小鼠脊髓損傷打擊模型精細(xì)行為的比較研究

顏義彤,白 帆,荊瀛黎,王立淼,李子晗,于 艷

(1.中國康復(fù)科學(xué)所,北京100068;2.首都醫(yī)科大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院,北京100068;3.北京腦重大疾病研究院神經(jīng)損傷與修復(fù)研究所,北京100068;4.神經(jīng)損傷與康復(fù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100068)

脊髓損傷（spinal cord injury）是臨床上常見的嚴(yán)重致殘疾病，脊髓結(jié)構(gòu)和功能損傷可造成損傷平面以下運(yùn)動(dòng)、感覺和自主神經(jīng)功能障礙［1］?，F(xiàn)有的脊髓損傷動(dòng)物模型的運(yùn)動(dòng)功能行為學(xué)評價(jià)方法有開放場實(shí)驗(yàn)［2-3］、BBB（Basso,Beattie&Bresnahan Locomotor Rating Scale）/BMS（Basso Mouse Scale）評分［4］、步態(tài)分析［5］、網(wǎng)格爬行［6］及肢體肌力試驗(yàn)［7］等許多種類，但絕大部分行為學(xué)評價(jià)手段僅針對損傷平面以下的運(yùn)動(dòng)功能障礙進(jìn)行評估。同時(shí)，傳統(tǒng)的行為學(xué)檢測手段需要將動(dòng)物置于陌生設(shè)備中，擾亂其原有的生活環(huán)境，可能導(dǎo)致與壓力相關(guān)的行為、激素或神經(jīng)遞質(zhì)改變，從而影響行為學(xué)數(shù)據(jù)的正確解讀和重復(fù)性［8］。因此，為一次性評價(jià)更多種類的行為學(xué)改變，減少動(dòng)物環(huán)境應(yīng)激及其引起的數(shù)據(jù)偏移，近年來家籠（homecage）行為學(xué)評價(jià)得到了廣泛發(fā)展和應(yīng)用，用于監(jiān)測動(dòng)物在熟悉的原始籠盒環(huán)境中無壓力狀態(tài)下的自發(fā)行為［9］。

本研究組使用一種通用的、自動(dòng)化和高通量的行為學(xué)檢測系統(tǒng)［3］，對小鼠在家籠內(nèi)的自發(fā)行為進(jìn)行分析。這種自動(dòng)行為評估記錄系統(tǒng)能對動(dòng)物的行為譜進(jìn)行全面和詳盡的評估，同時(shí)不影響動(dòng)物在家籠中的自發(fā)行為，具有較高的客觀性和可重復(fù)性，可以反映動(dòng)物數(shù)十種常見自發(fā)行為異常［10］。本研究對脊髓損傷小鼠進(jìn)行了家籠內(nèi)精細(xì)行為檢測，觀察其探索、運(yùn)動(dòng)和自我照顧等行為異常及其隨時(shí)間的改變情況。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

異氟烷購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司（貨號R510-22）；注射用青霉素鈉購自華北制藥有限責(zé)任公司（國藥準(zhǔn)字H13020656，4×106U/支）；脊髓打擊器購自美國PSI公司（型號IH-0400）；HomeCageScan動(dòng)物精細(xì)行為分析系統(tǒng)購自美國CleverSys Inc公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

8周齡雌性C57BL/6小鼠21只，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［SCXK（京）2016-0006］，飼養(yǎng)于中國康復(fù)研究中心SPF級動(dòng)物設(shè)施［SYXK（京）2015-0047］。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20～26℃，相對濕度為40%～70%，環(huán)境噪聲≤60 dB（A）；動(dòng)物自由飲食飲水，晝夜12 h更替。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利委員會審核批準(zhǔn)（AEEI-2021-200）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組和脊髓損傷組，其中假手術(shù)組小鼠11只，脊髓損傷組小鼠10只。

1.3 脊髓損傷小鼠模型制備

參照文獻(xiàn)[11]構(gòu)建脊髓損傷小鼠打擊模型。用異氟烷與30%氧氣和70%氮?dú)獾臍怏w混合物麻醉小鼠：4%異氟烷誘導(dǎo)麻醉，1%～2%異氟烷維持麻醉。假手術(shù)組僅行T10椎板切除術(shù)；脊髓損傷組接受T10椎板切除術(shù)和脊髓打擊，打擊力度為0.7 N。術(shù)后皮下注射青霉素2×104U，連續(xù)7 d。每天給予下腹部按摩，擠壓膀胱2～4次以幫助排尿，直至反射性排尿建立。所有動(dòng)物于術(shù)后第5周，行為學(xué)檢測結(jié)束后，在2%異氟烷麻醉下采用頸椎脫臼法處死。

1.4 家籠內(nèi)精細(xì)行為檢測

錄像設(shè)備置于透明家籠前方，動(dòng)物被單獨(dú)放置于籠中，上方設(shè)有飲食飲水區(qū)，下方鋪適量墊料，籠內(nèi)不放置其他豐容物品。視頻采集設(shè)施位于屏障環(huán)境內(nèi)，家籠為開放式籠位，由四面白色板材包圍，配有通風(fēng)及照明設(shè)施，隔絕外界刺激。記錄于每日早上9點(diǎn)開始進(jìn)行，持續(xù)2 h。視頻以AVI格式錄制，使用HomeCageScan軟件（CleverSys Inc.，美國）對生成的視頻進(jìn)行分析，小鼠活動(dòng)數(shù)據(jù)用該行為所占時(shí)間的百分比表示。

運(yùn)用HomeCageScan精細(xì)行為記錄分析系統(tǒng)對家籠內(nèi)動(dòng)物進(jìn)行2 h的行為學(xué)記錄。將自動(dòng)分析記錄到的32種行為分為探索相關(guān)行為、自主運(yùn)動(dòng)相關(guān)行為及自我照顧相關(guān)行為共3個(gè)集群［12］，集群內(nèi)的行為存在明顯的聚類相關(guān)性［10］。探索相關(guān)行為包括俯身、挖掘、尋覓、直立、嗅等，與動(dòng)物的探索動(dòng)機(jī)相關(guān)，見表1。自主運(yùn)動(dòng)相關(guān)行為包括懸吊、跳躍、行走等，與動(dòng)物運(yùn)動(dòng)能力相關(guān)，見表2。自我照顧相關(guān)行為包括飲食、飲水、理毛、睡眠等，是動(dòng)物固有的自我照顧行為，見表3。

表1 小鼠探索相關(guān)行為定義Table 1 Definitions of exploratory behaviors of mice

表2 小鼠自主運(yùn)動(dòng)相關(guān)行為定義Table2 Definitionsof voluntary movementsof mice

表3 小鼠自我照顧相關(guān)行為定義Table 3 Definitions of self-care behaviors of mice

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料服從正態(tài)分布，以±s表示；兩組動(dòng)物間進(jìn)行t檢驗(yàn)，比較脊髓損傷組和假手術(shù)組差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；組內(nèi)進(jìn)行配對t檢驗(yàn)，比較每種行為損傷2～5周與第1周的差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脊髓損傷小鼠家籠內(nèi)精細(xì)行為異常

小鼠行T10椎板切除術(shù)和脊髓打擊后1周進(jìn)行家籠內(nèi)自發(fā)行為視頻的錄制及分析，結(jié)果顯示探索相關(guān)行為、自主運(yùn)動(dòng)相關(guān)行為及自我照顧行為這3種行為集群中，脊髓損傷小鼠與假手術(shù)組小鼠相比均存在顯著異常（P＜0.01），提示脊髓損傷早期即可引起動(dòng)物探索行為（圖1A）、運(yùn)動(dòng)功能（圖1B）及自我照顧（圖1C）的習(xí)慣性行為改變。

圖1 脊髓損傷1周后兩組小鼠探索行為（A）、自主運(yùn)動(dòng)行為（B）和自我照顧行為（C）的時(shí)間占比情況比較Figure 1 Comparison of the exploratory behaviors(A),voluntary movements(B),and self-carebehavior(C)time fraction between the two groups of mice 1 week after spinal cord injury(SCI)

2.2 脊髓損傷小鼠術(shù)后1～5周探索相關(guān)行為隨時(shí)間變化

從探索相關(guān)行為中選取直立和嗅2種最具代表性的活動(dòng)，觀察其隨時(shí)間的變化情況。結(jié)果顯示，脊髓損傷小鼠由于后肢癱瘓，直立行為的時(shí)間占比極低，與假手術(shù)組小鼠相比有顯著差異（P＜0.01）；但與術(shù)后第1周相比，術(shù)后第4周直立時(shí)間所占比例出現(xiàn)了明顯恢復(fù)（P＜0.05，圖2A）。另一探索相關(guān)的嗅探行為在脊髓損傷后的第3周和第4周與第1周相比出現(xiàn)恢復(fù)（P＜0.01），但仍與假手術(shù)組存在較大差異（P＜0.01，圖2B）。以上結(jié)果提示，脊髓損傷小鼠的探索行為出現(xiàn)明顯障礙。然而這種探索行為的障礙可能是由探索動(dòng)機(jī)降低引起，也可能是后肢運(yùn)動(dòng)障礙的結(jié)果。

圖2 脊髓損傷1～5周后兩組小鼠探索相關(guān)行為的比較Figure 2 Comparison of the rearing up behaviors(A)and sniffing behaviors(B)time fraction between the two groups of mice1-5 weeksafter spinal cord injury(SCI)

2.3 脊髓損傷小鼠術(shù)后1～5周自主運(yùn)動(dòng)相關(guān)行為隨時(shí)間變化

在自主運(yùn)動(dòng)相關(guān)行為中，選擇緩慢行走和跳躍行為，觀察其隨時(shí)間的變化情況。結(jié)果顯示，脊髓損傷小鼠的緩慢行走行為在損傷后第2～4周時(shí)與第1周相比有明顯恢復(fù)（P＜0.05），但仍與假手術(shù)組存在顯著差異（P＜0.05，圖3A）。而跳躍行為一直保持較低時(shí)間占比，直到術(shù)后第5周才與術(shù)后第1周相比出現(xiàn)恢復(fù)（P＜0.05），但仍與假手術(shù)組差異明顯（P＜0.05，圖3B）。

圖3 脊髓損傷1～5周后兩組小鼠運(yùn)動(dòng)功能相關(guān)行為的比較Figure3 Comparison of the slow walking behaviors(A)and jumping behaviors(B)time fraction between thetwo groups of mice 1-5 weeks after spinal cord injury(SCI)

以上結(jié)果表明，脊髓損傷后動(dòng)物的自主運(yùn)動(dòng)功能可隨時(shí)間出現(xiàn)一定程度的恢復(fù)，表現(xiàn)為緩慢行走行為逐漸增多；但高度依賴后肢功能的運(yùn)動(dòng)，例如跳躍行為，則無法隨時(shí)間推移而出現(xiàn)改善。

2.4 脊髓損傷小鼠術(shù)后1～5周自我照顧行為隨時(shí)間變化

在自我照顧的習(xí)慣性行為中，選擇理毛和抽搐行為，觀察其隨時(shí)間的變化情況。折線圖顯示，假手術(shù)組小鼠的理毛行為在術(shù)后1周略有升高，從第2周開始穩(wěn)定在較低水平；脊髓損傷組小鼠的理毛行為與假手術(shù)組小鼠相比，在術(shù)后2～5周均保持在較高水平（P＜0.01，圖4A）。同時(shí)，兩組小鼠在睡眠中的抽搐行為也于術(shù)后5周保持較高水平（P＜0.01，圖4B）。

圖4 脊髓損傷1～5周后兩組小鼠自我照顧相關(guān)行為的比較Figure 4 Comparison of the twitching behaviors(A)and grooming behaviors(B)time fraction between the two groups of mice1-5 weeksafter spinal cord injury(SCI)

以上結(jié)果表明，脊髓損傷后小鼠的理毛和抽搐行為保持較高水平，且隨時(shí)間無明顯恢復(fù)。過度理毛通常被認(rèn)為是疼痛的行為學(xué)表現(xiàn)［13］，而睡眠中的抽搐行為反映了脊髓損傷后的痙攣現(xiàn)象［14］。兩組動(dòng)物理毛行為隨時(shí)間變化的結(jié)果提示，脊髓損傷組小鼠與假手術(shù)組小鼠相比長期持續(xù)的理毛行為增加可能是與中樞性疼痛相關(guān)，而不是手術(shù)時(shí)皮膚切口和肌肉牽拉所致。以上結(jié)果提示，脊髓損傷小鼠可能存在長期持續(xù)的中樞性疼痛癥狀。

3 討論

脊髓損傷患者90%以上由外傷引起，以青壯年居多，給社會和家庭帶來了巨大的負(fù)擔(dān)［15］。脊髓是感覺、運(yùn)動(dòng)、自主神經(jīng)的傳導(dǎo)通路，損傷后傳導(dǎo)通路中斷，往往造成患者的運(yùn)動(dòng)和感覺功能喪失［16］。本研究首次在脊髓損傷小鼠中進(jìn)行家籠內(nèi)自發(fā)精細(xì)行為記錄，使用HomeCageScan系統(tǒng)進(jìn)行快速分析，提示脊髓損傷小鼠在探索、自主運(yùn)動(dòng)和自我照顧等方面存在廣泛的行為學(xué)異常。

本研究結(jié)果顯示，脊髓損傷后小鼠探索行為在術(shù)后2～4周出現(xiàn)恢復(fù)，但與未損傷情況下的探索功能仍有較大差距。由于探索行為在一定程度上依賴動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)能力，因此在脊髓損傷小鼠中評價(jià)其探索動(dòng)機(jī)的變化不能排除運(yùn)動(dòng)功能的干擾。盡管HomeCageScan系統(tǒng)對行為組學(xué)變化的敏感性很高，但是筆者認(rèn)為系統(tǒng)記錄到的探索行為并不能完全作為評價(jià)脊髓損傷小鼠探索動(dòng)機(jī)的指標(biāo)。因此，本研究進(jìn)一步檢測脊髓損傷小鼠的自主運(yùn)動(dòng)相關(guān)行為。結(jié)果顯示，自損傷后第2周起，脊髓損傷小鼠以行走為代表的基本運(yùn)動(dòng)功能出現(xiàn)恢復(fù)，并在2～5周穩(wěn)定，這與在相同模型中采用BMS方法評價(jià)后肢運(yùn)動(dòng)功能的結(jié)果一致［11］；但是脊髓損傷后高度依賴后肢力量的跳躍行為未顯示出相應(yīng)的恢復(fù)。

目前，針對日常行為的檢測識別，可用的動(dòng)物行為學(xué)范式很少，且敏感性低，因此限制了對脊髓損傷動(dòng)物模型除運(yùn)動(dòng)障礙外其他異常行為的研究。而且針對脊髓損傷動(dòng)物的常規(guī)行為學(xué)檢測多集中在對下肢運(yùn)動(dòng)功能的評價(jià)，例如常用的BBB/BMS評分、曠場行為、步態(tài)分析、肌力測試等。本研究中，HomeCageScan系統(tǒng)提供了對動(dòng)物前肢功能（如垂直懸吊）、整體功能（如四肢懸吊、多種行走行為）、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)靈活性（如轉(zhuǎn)向、垂直落地）和后肢力量（如跳躍、連續(xù)跳躍）的全面客觀判斷，排除了常用評分系統(tǒng)的主觀性，同時(shí)填補(bǔ)了對脊髓損傷小鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能以外的整體運(yùn)動(dòng)能力評價(jià)的空白。

本研究還發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后，以理毛和抽搐為代表的自我照顧行為未觀察到顯著恢復(fù)，而假手術(shù)組小鼠僅在術(shù)后1周顯示出輕微的理毛行為增加，提示脊髓損傷小鼠可能存在持續(xù)的神經(jīng)病理性疼痛。已知中樞性疼痛是脊髓損傷后的一種頑固并發(fā)癥，成因復(fù)雜，癥狀持續(xù)，且無有效治療手段，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［17-18］。大多數(shù)脊髓損傷患者反映存在持續(xù)疼痛癥狀，其中40%～50%為神經(jīng)性疼痛［19］。而持續(xù)疼痛會引起患者對日常行為的回避，導(dǎo)致焦慮、抑郁等，進(jìn)一步加重患者日常行為模式異常［20-21］。目前，針對脊髓損傷后神經(jīng)病理性疼痛的研究較少，其主要原因是缺乏恰當(dāng)?shù)男袨閷W(xué)評價(jià)指標(biāo)，一般應(yīng)用于機(jī)械性疼痛和熱敏性疼痛的評價(jià)方法如操作性條件反射試驗(yàn)［22］、甩尾試驗(yàn)及爪回縮試驗(yàn)［23-24］均因受制于脊髓損傷小鼠下肢功能嚴(yán)重?fù)p傷，在脊髓損傷后神經(jīng)病理性疼痛的研究中未能廣泛應(yīng)用。

需要指出的是，在行為神經(jīng)科學(xué)研究中，選擇合理的行為學(xué)測試方法是獲得客觀、全面和可重復(fù)的行為學(xué)數(shù)據(jù)的關(guān)鍵［10］。許多研究者對動(dòng)物行為學(xué)多參數(shù)評估的必要性進(jìn)行了討論，而自動(dòng)行為視頻記錄可以客觀全面地反映動(dòng)物在家籠中自發(fā)的日常精細(xì)行為。目前，多參數(shù)自動(dòng)行為視頻分析系統(tǒng)已在術(shù)后疼痛［13,25-26］、偏頭痛［12,27］、晝夜節(jié)律［28］、神經(jīng)退行性疾?。?9-30］和多種轉(zhuǎn)基因小鼠的行為學(xué)評估［3］中廣泛應(yīng)用，并得出了詳盡、可重復(fù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

綜上所述，本研究較為全面地闡述了脊髓損傷小鼠的日常行為變化，可為脊髓損傷的治療效果評價(jià)提供新的指標(biāo)，也為脊髓損傷動(dòng)物模型的疼痛、心理障礙評估提供更敏感的手段。在今后脊髓損傷的治療效果研究中，尤其是針對脊髓損傷除運(yùn)動(dòng)障礙外其他癥狀的治療效果評價(jià)時(shí)，動(dòng)物日常精細(xì)行為記錄分析系統(tǒng)具有廣泛的應(yīng)用前景。