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    柔嫩艾美耳球蟲微線4N端蛋白序列分析與真核表達(dá)

    2021-09-18 07:24:52王黎霞張建軍
    關(guān)鍵詞:畢赤艾美耳球蟲

    王黎霞,張 鵬,張建軍,安 健*

    (1.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院牧醫(yī)系,北京 102442;2.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京 102206)

    球蟲病是艾美耳屬球蟲感染所引起的原蟲病[1]。疫苗是雞球蟲病主要的防控手段。其中,基因工程疫苗以獨(dú)特的優(yōu)勢具有廣闊的應(yīng)用前景[2],保護(hù)性抗原在球蟲病重組疫苗的研制中起著十分重要的作用,尋找合適的抗原是未來球蟲免疫的重要選擇[3]。柔嫩艾美耳球蟲微線蛋白4(Eimeriatenellamicroneme protein 4,EtMIC4)是一種新發(fā)現(xiàn)的艾美耳球蟲蛋白,分子量240 kD,具有重復(fù)的TSP-1和EGF結(jié)構(gòu)域,在球蟲入侵宿主細(xì)胞的過程中起到重要的作用。JAVIER等[4]用5’RACE的方法首次克隆到EtMIC4基因的全長序列。黃欣梅等[5]和DU等[6]利用大腸桿菌表達(dá)EtMIC4蛋白的C端,此重組蛋白免疫試驗(yàn)雞,能夠部分抵抗柔嫩艾美耳球蟲的攻蟲的致病性,然而真核表達(dá)的蛋白在表達(dá)后修飾方面優(yōu)于原核表達(dá)產(chǎn)物,更接近原來蛋白的結(jié)構(gòu)。本研究是為了獲得重組柔嫩艾美耳球蟲微線N端蛋白(RecombinantEimeriatenellamicroneme protein 4 N,rEtMIC4N),所以克隆EtMIC4N基因,與已發(fā)表的基因序列比較,構(gòu)建真核表達(dá)載體pPICZαA/EtMIC4N,利用畢赤酵母(Pichiapastoris)表達(dá)rEtMIC4N,為后續(xù)其免疫原性研究打基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 材 料

    柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊,北京農(nóng)學(xué)院病理實(shí)驗(yàn)室保存。

    pGEM-T克隆載體、表達(dá)載體pPICZαA、大腸桿菌JM109、畢赤酵母GS115、Trizol為Invitrogen公司產(chǎn)品,M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、dNTPs、Oligo(dT)15、Rnasin、DNA膠回收試劑盒為TaKaRa產(chǎn)品。

    1.2 方 法

    1.2.1 EtMIC4N特異性片段的克隆和序列分析 Trizol一步法從柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊分離總RNA,根據(jù)Genebank設(shè)計柔嫩艾美耳球蟲微線蛋白4基因N端(EtMIC4N)引物[7],進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增、克隆、測序和序列分析。

    1.2.2 重組表達(dá)載體pPICZαA/EtMIC4N構(gòu)建 EtMIC4N片段與pPICZαA連接,構(gòu)建重組表達(dá)載體pPICZαA/EtMIC4N,轉(zhuǎn)入大腸桿菌,生長菌落即為疑似陽性菌落,提取質(zhì)粒,PCR鑒定,驗(yàn)證pPICZαA/EtMIC4N構(gòu)建成功與否。

    1.2.3 畢赤酵母的電轉(zhuǎn)化及陽性菌株的篩選 將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體、空表達(dá)載體電轉(zhuǎn)入感受態(tài)畢赤酵母,在100 μg/mL含Zeocin的YPD固體培養(yǎng)基培養(yǎng),凡生長菌落即是疑似菌落,用AOX通用引物進(jìn)行PCR鑒定。

    1.2.4 rEtMIC4N的小規(guī)模表達(dá)篩選及鑒定 試驗(yàn)分為3組:空載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)對照組、重組載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母未用甲醇誘導(dǎo)對照組和重組載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)表達(dá)組,對這3組進(jìn)行rEtMIC4N的小規(guī)模表達(dá)。

    收集空載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)對照組第2天的上清和重組載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母未用甲醇誘導(dǎo)對照組第36小時的上清各1 mL為對照;分別收集重組載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)表達(dá)組第1天、第2天、第3天、第4天、第5天和第6天的上清各1 mL進(jìn)行SDS-PAGE電泳、硝酸銀染色鑒定。收集重組載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)表達(dá)組第3天的上清1 mL,進(jìn)行Western blot鑒定。

    1.2.5 rEtMIC4N的大規(guī)模表達(dá)及純化 以搖瓶的方式對重組載體轉(zhuǎn)化的畢赤酵母甲醇誘導(dǎo),進(jìn)行大規(guī)模表達(dá),離心收集第3天的150 mL的培養(yǎng)上清,超濾除鹽后濃縮為5 mL,先流經(jīng)Ni-NTA柱,再通過250 mmol/L的咪唑洗脫液洗脫,以柱容積為單位分別收集洗脫液,利用分光光度計在OD280對重組蛋白進(jìn)行測定,然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳、硝酸銀染色和Western blot鑒定。

    2 結(jié) 果

    2.1 EtMIC4N特異性片段的克隆和序列分析

    EtMIC4N特異性片段的克隆后得到773 bp的EtMIC4N特異性片段(圖1)。EtMIC4N基因序列經(jīng)Blast分析顯示,克隆序列與Genebank中EtMIC4N的1 004~1 766 bp序列基本吻合,與開放閱讀框保持一致,其中4個堿基發(fā)生突變和1個Gap,基因相似度99.5%。在蛋白水平上,與Genebank的EtMIC4N蛋白比較,有4個氨基酸發(fā)生突變,相似度為98%。

    2.2 重組表達(dá)載體pPICZαA/EtMIC4N構(gòu)建與鑒定

    經(jīng)連接成功的重組表達(dá)載體pPICZαA/EtMIC4N轉(zhuǎn)染大腸桿菌JM109,挑取白色單菌落LLB/Zeocin液體培養(yǎng),提取質(zhì)粒、PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的目的條帶,說明重組表達(dá)載體pPICZαA/EtMIC4N構(gòu)建成功,見圖2。

    2.3 畢赤酵母的電轉(zhuǎn)化及陽性菌株的篩選

    提取JM109感受態(tài)細(xì)胞中PICZαA/EtMIC4N重組質(zhì)粒,電轉(zhuǎn)畢赤酵母,涂布于含Zeocin的YPD平板,對菌落進(jìn)行PCR鑒定,電泳結(jié)果顯示預(yù)期的目的條帶(圖3),證明轉(zhuǎn)化成功,且為陽性重組畢赤酵母。

    2.4 rEtMIC4N的小規(guī)模表達(dá)篩選及鑒定

    SDS-PAGE顯示,重組載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)表達(dá)組第1天、第2天、第3天、第4天、第5天和第6天的上清中約45 kD的位置出現(xiàn)彌散狀的條帶,而空載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)對照組和重組載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母未用甲醇誘導(dǎo)對照組的上清中均沒有此條帶(圖4),Western Blot分析顯示,表達(dá)的蛋白大小為45 kD(圖5),說明rEtMIC4N是由甲醇誘導(dǎo)重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的畢赤酵母產(chǎn)生的。SDS-PAGE和Western Blot的結(jié)果一致,說明45 kD的條帶為分泌表達(dá)的rEtMIC4N。

    2.5 rEtMIC4N的大規(guī)模表達(dá)及純化

    大規(guī)模表達(dá)濃縮液經(jīng)Ni-NTA柱洗脫,收集的洗脫液經(jīng)SDS-PAGE,在45 kD處出現(xiàn)單一條帶,且主要是被第2個柱容積的洗脫液洗脫下來(圖6)。純化后的蛋白經(jīng)Western Blot鑒定,條帶同SDS-PAGE結(jié)果一致,但在80 kD的位置還出現(xiàn)一個條帶(圖7)。通過OD280對蛋白進(jìn)行測定,每升的酵母發(fā)酵液3 d能夠表達(dá)大約為10 mg的rEtMIC4N。

    3 討 論

    目前的抗原篩選研究與自然條件下球蟲感染雞的免疫途徑并不相同,在自然條件下,艾美耳球蟲主要引起的是細(xì)胞免疫應(yīng)答,如果能建立一種雞腸道細(xì)胞模型,用細(xì)胞免疫的水平來篩選有效的抗原,再用細(xì)胞免疫的途徑對雞進(jìn)行免疫來預(yù)防艾美耳球蟲病,此研究思路可望在艾美耳球蟲病的預(yù)防方面獲得突破性的進(jìn)展[7]。而真核表達(dá)的抗原更為接近天然結(jié)構(gòu),這對抗原的有效篩選有著重要的意義。

    JAVIER等[4]用5’RACE的方法首次克隆到EtMIC4的全序列,發(fā)現(xiàn)EtMIC4與巨型艾美耳球蟲TFP250蛋白有較高的同源性,而與剛地弓形蟲翻譯起始位點(diǎn)的一致,說明EtMIC4的起始密碼子同樣在Kozol序列中[8]。對EtMIC4的內(nèi)含子和外顯子分析,發(fā)現(xiàn)其內(nèi)含子還有剪接的保守序列[9-10]。經(jīng)過系統(tǒng)發(fā)生樹的分析,EtMIC4和TF250的TSP-1結(jié)構(gòu)域與TgMIC12的遺傳距離較遠(yuǎn)[11]。EtMIC4基因的進(jìn)化祖先可能含有連續(xù)的TSP-1外顯子區(qū)域,通過內(nèi)含子的重組和進(jìn)化,最后形成艾美耳屬的MIC4。EGF樣結(jié)構(gòu)域之間含有大量的內(nèi)含子,說明EGF的多拷貝進(jìn)化要早于TSP-1。這與缺少內(nèi)含子的EGF樣結(jié)構(gòu)域的層黏蛋白在進(jìn)化上的結(jié)果一致[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)rEtMIC4時,蛋白條帶銀染的結(jié)果灰度分析顯示第1天到第2天未發(fā)現(xiàn)可見條帶,說明前2 d表達(dá)量較少,3~6 d差異不大,所以在大規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)時,選擇在第3天回收上清。

    CHEN等[14]表達(dá)乳鐵蛋白相關(guān)抗菌多肽時,發(fā)現(xiàn)表達(dá)產(chǎn)物比預(yù)期的分子量大。王鑫等[15]表達(dá)豬β-防御素也出現(xiàn)相似現(xiàn)象。本試驗(yàn)中rEtMIC4N的基因序列和表達(dá)載體的標(biāo)簽序列組成的重組蛋白分子量大小為29 kD,畢赤酵母分泌表達(dá)的蛋白約為45 kD,比預(yù)測的分子量要大。其原因可能是由于rEtMIC4是一個重復(fù)結(jié)構(gòu)域的蛋白,導(dǎo)致其蛋白的折疊等高級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,也可能是由于rEtMIC4N的糖基化作用,使分子量增大,但其具體原因尚待進(jìn)一步研究。

    SDS-PAGE的考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果顯示在62 kD到83 kD之間未出現(xiàn)條帶,但經(jīng)Western Blot檢測,在這個位置有輕微的條帶,說明重組蛋白有微量的出現(xiàn),這可能是表達(dá)的rEtMIC4N形成少量二聚體,被靈敏度較高的Western Blot檢測出。

    EtMIC4蛋白分子量較大,較難整體重組表達(dá),需分段進(jìn)行。rEtMIC4C是C端重組蛋白,rEtMIC4N是N端蛋白。DANFORTH等[16]對rEtMIC4C的免疫原性進(jìn)行研究,證明rEtMIC4C對雞預(yù)防球蟲同源感染有一定效果。DU等[6]研究發(fā)現(xiàn),人參皂苷與原核表達(dá)的rEtMIC4C聯(lián)合免疫雞,能夠部分抵抗柔嫩艾美耳球蟲的攻擊,且發(fā)現(xiàn)rEtMIC4C沙門氏菌載體疫苗對雞同源艾美耳球蟲攻擊的保護(hù)作用[17]。JAVIER等[4]獲得EtMIC4的全長序列后,還未見對其新發(fā)現(xiàn)的N端序列進(jìn)行表達(dá)和免疫原性的研究。本試驗(yàn)成功對rEtMIC4N進(jìn)行畢赤酵母表達(dá)及鑒定,并獲得一定量純度較高的蛋白,搖瓶發(fā)酵的表達(dá)量可達(dá)到10 mg/L,至于其免疫原性及臨床應(yīng)用前景值得進(jìn)一步探索。

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