妊娠期糖尿病中胎盤外泌體對滋養(yǎng)細胞增殖、細胞周期及凋亡的影響*

曾 燕 勾憲飛 陳曉燕 郝從莉

（1 重慶市第七人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 400069；2 重慶市涪陵區(qū)婦幼保健院產(chǎn)科，重慶 408000；3 重慶市中醫(yī)院婦科，重慶 400021；4 成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，成都 611137）

近年，妊娠期糖尿?。╣estational diabetes mellitus，GDM）的發(fā)病率隨著肥胖與2 型糖尿病發(fā)生率的增加也隨之升高[1]。國際糖尿病聯(lián)合會（International Diabetes Federation，IDF）調(diào)查結(jié)果顯示，我國2013年已超過100 萬GDM 患者，并嚴(yán)重危害母嬰健康[2]。然而，GDM 的具體病因及發(fā)病機制尚不明確。外泌體是在某些特殊生理或病理狀態(tài)下，母體細胞選擇性地將一部分生物信息物質(zhì)（如蛋白、DNA、mRNA/miRNA/lncRNA、脂類等）包裹進直徑為40～120 nm 的脂質(zhì)雙分子層囊泡內(nèi)的一種物質(zhì)，故外泌體因其特殊結(jié)構(gòu)能夠介導(dǎo)不同細胞間的信息交流及物質(zhì)交換。既往研究表明外泌體在胎盤發(fā)育、子宮螺旋動脈重塑及母體免疫耐受等過程中發(fā)揮重要作用[3-5]。有研究表明GDM患者的胎盤外泌體在濃度、成分及生物活性方面均較正常妊娠組不同，這提示胎盤外泌體可能對GDM 的發(fā)生發(fā)展、診斷和治療等具有重要意義[6-8]。有數(shù)據(jù)證實在GDM 患者的胎盤組織中，滋養(yǎng)細胞的數(shù)量、增殖能力顯著增加，同時細胞周期調(diào)控蛋白PCNA、cyclin D3 等表達明顯升高，而細胞凋亡卻顯著降低[9-13]，但滋養(yǎng)細胞上述行為改變是否受到胎盤外泌體的影響尚不明確。鑒于此，本研究分離純化GDM 患者血漿中胎盤外泌體，并在體外培養(yǎng)滋養(yǎng)細胞系HTR-8/SVneo，探討胎盤外泌體對滋養(yǎng)細胞增殖、細胞周期及凋亡的影響，以期從胎盤外泌體方面闡明GDM 的相關(guān)發(fā)病機制。

1 材料和方法

1.1 臨床標(biāo)本、細胞系及主要試劑

選取2018年3月至2019年4月期間重慶市第七人民醫(yī)院50 例診斷為GDM 孕產(chǎn)婦患者（GDM組），GDM 診斷參考2013年世界衛(wèi)生組織GDM 診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。另選同期50 例口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT）陰性的孕產(chǎn)婦作為正常對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）單胎妊娠；（2）排除患有其他妊娠期合并癥，如心腦血管、肺、肝、腎、甲狀腺等疾病及孕前即診斷為糖尿病或有糖尿病家族史；（3）均經(jīng)陰道分娩。所有受試者均在分娩當(dāng)日晨起時抽取空腹靜脈血5 mL，置于含有抗凝劑的紫色管中，靜置30 min 后，室溫下5 460 r/min離心5 min，取血漿置于試管中，30 min 內(nèi)進行檢測或儲存于-80℃冰箱中，用于提取胎盤外泌體。本研究經(jīng)過本院倫理委員會審批，患者及家屬均簽署知情同意書。

人絨毛膜滋養(yǎng)細胞系HTR-8/SVneo（HTR8）購自北京維通利華生物公司；DMEM/F12、0.25%胰蛋白酶（美國Hyclon 公司）；胎牛血清（FBS）、青鏈霉素混合液（杭州四季青生物公司）；RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒（美國Invitrogen 公司）；TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、外泌體RNA/蛋白提取試劑盒（美國Thermo 公司）；兔抗胎盤堿性磷酸酶（PLAP）、CD63、TSG101、GAPDH 單克隆抗體（美國Santa Cruz 公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗（北京中杉金橋生物有限公司）；PKH67 綠色熒光膜連接染料、DAPI 、MTT試劑盒（美國Sigma 公司）；Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡試劑盒（美國BD 公司）。

1.2 胎盤外泌體的提取及鑒定

取1 mL 血漿，參考相關(guān)文獻[7，14]利用超速離心與蔗糖密度梯度分離法相結(jié)合提取孕產(chǎn)婦外周血的外泌體后，使用二喹啉甲酸（BCA）法進行定量，-80℃保存?zhèn)溆?。?0 μL PBS 稀釋2 μL 外泌體，3.5%的多聚甲醛固定后滴加到銅網(wǎng)上，2%的鈾酸鹽染色，晾干后應(yīng)用透射電鏡（TEM）觀察外泌體形態(tài)；用950 μL PBS 稀釋50 μL 的外泌體，0.22 μm 濾膜過濾外泌體稀釋液后使用Nanosight 納米粒徑跟蹤分析（nanoparticle-tracking analysis，NTA）進行外泌體粒直徑檢測。

1.3 滋養(yǎng)細胞HTR8 細胞系培養(yǎng)及細胞分組

常規(guī)復(fù)蘇HTR8細胞后，使用含10 % FBS、1 %青鏈霉素的DMEM/HG 培養(yǎng)基于37 ℃、5 % CO2恒溫培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。待細胞生長融合至80%～90%時，用0.25 %胰酶進行消化傳代。取處于對數(shù)生長期的HTR8 細胞，調(diào)整細胞后以4×104個/孔接種于24 孔板中，并將細胞分為5 組：NP-10 μg Exo 組為含10 μg 正常妊娠組外泌體（NP-Exo）處理的HTR8 細胞；NP-20 μg Exo 組為含20 μg 正常妊娠組外泌體（NP-Exo）處理的HTR8 細胞；GDM-10 μg Exo 組為含10 μg 妊娠期糖尿病組外泌體（GDM-Exo）處理的HTR8 細胞；GDM-20 μg Exo 組為含20 μg 妊娠期糖尿病組外泌體（GDMExo）處理的HTR8 細胞；設(shè)含200 μL PBS 處理的HTR8 細胞為對照組。

1.4 PKH67/DAPI 雙染標(biāo)記及追蹤外泌體

收集分離純化的外泌體，根據(jù)PKH67 試劑說明書進行標(biāo)記外泌體，同時根據(jù)DAPI 染料說明書將HTR8 細胞進行染核，再將PKH67 標(biāo)記的外泌體加入到經(jīng)DAPI 染核的HTR8 細胞中，于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，PBS 洗滌2～3 次后，熒光共聚焦顯微鏡進行觀察。實驗單獨重復(fù)3 次。

1.5 MTT 檢測細胞增殖能力

取各組對數(shù)生長期的HTR8 細胞，常規(guī)消化后按2×104個/孔接種于96 孔板中，分別于0、12、24、36、48 h 向每孔加入5 mg/mL 的MTT 試劑20 μL，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄除原培養(yǎng)液后，每孔加入150 μL 的二甲基亞砜（DMSO）溶液，室溫下震蕩10 min 使形成的紫色甲瓚結(jié)晶充分溶解。酶標(biāo)儀于490 nm 檢測每孔吸光度值（OD490），每個時間點每組設(shè)置5 個復(fù)孔，取平均值，繪制細胞的生長曲線。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞周期

取各組對數(shù)生長期的HTR8 細胞，調(diào)整細胞密度后以1×105個/孔接種于24 孔板中，于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)終止后，4℃預(yù)冷的PBS 輕輕洗滌細胞后，并進行常規(guī)消化，1 500 r/min 離心5 min，棄上清，收集細胞，加入500 μL的PBS 重懸細胞，并迅速加入3.5 mL -20℃預(yù)冷的70%乙醇，將細胞吹打均勻后，于4℃固定過夜。PBS 洗滌細胞3 次，2 000 r/min 離心5 min 以充分去除固定液，按照細胞周期流式細胞術(shù)檢測試劑盒說明方法進行操作，加入500 μL PI/RNase 染色液，4℃條件下避光孵育30 min，上流式細胞儀檢測各組細胞周期。實驗單獨重復(fù)3 次

1.7 Annexin V-FITC/PI 雙染色結(jié)合流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

取各組對數(shù)生長期的HTR8 細胞，調(diào)整細胞密度后以1×105個/孔接種于24 孔板中，于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，1 500 r/min 離心5 min，棄上清，4℃預(yù)冷的PBS 洗滌細胞2 次，1 500 r/min 離心5 min，收集細胞沉淀，用195 μL Annexin V-FITC 結(jié)合液重懸細胞，調(diào)整細胞至7×105/mL，依次加入5 μL 的Annexin V-FITC 及10 μL 的碘化丙啶（PI）染色液，輕輕搖晃離心管以充分混勻后，室溫下避光孵育30 min。300 目濾膜過濾細胞團塊后，上流式細胞儀檢測。實驗單獨重復(fù)3 次。

1.8 免疫印跡檢測胎盤外泌體標(biāo)志蛋白的表達

應(yīng)用外泌體RNA/蛋白提取試劑盒提取胎盤外泌體中的總蛋白。BCA 法進行蛋白定量，按照1∶4 向上清液中加入5×上樣緩沖液，并于沸水中加熱變性10 min。取30 μg 的蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離蛋白，采用濕轉(zhuǎn)法將分離的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5%的脫脂牛奶于室溫下封閉2 h 后，分別加入CD63（1∶500）、PLAP（1∶800）、TSG101（1∶500）、GAPDH（1∶1 000）一抗，4 ℃搖床孵育過夜。TBST 溶液清洗3 次，每次5 min，以辣根酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，以 TBST 溶液清洗3 次，每次5 min。最后均勻滴加ECL 發(fā)光液后于凝膠成像儀進行曝光拍照。Image J 軟件測定條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參GAPDH 的比值作為其相對含量。以上實驗單獨重復(fù)3 次。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

采用 SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用±s表示。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 孕產(chǎn)婦的一般臨床資料比較

與對照組相比，GDM 組的產(chǎn)前BMI、胎盤質(zhì)量及新生兒體質(zhì)量均顯著增加，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而平均年齡、分娩周數(shù)、新生兒性別差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表1）。

表1 兩組孕產(chǎn)婦一般臨床資料比較

2.2 胎盤外泌體的鑒定

TEM 觀察顯示，胎盤外泌體呈典型的杯狀或雙凹狀形態(tài)，直徑為40～120 nm（圖1A，見封二）；NTA 檢測結(jié)果顯示，分離純化的外泌體直徑多集中于（84±5）nm（86%±3%）之間，這與TEM觀察的微粒大小相近（圖1B，見封二）。免疫印跡檢測結(jié)果顯示，胎盤外泌體標(biāo)志性蛋白CD63、TSG101、PLAP 表達均呈陽性（圖1C，見封二）。

圖1 胎盤外泌體的鑒定。A：透射電鏡觀察母體血清中胎盤外泌體呈典型的杯狀或雙凹狀形態(tài)，標(biāo)尺=100 nm，右上角插圖的標(biāo)尺=10 nm；B：NTA 檢測分離純化的胎盤外泌體的粒徑大小及密度分布；C：免疫印跡檢測胎盤外泌體標(biāo)志性蛋白CD63、TSG101、PLAP 的表達.

2.3 胎盤外泌體的攝取

PKH67（綠色熒光）標(biāo)記的胎盤外泌體與DAPI 染核（藍色熒光）的HTR8 細胞共培養(yǎng)24 h 后，激光共聚焦顯微鏡觀察可見，PKH67 標(biāo)記的外泌體能夠進入HTR8 細胞中，即胎盤外泌體能夠被滋養(yǎng)細胞HTR8 細胞所攝取（圖2，見封二）。

圖2 滋養(yǎng)細胞HTR8 細胞攝取胎盤外泌體，標(biāo)尺=20 μm，白色箭頭指示外泌體.

2.4 胎盤外泌體對滋養(yǎng)細胞增殖的影響

MTT 檢測結(jié)果顯示，NP-Exo 對HTR8 細胞增殖能力無明顯變化，而GDM-Exo 能夠顯著促進HTR8 細胞增殖能力，且GDM-Exo 的濃度越高，HTR8 細胞的增殖能力越強。與對照組相比，GDM-10 μg Exo 組及GDM-20 μg Exo 組滋養(yǎng)細胞在GDM-Exo 處理24 h 后，細胞的增殖活性顯著增強，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），NP-10 μg Exo 組、NP-20 μg Exo 組滋養(yǎng)細胞的增殖活性無明顯變化（P>0.05）；與NP-10 μg Exo 組或NP-20 μg Exo 組相比，GDM-10 μg Exo 組與GDM-20 μg Exo組的滋養(yǎng)細胞增殖能力顯著增強（P<0.05）（圖3，見封二）。

圖3 GDM胎盤外泌體促進滋養(yǎng)細胞的增殖能力。*P<0.05 vs 對照組；#P<0.05 vs Np-10 μg Exo 組或Np-20 μg Exo 組.

2.5 胎盤外泌體對滋養(yǎng)細胞的細胞周期影響

流式細胞周期檢測結(jié)果顯示，NP-Exo對HTR8細胞的細胞周期無明顯影響，而GDM-Exo能明顯促進HTR8細胞的細胞周期進展，即處于G1期的細胞比例顯著減少，S期細胞明顯增加，且GDMExo 的濃度越高對HTR8細胞的細胞周期進展的促進作用越強。與對照組相比，GDM-10 μg Exo組及GDM-20 μg Exo組的滋養(yǎng)細胞處于G1期的細胞比例顯著降低，S期的細胞比例顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），NP-10 μg Exo組、NP-20 μg Exo組無明顯變化（P>0.05）；與NP-10 μg Exo組或NP-20 μg Exo組相比，GDM-10 μg Exo組及GDM-20 μg Exo組的滋養(yǎng)細胞周期進展顯著增加（P<0.05）（圖4，見封二）。

圖4 GDM胎盤外泌體促進滋養(yǎng)細胞的細胞周期進展。A：對照組；B：NP-10 μg Exo 組；C：NP-20 μg Exo 組；D：GDM-10 μg Exo 組；E：GDM-20 μg Exo 組；F：不同細胞周期的細胞比例。*P<0.05 vs 對照組；#P<0.05 vs NP-10 μg Exo 組或Np-20 μg Exo 組.

2.6 胎盤外泌體對滋養(yǎng)細胞凋亡的影響

Annexin V-FITC/PI凋亡實驗結(jié)果顯示，NPExo對HTR8細胞凋亡率無明顯影響，而GDM-Exo明顯抑制HTR8細胞的凋亡，且GDM-Exo 的濃度越高對HTR8細胞的凋亡抑制率越強。與對照組相比，GDM-10 μg Exo組及GDM-20 μg Exo組滋養(yǎng)細胞在GDM-Exo處理24 h后，細胞的凋亡率明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），NP-10 μg Exo組、NP-20 μg Exo組滋養(yǎng)細胞無明顯變化（P>0.05）；與NP-10 μg Exo組或NP-20 μg Exo組相比，GDM-10 μg Exo組及GDM-20 μg Exo組的滋養(yǎng)細胞凋亡率均顯著降低（P<0.05）（圖5，見封二）。

圖5 GDM胎盤外泌體抑制滋養(yǎng)細胞發(fā)生凋亡。A：對照組；B：NP-10 μg Exo 組；C：NP-20 μg Exo 組；D：GDM-10 μg Exo 組；E：GDM-20 μg Exo 組；F：各組HTR8細胞的凋亡率. *P<0.05 vs 對照組；#P<0.05 vs NP-10 μg Exo 組或NP-20 μg Exo 組.

3 討論

GDM 是指在妊娠后首次發(fā)現(xiàn)或發(fā)生糖代謝異常的疾病，其一般發(fā)生在妊娠的中晚期，是一種常見的妊娠合并癥。根據(jù)流行病學(xué)研究顯示，GDM在我國的發(fā)病率增加了2.8 倍（1999年為2.4%，2008年為6.8%）[15]，而2017年國內(nèi)GDM 多中心研究顯示其發(fā)病率已高達12.2%[16]。GDM 嚴(yán)重影響母嬰健康，大量研究數(shù)據(jù)顯示，GDM 不僅增加胎兒并發(fā)癥，如巨大兒、新生兒低血糖、高膽紅素血癥等的發(fā)生率，還增加孕婦慢性高血壓、心血管疾病以及2 型糖尿病的發(fā)病率[17]。外泌體自1983年被Harding 等[18]發(fā)現(xiàn)以來，其作為細胞間重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要載體已被人們廣泛重視。外泌體直徑為30～150 nm，內(nèi)含豐富蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、RNA 等生物活性物質(zhì)，其主要標(biāo)志物為CD63、TSG101、CD81 等[6]。胎盤組織作為高度特異化器官，其來源的外泌體不僅表達上述外泌體標(biāo)志性蛋白，同時還表達PLAP，后者是鑒定外泌體來源于胎盤組織的重要標(biāo)志分子之一。

既往研究表明，胎盤外泌體對維持正常的妊娠及胚胎的發(fā)育起著關(guān)鍵作用，如在妊娠相關(guān)的免疫耐受中顯示，胎盤外泌體能夠通過表達具有生物活性的死亡信使Fas配體與TRAIL，從而觸發(fā)細胞凋亡來介導(dǎo)母胎間免疫耐受[19]；Miranda等[20]報道胎盤外泌體在母體血漿中的表達量反映了胚胎的生長情況。同時，與正常發(fā)育的胎兒相比，胎兒宮內(nèi)生長受限的胎盤外泌體分泌顯著減少。在子癇前期的研究中證實，子癇前期患者胎盤外泌體能夠通過高表達miR-155抑制血管內(nèi)皮細胞釋放具有舒張血管作用的內(nèi)皮型一氧化氮合酶，從而導(dǎo)致血管收縮，最終誘發(fā)子癇前期的產(chǎn)生[21]。研究顯示，與正常妊娠女性相比，GDM患者在孕早、中、晚期胎盤外泌體的濃度分別為1.6倍、1.5倍及1.3倍[6]，提示胎盤外泌體可能參與調(diào)節(jié)GDM的發(fā)生和發(fā)展。

滋養(yǎng)細胞是胎盤組織的主要成分，其正常功能對胎盤的形成和妊娠的維持具有重要作用[22]。既往在對GDM 相關(guān)研究中表明，GDM 患者胎盤中滋養(yǎng)細胞的增殖活力顯著增加，而細胞凋亡減少，細胞周期相關(guān)蛋白表達增加，導(dǎo)致胎盤組織生長較大，進而引起胎兒過度發(fā)育，新生兒體質(zhì)量增加[12，23]。本研究結(jié)果顯示，與正常妊娠的胎盤外泌體相比，GDM 外泌體能夠顯著促進滋養(yǎng)細胞的增殖、細胞周期進展，并抑制其發(fā)生凋亡，且外泌體濃度越高，其對上述滋養(yǎng)細胞的作用越大。提示妊娠期糖尿病中胎盤外泌體可能通過促進滋養(yǎng)細胞的增殖、細胞周期進展，抑制其發(fā)生凋亡等作用參與妊娠期糖尿病發(fā)生和發(fā)展，為外泌體在妊娠期糖尿病中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。