南寧地區(qū)獻血人群ABO亞型的分子遺傳學研究

何保仁 劉金蓮 劉學軍

[摘要]目的調查研究南寧地區(qū)無償獻血人群 ABO 亞型的分布特點及分子遺傳學特征。方法收集2017年3月至2018年12月南寧地區(qū)無償獻血者血液樣本，采用試管法對微板法篩查出的正反定型不一致的樣本進一步做血型血清學分析，并進行亞型確認。對亞型樣本進行基因克隆測序，測序結果用軟件比對分析后，確定其基因型。結果從2017年3月至2018年12月南寧地區(qū)無償獻血者225587例血液樣本中檢出 ABO 亞型41例，其中 A 亞型6例、B 亞型25例、AB 亞型10例。對41例 ABO 亞型樣本進行克隆測序分析，共檢測出3個常見 O 等位基因（O01、O04、O13）;3個常見 A 等位基因（A101、A102、Ael08）以及一個新的 A 等位基因;4個常見 B 等位基因（B101、B108、B305、Bw11）以及一個新的 B 等位基因。結論 ABO 亞型分布存在不均衡性和地域性差異。南寧地區(qū)獻血人群 B 亞型出現(xiàn)的頻率高于 A 亞型，最常見的亞型是 A102和 Bw11。

[關鍵詞]獻血人群; ABO 血型; ABO 亞型;克隆測序

[中圖分類號] R394.3? [文獻標識碼] A?? [文章編號]2095-0616（2021）24-0030-04

Molecular genetics research on the ABO subtypes of the blood donors in Nanning region

HE? Baoren??? LIU? Jinlian??? LIU? Xuejun

Nanning Institute ofTransfusion Medicine， Guangxi， Nanning 530007， China

[Abstract] Objective To probe into the distribution characteristics and molecular genetic characteristics of ABO subtypes among the voluntary blood donors in Nanning region . Methods The blood samples of the voluntary blood donors in Nanning from March 2017 to December 2018 were collected . For the samples screened by microplate technique to be with inconsistent positive and negative typing， further blood group serological analysis was carried out， and the subtypes were confirmed . After clone sequencing of genes of the subtype samples， the sequencing results were compared and analyzed by software and the genotypes were determined . Results From the 225587 blood samples of the voluntary blood donors in Nanning region from March 2017 to December 2018， 41 ABO subtypes were detected， of which 6 were subtype A， 25 were subtype B， and 10 were AB subtype . According to the clone sequencing analysis of 41 ABO subtype samples， those alleles that were detected included 3 common O alleles （O01， O04， O13）， 3 common A alleles （A101， A102， Ael08） and 1 new A allele， 4 common B alleles （B101， B108， B305， Bw11） and 1 new B allele . Conclusion The distribution of ABO subtypes is unbalanced， and it varies among regions . The frequency of subtype B among the blood donors in Nanning region is higher than that of subtype A， and the most frequently seen subtypes are A102 and Bw11.

[Key words] Blood donors; ABO blood group; ABO subtype; Clone sequencing

自1900年奧地利科學家 Karl Landsteiner 發(fā)現(xiàn) ABO 血型以來，ABO 血型系統(tǒng)一直是臨床輸血中最重要的血型系統(tǒng)之一[1-3]。在臨床輸血中，供受者 ABO 血型不合可導致嚴重的溶血反應，主要原因是 ABO 亞型引起的血型誤判或漏檢。因此，精準鑒定獻血者的血型對保障臨床輸血安全具有重要意義。 ABO 亞型是由于基因突變，導致紅細胞表面 A 抗原或 B 抗原表達數(shù)目減少，因此與抗 A 或抗 B 血清反應出現(xiàn)凝集強度減弱的現(xiàn)象[4-5]。本研究對2017年3月至2018年12月南寧輸血醫(yī)學研究所獻血者常規(guī)血型檢測中發(fā)現(xiàn)的41例 ABO 亞型標本進行基因克隆測序分析，旨在了解南寧地區(qū)獻血人群 ABO 血型分布情況及 ABO 亞型分子生物學特征，積累本地區(qū)人群血型大數(shù)據(jù)資料，同時規(guī)范獻血者血型篩查，以保障臨床用血的安全性、有效性?，F(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

收集2017年3月至2018年12月南寧市無償獻血者血液標本，進行常規(guī)血型檢測，對正反定型不一致的標本進行進一步分析，經吸收放散實驗確定為 ABO 亞型的標本共41例，其中男23例、女18例，年齡18～55歲，均為身體健康的無償獻血者。

1.2試劑與儀器

單克隆抗-A、抗-B 和抗-H（上海血液生物公司）、抗-A1抗體（荷蘭Sanquin公司）;人 ABO 反定型用紅細胞試劑（北京金豪公司）;抗-AB 抗體（DIAGAST 公司）;pGEM_T Vector 系統(tǒng)（美國 Promega 公司）;KA-2200型離心機 （日本久保田公司）;GentraPuregene Blood Kit 外周血基因組抽提試劑盒（德國 QIAGEN 公司）;9700型基因擴增儀和 ABI3730型 DNA 測序儀（美國應用生物系統(tǒng)公司）。所有試劑均在有效期內使用。

1.3方法

1.3.1血型血清學實驗對微板法篩查中發(fā)現(xiàn)正反定型不一致或者抗原凝集強度較弱的樣本，采用試管法進行 ABO 亞型鑒定，包括 ABO 正反定型試驗、冷吸收熱放散試驗，按血清學診斷標準來判斷結果并進行 ABO 亞型鑒定和分類[6]。

1.3.2基因克隆測序采用GentraPuregene Blood Kit 提取 ABO 亞型標本基因組 DNA 備用，操作按試劑說明書進行。通過 Primer 5.0軟件在 ABO 基因的第5內含子側翼和第7外顯子之間設計引物（引物序列： ABO-F AGA GGA GGC AGA AGC TGA GTG GAG TTT C，ABO-R AGT TTA CCC GTT CTG CTA AAA CCA AGG G），用于擴增目的片段（引物由上海生工合成）。PCR 擴增體系：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸150 s，35次循環(huán)，完成后于72℃延伸5 min。擴增片段長度為2.1 kb，擴增產物膠回收純化。通過 T4 DNA 連接酶將目的片段連接到pGEM_T質粒上，轉化到 DH5α感受態(tài)細胞里，涂平板培養(yǎng)，挑取10個陽性克隆進行測序。

1.3.3序列分析使用 Chromas 軟件閱讀測序圖譜，通過AlignX軟件與 GenBank 中的序列（NM_020469）進行比對，確定基因型。

2結果

2.1 ABO亞型血清學檢測結果

2017年3月至2018年12月南寧地區(qū)獻血人數(shù)225587人，檢出 ABO 亞型41例，其中 A 型獻血人數(shù)52642人，亞型6例;B 型獻血人數(shù)59441人，亞型25例; AB 型獻血人數(shù)12216人，亞型10例; O 型獻血人數(shù)101288人，未檢出亞型標本。

2.2 ABO基因克隆測序結果

本研究對41例 ABO 亞型樣本的第6、7外顯子和第6內含子以及兩側側翼進行克隆測序分析，共檢測出3個常見 A 等位基因（A101、A102、 Ael08）以及一個新的 A 等位基因，命名為Anovel;4個常見 B 等位基因（B101、B305、B108、Bw11）以及一個新的 B 等位基因，命名為Bnovel;3個常見 O 等位基因（O01、O04、O13），見表1。本研究發(fā)現(xiàn)3例標本檢出兩種新的等位基因突變，一種血清學定型為 A 亞型，克隆測序顯示，一條鏈為 O01，另一條鏈與 A101比對，存在467C > T，737A > G 突變，導致氨基酸 P156L、Y246C 替換;另一種血清學定型為 B 亞型，克隆測序顯示，一條鏈為 O13，另一條鏈與 B101比對，存在734C > T 突變，氨基酸 T245I 替換，兩種新發(fā)現(xiàn)的等位基因序列均已提交到 GenBank，序列號為： MK144787和 MK568546。

3討論

ABO 血型抗原較其他血型系統(tǒng)抗原更為復雜， ABO 基因的編碼產物為特異性糖基轉移酶，由糖基轉移酶引導合成 ABO 抗原[7]。ABO 血型是臨床輸血必須鑒定的血型之一，除了常見的4種 ABO 表型之外，根據(jù)紅細胞與抗血清或血凝集素的凝集反應強度、血清中抗體以及唾液等分泌液中血型物質， ABO 表型又有 A 亞型和 B 亞型之分。目前血型抗原基因突變數(shù)據(jù)庫上已報道的 ABO 等位基因有397個，其中 A 等位基因152個、B 等位基因108個，由血清學定義的同一種 ABO 亞型可以對應多種等位基因[8]。

南寧地區(qū)獻血人群 ABO 血型分布為 O 型最多，占44.9%，其次是 B 型，占26.35%， A 型占23.34%， AB 型占5.41%，分布數(shù)量為 O > B > A > AB，與海南、廣州等地分布比較接近[9-11]，符合中國南方各省 O 基因頻率較其他地區(qū)高的特點。本研究顯示 B 亞型的出現(xiàn)頻率明顯高于 A 亞型的出現(xiàn)頻率，與張嶸等[7，12-13]報道一致。A 亞型等位基因主要為 A102，未檢測到 A2等位基因。 A102在中國人群的比例相對較高，是常見基因型。A102與 A101在序列比對上，發(fā)生467位點的單個堿基替換（C → T），導致氨基酸 Pro → Leu 替換，兩者翻譯糖基轉移酶的活力無明顯差異[14]。但是在本研究血清學實驗中發(fā)現(xiàn)的 A102凝集強度均較弱，因本研究只做第6、7外顯子和第6內含子測序，推測是其他外顯子或者調控區(qū)存在變異導致[8]。B 亞型等位基金主要是 Bw11，說明 Bw11亞型在本地區(qū)比較常見，Bw11亞型是由喻瓊等[15]首先報道的，與 B101等位基因的差異僅在于 nt695位點 T > C 突變，相應的232位氨基酸由亮氨酸轉變?yōu)楦彼?，導致糖基轉移酶活性部分喪失。O 亞型等位基因主要為 O01和 O13，其中 O01是中國人群中比較常見的等位基因，O13在其他地區(qū)比較少見，推測是廣西地區(qū)人群特有的基因特征。

本研究發(fā)現(xiàn)兩個新的等位基因，新的等位基因都是錯義突變，推測可能是由于氨基酸的替換改變了糖基轉移酶構象，使酶活性降低。關于其如何影響酶的活性，還需進一步研究。

ABO 亞型雖然較為少見，但其可能嚴重影響輸血的安全性和有效性。研究并闡明南寧地區(qū)人群 ABO 亞型的分子遺傳學特點，不僅可以指導臨床安全輸血，降低輸血風險，還能對我國人類遺傳學研究、血型與疾病相關性研究及法醫(yī)物證鑒定等提供幫助。

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（收稿日期：2021-07-06）