脈疾病，死亡率極高，缺乏有效藥物治療［1-3］。主動(dòng)脈夾層發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，因此研究發(fā)病機(jī)制對(duì)疾病治療具有重大意義。目前對(duì)主動(dòng)脈夾層研究多局限于臨床標(biāo)本的分析，由于臨床標(biāo)本處于疾病終末期且數(shù)量較少，難以深入研究發(fā)病機(jī)制［4］，因此建立一種穩(wěn)定、合適的動(dòng)物模型對(duì)主動(dòng)脈夾層的發(fā)病機(jī)制研究具有重大意義。

造模方法主要包括手術(shù)［5］、基因敲除［6］、藥物誘導(dǎo)［7-8］等。手術(shù)法造模具有不能用于機(jī)制研究的局限?；蚯贸ㄖ饕糜谘芯磕硞€(gè)基因與夾層之間關(guān)系，價(jià)格昂貴且不具有普遍性。藥物誘導(dǎo)法具有操作簡便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，國內(nèi)外學(xué)者已基于此進(jìn)行疾病機(jī)制研究；藥物誘導(dǎo)法包含藥物：β-氨基丙腈（β-aminopropionitrile，BAPN）、血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，Ang-Ⅱ）［7-8］。

BAPN是一種酶抑制劑，競爭性抑制膠原蛋白與彈性蛋白交聯(lián)參與主動(dòng)脈夾層形成［9-10］。Ang-Ⅱ是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的重要激素［11］，參與血管收縮、血壓調(diào)節(jié)，與炎性反應(yīng)、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)。已證實(shí)Ang-Ⅱ可誘導(dǎo)主動(dòng)脈夾層形成［6］。目前用于研究主動(dòng)脈夾層發(fā)病機(jī)制的動(dòng)物模型由BAPN聯(lián)合Ang-Ⅱ皮下埋泵構(gòu)建［12］，該模型成功率高，但死亡率和成本高、手術(shù)操作難度大、缺乏成功植入泵及泵持續(xù)釋放Ang-Ⅱ的標(biāo)準(zhǔn)；因此構(gòu)建一個(gè)簡單、穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)的主動(dòng)脈夾層模型是亟待解決的問題。本實(shí)驗(yàn)采用雄性C57BL/6J小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，利用藥物BAPN聯(lián)合Ang-Ⅱ構(gòu)建主動(dòng)脈夾層模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠100只，6周齡，體質(zhì)量16～17 g，購自斯貝福（北京）生物科技有限公司［SCXK（京）2019-0010］，無限制飲水，飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)環(huán)境［SCXK（川）2018-17］，溫度20～26℃，相對(duì)濕度40%～70%，晝夜明暗交替12 h/12 h。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（201810146）。

1.2 主要試劑、材料與儀器

人Ang-Ⅱ購自中國Rhawn試劑公司（貨號(hào)：R003142），BAPN購自上海Leyan公司（貨號(hào)：ly1002184）；蘇木素、伊紅均購自重慶川東化工；質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液、無水乙醇、二甲苯均購自麥克林公司（上海）；脫色搖床為Kylin-Bell有限公司產(chǎn)品；石蠟切片機(jī)由西南醫(yī)科大學(xué)病理科提供；西南醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供Olympus光學(xué)顯微鏡、組織顯微鏡。

1.3 藥物配制

BAPN溶液溶于無菌雙蒸水中配制成質(zhì)量濃度為0.7 mg/mL的飲用水，每日新配一次，使用黑色飲水壺（BAPN見光易分解），小鼠BAPN攝入量為0.1 g·kg-1·d-1。配制質(zhì)量濃度0.025 mg/mL的Ang-Ⅱ溶液：1.2 mg Ang-Ⅱ粉末溶于48 mL無菌生理鹽水中。

1.4 構(gòu)建C57BL/6J小鼠主動(dòng)脈夾層模型

隨機(jī)將小鼠分為對(duì)照組20只，無限制飲水；BAPN+Ang-Ⅱ組，40只，BAPN飲水+Ang-Ⅱ皮下注射（根據(jù)時(shí)間調(diào)整劑量：實(shí)驗(yàn)1～7 d Ang-Ⅱ?yàn)?.5 mg·kg-1·d-1，實(shí)驗(yàn)8～14 d Ang-Ⅱ劑量減半，實(shí)驗(yàn)15～16 d Ang-Ⅱ劑量調(diào)整為0.375 mg·kg-1·d-1）；BAPN組，40只，給予BAPN飲水并皮下注射等體積生理鹽水。持續(xù)給藥16 d，給藥結(jié)束后次日頸椎脫臼處死小鼠并取出主動(dòng)脈［13］。

1.5 小鼠一般情況及血管形態(tài)觀察

記錄小鼠飲水量及體質(zhì)量，計(jì)算每組小鼠每日平均飲水量再進(jìn)行組間比較。實(shí)驗(yàn)持續(xù)16 d期間小鼠出現(xiàn)劇烈抽搐、呼吸暫停等情況時(shí)立即處死并留取主動(dòng)脈；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后其余小鼠頸椎脫臼處死。將小鼠固定于手術(shù)臺(tái)上，充分暴露主動(dòng)脈，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛溶液灌注，在組織顯微鏡下剝離從升主動(dòng)脈到左右髂總動(dòng)脈周圍的脂肪及筋膜，取出主動(dòng)脈，PBS洗滌2次，固定于多聚甲醛溶液中備用，同時(shí)觀察主動(dòng)脈有無明顯擴(kuò)張、壁內(nèi)血腫及破口。計(jì)算死亡率。

1.6 小鼠主動(dòng)脈病理學(xué)觀察

主動(dòng)脈依次置于70%、80%、90%乙醇溶液和無水乙醇中脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，切成5mm厚度切片；烤片后，進(jìn)行脫蠟、脫苯、蘇木精染色、分色、反藍(lán)、伊紅復(fù)染、乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片處理后置于顯微鏡下觀察主動(dòng)脈的病理形態(tài)學(xué)改變。鏡下發(fā)現(xiàn)主動(dòng)脈中膜變性壞死、或有明顯真假腔，則視為主動(dòng)脈夾層形成；模型成功率=主動(dòng)脈夾層形成總數(shù)/小鼠總數(shù)［14］。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定性資料采用α2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以±s表示，兩樣本間的比較采用LSD-t檢驗(yàn)，多組樣本間比較采用方差分析，采用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行作圖，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況分析

小鼠體質(zhì)量隨著日齡增加而增大，與對(duì)照組相比，BAPN組及BAPN+Ang-Ⅱ組體質(zhì)量增長趨勢(shì)均較緩（圖1）；實(shí)驗(yàn)3d后，與對(duì)照組相比，BAPN組及BAPN+Ang-Ⅱ組體質(zhì)量增加減少。對(duì)照組一般情況良好，BAPN組及BAPN+Ang-Ⅱ組飲水量呈現(xiàn)減少的態(tài)勢(shì)（圖2）。

圖1 小鼠體質(zhì)量變化Figure1 Body weight changesin mice

圖2 小鼠每日飲水量Figure2 Water intakechangesin themice

2.2 主動(dòng)脈夾層成功率及死亡率

對(duì)照組無主動(dòng)脈夾層形成和小鼠死亡。BAPN組主動(dòng)脈夾層發(fā)生率為7.5%，死亡率為2.5%；實(shí)驗(yàn)10 d小鼠死亡1只，尸檢后發(fā)現(xiàn)腸管擴(kuò)張明顯，大動(dòng)脈未見明顯異常，推測小鼠可能死于消化系統(tǒng)疾病。BAPN+Ang-Ⅱ組夾層發(fā)生率為80%，死亡率為30%；7只小鼠在實(shí)驗(yàn)9～11 d（Ang-Ⅱ劑量減半）操作后數(shù)分鐘突然死亡，3只小鼠于實(shí)驗(yàn)15～16 d（Ang-Ⅱ劑量再次減半）皮下注射藥物后死亡，2只小鼠分別于實(shí)驗(yàn)10 d、14 d夜間死亡，解剖小鼠分析死因均為主動(dòng)脈夾層破裂；小鼠死亡時(shí)間主要集中于Ang-Ⅱ調(diào)整量后1～3 d、皮下注射藥物干預(yù)后數(shù)分鐘。

2.3 各組小鼠主動(dòng)脈病理學(xué)變化

充分暴露主動(dòng)脈后，仔細(xì)剝離主動(dòng)脈周圍組織，對(duì)照組血管與周圍組織無明顯粘連，取出主動(dòng)脈，置于多聚甲醛中呈透明管狀；主動(dòng)脈夾層形成的小鼠可見大動(dòng)脈與周圍組織界限不清、管壁增厚、管徑增大；實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中死亡的小鼠可見胸腹腔及血管周圍大量血凝塊，去除周圍組織、血凝塊，發(fā)現(xiàn)主動(dòng)脈破裂（圖3）。光學(xué)顯微鏡（圖4）下與對(duì)照組相比，主動(dòng)脈夾層形成的動(dòng)脈可見中膜增厚、中膜組織壞死、壁間血腫、巨大假腔形成，假腔中大量血細(xì)胞充盈，外膜炎性細(xì)胞浸潤。

圖3 構(gòu)建主動(dòng)脈夾層模型后小鼠主動(dòng)脈大體病理Figure 3 Gross pathology of the aortic tissue of the mice after aortic dissection was established

圖4 構(gòu)建主動(dòng)脈夾層模型后小鼠主動(dòng)脈病理表現(xiàn)（HE染色）Figure4 Histological changesin theaortic tissuesof themiceafter aortic dissection wasestablished(HEstaining)

3 討論

主動(dòng)脈夾層是一種致死性疾病，發(fā)病率逐年上升［15-16］；主動(dòng)脈夾層的發(fā)生與炎性細(xì)胞浸潤、高血壓病、基因突變、吸煙等因素有關(guān)［17］。目前臨床上對(duì)主動(dòng)脈夾層機(jī)制研究較少，原因主要為：（1）人主動(dòng)脈夾層標(biāo)本通過外科手術(shù)獲得，隨著介入手術(shù)應(yīng)用可獲取的臨床標(biāo)本越來越少；（2）臨床標(biāo)本反應(yīng)疾病終末期狀態(tài)，無法獲取夾層形成的動(dòng)態(tài)資料；（3）正常對(duì)照組標(biāo)本來自于尸檢，數(shù)量少；因此無法對(duì)其機(jī)制進(jìn)行深入研究［4］。

主動(dòng)脈夾層建模方法多采用藥物BAPN或（和）Ang-Ⅱ誘導(dǎo)法［18］。BAPN是賴氨酰氧化酶抑制劑，BAPN通過抑制主動(dòng)脈壁膠原和彈性纖維交聯(lián)參與主動(dòng)脈夾層形成［19-20］；但賴氨酰氧化酶家族存在于全身多處組織臟器中，對(duì)維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能、組織器官發(fā)育、創(chuàng)傷修復(fù)具有重要作用。單一大劑量BAPN飲水構(gòu)建主動(dòng)脈夾層模型，小鼠死亡率增加。Ang-Ⅱ通過收縮血管平滑肌、促進(jìn)醛固酮分泌及興奮交感神經(jīng)使得血壓升高、炎性細(xì)胞浸潤破壞主動(dòng)脈壁誘導(dǎo)夾層形成［11，21］。單獨(dú)給于BAPN或Ang-Ⅱ構(gòu)建夾層小鼠模型，夾層發(fā)生率低，BAPN聯(lián)合Ang-Ⅱ法可提高建模成功率。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，使用BAPN、BAPN+Ang-Ⅱ成功構(gòu)建小鼠主動(dòng)脈夾層模型。肉眼可見管腔擴(kuò)張明顯及主動(dòng)脈破口形成；病理染色可見真假腔及壁間血腫，證明建模成功。

預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小鼠給于0.1g·kg-1·d-1BAPN飲水聯(lián)合不同劑量Ang-Ⅱ皮下注射，夾層模型成功率及死亡率有差異。Ang-Ⅱ初始量為1.0 mg·kg-1·d-1組小鼠主動(dòng)脈夾層成功率為40%（2/5），死亡率為40%（2/5）；Ang-Ⅱ1.5 mg·kg-1·d-1組成功率高達(dá)100%（5/5），死亡率為20%（1/5）；Ang-Ⅱ初始量上升為2.0mg·kg-1·d-1成功率下降至60%（3/5），死亡率為40%（2/5）；Ang-Ⅱ2.5 mg·kg-1·d-1組夾層成功率為40%（2/5），死亡率為20%（1/5）；因此實(shí)驗(yàn)選用小劑量BAPN飲水聯(lián)合Ang-Ⅱ（初始量為1.5 mg·kg-1·d-1）皮下注射方案，觀察小鼠主動(dòng)脈夾層形成情況。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)一個(gè)有趣現(xiàn)象：主動(dòng)脈夾層小鼠破裂死亡事件集中于調(diào)整Ang-Ⅱ量和皮下給藥后，可能與情緒激動(dòng)、血壓波動(dòng)相關(guān)。小鼠死亡時(shí)間具有一定規(guī)律，為主動(dòng)脈夾層研究提供參考資料。

綜上所述，小劑量BAPN飲水聯(lián)合皮下注射Ang-Ⅱ法可建立高成功率主動(dòng)脈夾層模型，且小鼠發(fā)生夾層破裂規(guī)律符合臨床患者發(fā)生急性主動(dòng)脈夾層的一般規(guī)律。本實(shí)驗(yàn)建立了一個(gè)符合人體主動(dòng)脈夾層病理生理變化的動(dòng)物模型，具有建模時(shí)間短、成功率高、死亡率低、死亡時(shí)間具有一定規(guī)律、可重復(fù)性強(qiáng)、更經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，為進(jìn)一步研究主動(dòng)脈夾層提供了研究基礎(chǔ)。但本實(shí)驗(yàn)仍有部分不足：（1）整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中未監(jiān)測小鼠血壓變化來探究血壓波動(dòng)與小鼠主動(dòng)脈夾層形成的關(guān)系；（2）小鼠體型較小，可采集標(biāo)本有限。