長(zhǎng)鏈非編碼RNA linc-STXBP5-1在宮頸癌中的表達(dá)及其干預(yù)效應(yīng)分析*

鄒阮敏，　余　霞，　張文淼，　陳冠閣，　朱　華△，　蘇華芳

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1婦產(chǎn)科，2病理科，3放化療科，浙江 溫州 325000)

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長(zhǎng)鏈非編碼RNA linc-STXBP5-1在宮頸癌中的表達(dá)及其干預(yù)效應(yīng)分析*

鄒阮敏1，余霞2，張文淼1，陳冠閣1，朱華1△，蘇華芳3△

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1婦產(chǎn)科，2病理科，3放化療科，浙江 溫州 325000)

[摘要]目的： 檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA linc-STXBP5-1在宮頸癌組織中的表達(dá)及意義，細(xì)胞學(xué)水平分析其對(duì)宮頸癌細(xì)胞活力及侵襲力的影響。方法: Real-time PCR檢測(cè)48例宮頸鱗癌組織、9例宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)Ⅱ-Ⅲ、20例CINⅠ和20例正常宮頸組織 linc-STXBP5-1的表達(dá)水平；分析linc-STXBP5-1在不同病理級(jí)別和臨床分期宮頸鱗癌中的表達(dá)情況； linc-STXBP5-1 siRNA干預(yù)HPV16(+) SiHa宮頸癌細(xì)胞后，檢測(cè)細(xì)胞活力；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默linc-STXBP5-1后SiHa宮頸癌細(xì)胞的侵襲能力；最后檢測(cè)linc-STXBP5-1在宮頸癌細(xì)胞胞漿及胞核的定位表達(dá)。結(jié)果: 宮頸鱗癌及CINⅡ-Ⅲ組織linc-STXBP5-1表達(dá)明顯高于CINⅠ及正常宮頸組織(P<0.05)；宮頸鱗癌與CINⅡ-Ⅲ之間以及CINⅠ與正常宮頸組織間linc-STXBP5-1表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；linc-STXBP5-1表達(dá)與宮頸癌臨床病理分析顯示，病理分級(jí)屬于G3的宮頸鱗癌組織linc-STXBP5-1的表達(dá)量明顯高于G1、G2組織(P<0.05)；臨床分期中屬于Ⅲ和Ⅳ期的宮頸鱗癌組織也明顯高于Ⅰ和Ⅱ期(P<0.05)；linc-STXBP5-1表達(dá)水平與不同年齡、腫瘤直徑和腫瘤類型未見顯著相關(guān)性。利用siRNA下調(diào)SiHa宮頸癌細(xì)胞linc-STXBP5-1表達(dá)后，細(xì)胞活力和侵襲能力顯著降低；定位表達(dá)分析提示linc-STXBP5-1主要表達(dá)于宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞核中，僅有少許表達(dá)于細(xì)胞漿中。結(jié)論: 腫瘤組織上調(diào)表達(dá)的linc-STXBP5-1可作為促癌基因參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程。

[關(guān)鍵詞]長(zhǎng)鏈非編碼RNA； 宮頸癌； 細(xì)胞活力； 細(xì)胞侵襲

非編碼RNA(noncoding RNA，ncRNA)，尤其是轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過200 nt的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)與腫瘤的關(guān)系近年來受到重視。許多研究均證實(shí)，異常表達(dá)的lncRNA參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程[1-2]。Linc-STXBP5-1是一條定位于Chr6:147480061-147502128、長(zhǎng)度為453 nt的lncRNA。我們前期的lncRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)顯示，與正常宮頸組織比較，linc-STXBP5-1在宮頸癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)。本研究進(jìn)一步檢測(cè)48例宮頸癌組織、19例宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)Ⅱ-Ⅲ、20例CINⅠ及20例正常宮頸組織linc-STXBP5-1的表達(dá)，分析其表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系，并在細(xì)胞水平進(jìn)行干預(yù)，分析細(xì)胞基本生物學(xué)特征的變化，探討其在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中可能的調(diào)控作用及意義。

材料和方法

1實(shí)驗(yàn)材料

SiHa宮頸癌細(xì)胞株購(gòu)自中科院上?？茖W(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Opti-MEM培養(yǎng)基、0.05% trypsin、脂質(zhì)體(Lipofectamine 2000) 和TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen；ReverTra Ace逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Master Mix等購(gòu)自Toyobo；胞核和胞漿蛋白提取試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher；Matrigel購(gòu)自BD Bioscience；Transwell小室購(gòu)自Costar；CCK-8試劑盒購(gòu)自Dojindo。siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1標(biāo)本采集48例宮頸鱗癌組織取自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2012年1月～2014年9月就診患者，活檢取材，之前均未行手術(shù)和放、化療。患者年齡34～70歲，中位年齡48.7歲。腫瘤直徑<4 cm 19例，≥4 cm 29例。腫瘤類型：外生型19例，內(nèi)生型15例，潰瘍型10例，頸管型4例。病理分級(jí)：G1 10例，G2 14例，G3 24例。臨床分期：按國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)的分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期8例，Ⅱ期26例，Ⅲ～Ⅳ期14例。19例CINⅡ-Ⅲ患者年齡31～58歲，中位年齡45.6歲。20例CINⅠ患者年齡34～55歲，中位年齡41.4歲。另取同期年齡匹配的應(yīng)子宮肌瘤手術(shù)的正常宮頸組織20份作對(duì)照。標(biāo)本離體后30 min內(nèi)置于液氮保存。宮頸癌、CIN診斷及常規(guī)病理資料由2位病理科醫(yī)師盲法閱片后提供。

2.2RNA的提取取液氮保存的組織標(biāo)本，在液氮中碾碎至粉狀，按TRIzol試劑說明書提取總RNA。為去除可能污染的DNA，抽提的RNA經(jīng)DNaseⅠ處理、酚-氯仿抽提后，純化的RNA以DEPC水溶解。利用Agilent 2100 Bioanalyzer檢測(cè)RNA濃度和完整性。 提取SiHa細(xì)胞RNA，依照胞漿胞核分離提取試劑盒操作。

2.3Linc-STXBP5-1表達(dá)的檢測(cè)參照ReverTra Ace逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，取4 μg總RNA以隨機(jī)引物(hexamer)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件為42 ℃ 60 min、75 ℃ 15 min, 反應(yīng)結(jié)束后-20 ℃保存。以20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行定量PCR檢測(cè)。表1為相關(guān)的引物序列。定量熒光PCR反應(yīng)體系包括1 μL 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、1×SYBR Green I Master Mix、0.5 μmol/L特異前向引物和0.5 μmol/L 特異反向引物。反應(yīng)條件為95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)。Real-time PCR使用ABI Step One儀器進(jìn)行。所有樣品做3復(fù)孔。根據(jù)待測(cè)標(biāo)本的Ct值，以GAPDH作為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因表達(dá)。

2.4Linc-STXBP5-1干預(yù)對(duì)細(xì)胞活力的檢測(cè)HPV16(+) SiHa宮頸癌細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基, 置于37 ℃、含5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng), 2～3 d傳代 1 次。狀態(tài)良好的細(xì)胞以每孔1×105細(xì)胞(100 μL)接種96孔板，linc-STXBP5-1 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，設(shè)20 nmol、40 nmol/L和80 nmol/L 3個(gè)不同濃度的siRNA干預(yù)組、無關(guān)序列對(duì)照組及不含siRNA的空白組。按Lipofectamine 2000說明書轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，加入CCK-8溶液(每孔10 μL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。

2.5Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力按Costar 24-Well TranswellTM說明書操作。將凍存于-20 ℃的Matrigel 4 ℃過夜預(yù)冷成液態(tài)，無血清培養(yǎng)液將Matrigel冰上操作1∶1稀釋，混勻后加入Transwell小室，每孔15 μL。37 ℃包被1 h，無血清培養(yǎng)液洗3次后備用。消化SiHa細(xì)胞后用無血清培養(yǎng)液洗2次，計(jì)數(shù)。向上部培養(yǎng)嵌室內(nèi)加入細(xì)胞懸液(含1×105個(gè)細(xì)胞)并加入無血清DMEM稀釋至400 μL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。向底部培養(yǎng)室加入600 μL含15% FBS的DMEM完全培養(yǎng)液。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。吸去嵌室內(nèi)的液體，用棉棒擦去嵌室底部?jī)?nèi)表面上的細(xì)胞，將嵌室浸入固定液(50%甲醇)固定15 min，PBS洗3遍。結(jié)晶紫染色30 min。風(fēng)干后，熒光顯微鏡下每個(gè)培養(yǎng)孔隨機(jī)選擇6個(gè)視野拍照計(jì)數(shù)并計(jì)算每個(gè)視野的平均數(shù)。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。宮頸組織linc-STXBP5-1表達(dá)以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示，兩組間差異分析采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，多組差異表達(dá)分析采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析及Bonferroni檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1宮頸鱗癌、CIN及正常宮頸組織linc-STXBP5-1的表達(dá)

以GAPDH為內(nèi)參照，linc-STXBP5-1在宮頸鱗癌、CINⅡ-Ⅲ、CINⅠ及正常宮頸組織中的相對(duì)表達(dá)量分別為16.73(3.92，28.49)、12.46(5.55，17.50)、4.46(0.91，7.21)和2.05(0.58，3.20)。秩和檢驗(yàn)結(jié)果表明，宮頸鱗癌及CINⅡ-Ⅲ的linc-STXBP5-1表達(dá)明顯高于CINⅠ及正常宮頸組織(P<0.05)，且宮頸鱗癌與CINⅡ-Ⅲ之間以及CINⅠ與正常宮頸組織間linc-STXBP5-1表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖1。

Figure 1.Expression of linc-STXBP5-1 in cervical cancer (CC), CINⅡ-Ⅲ, CINⅠ and normal cervical (NC) tissues.*P<0.05vsnormal;#P<0.05vsCINⅠ.

圖1宮頸鱗癌、CINⅡ-Ⅲ、CINⅠ及正常宮頸組織中l(wèi)inc-STXBP5-1的表達(dá)水平

2Linc-STXBP5-1表達(dá)與宮頸鱗癌臨床病理特征相關(guān)性分析

如表2 所示，linc-STXBP5-1表達(dá)在不同病理分級(jí)及臨床分期的宮頸鱗癌組織存在明顯差異(P<0.05)，病理分級(jí)屬于G3的宮頸鱗癌組織linc-STXBP5-1的表達(dá)量明顯高于G1、G2組織(P<0.05)；臨床分期中屬于Ⅲ和Ⅳ期的宮頸鱗癌組織也明顯高于Ⅰ和Ⅱ期(P<0.05)。Linc-STXBP5-1表達(dá)水平與不同年齡、腫瘤直徑和腫瘤類型未見顯著相關(guān)性。

表2Linc-STXBP5-1表達(dá)與宮頸癌臨床病理因素的相關(guān)性分析

Table 2.Correlation between clinicopathological features and linc-STXBP5-1 expression in 48 specimens

*The data were presented as median and interquatile range.

3沉默linc-STXBP5-1的對(duì)宮頸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響

為分析linc-STXBP5-1的效應(yīng)，本研究進(jìn)一步利用siRNA沉默HPV16(+) SiHa細(xì)胞株中l(wèi)inc-STXBP5-1表達(dá)。20、40和80 nmol/L siRNA干預(yù)均可明顯降低細(xì)胞內(nèi)linc-STXBP5-1的表達(dá)。40 nmol/L siRNA與50 nmol/L siRNA干擾效果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，為此選擇40 nmol/L 進(jìn)行后續(xù)干預(yù)實(shí)驗(yàn)。如圖2所示，40 nmol/L siRNA干預(yù)后，CCK-8法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力顯著降低。如圖3所示，Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)遷移侵襲能力發(fā)現(xiàn)，沉默linc-STXBP5-1可顯著降低細(xì)胞的侵襲能力。

Figure 2. The viability of SiHa cells after by silencing of linc-STXBP5-1.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal control (NC).

圖2沉默linc-STXBP5-1對(duì)SiHa細(xì)胞活力的影響

Figure 3.The cell invasion after silencing of linc-STXBP5-1. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC.

圖3沉默linc-STXBP5-1對(duì)SiHa細(xì)胞侵襲能力的影響

4Linc-STXBP5-1在宮頸癌細(xì)胞的定位表達(dá)分析

利用胞漿胞核分離提取試劑盒，分別提取SiHa細(xì)胞的胞漿及胞核RNA，利用real-time PCR方法檢測(cè)linc-STXBP5-1的表達(dá)水平，如圖4，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該lncRNA主要表達(dá)于細(xì)胞核中，僅有少許表達(dá)于細(xì)胞漿中。

Figure 4.The subcellular localization of linc STXBP5-1 expressed in the SiHa cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscytoplasm.

圖4linc-STXBP5-1在SiHa細(xì)胞株中的亞細(xì)胞定位表達(dá)

討論

近年越來越多的研究表明，lncRNA在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平以及表觀遺傳等多個(gè)層面參與了X染色體沉默、基因組印記以及染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過程[3]，異常表達(dá)的lncRNA不但是腫瘤特異標(biāo)記物，也可以作為腫瘤治療的分子靶點(diǎn)[4]。但lncRNA與宮頸癌關(guān)系的研究目前尚處于起步階段。有報(bào)道MALAT1、HOTAIR、CCHE1、CCAT2、CET、EBIC等lncRNA的上調(diào)表達(dá)和MEG3、LET及GAS5等的下調(diào)表達(dá)參與促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展[5-10]。

Linc-STXBP5-1是一條定位于人染色體6q24.3、長(zhǎng)度為453 nt的典型基因間lncRNA[11]。其功能迄今尚未有相關(guān)研究報(bào)道。我們前期lncRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)顯示，與正常宮頸組織比較，linc-STXBP5-1在宮頸癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)。本研究通過real-time PCR進(jìn)一步證實(shí)了芯片篩選的結(jié)果。分析其在CINⅡ-Ⅲ和CINⅠ組織表達(dá)顯示，linc-STXBP5-1不但在宮頸癌，而且在CINⅡ和Ⅲ的表達(dá)也明顯高于CINⅠ及正常宮頸組織。與宮頸癌臨床病理特征相關(guān)分析顯示，病理分級(jí)屬于G3的宮頸鱗癌組織linc-STXBP5-1的表達(dá)量明顯高于G1、G2組織，臨床分期中屬于Ⅲ和Ⅳ期的宮頸鱗癌組織明顯高于Ⅰ和Ⅱ期宮頸鱗癌組織。沉默宮頸癌細(xì)胞linc-STXBP5-1表達(dá)后，可顯著降低其活力及侵襲能力，提示linc-STXBP5-1是宮頸癌的一個(gè)新的促癌基因。既往的研究發(fā)現(xiàn)，宮頸腫瘤組織上調(diào)表達(dá)的MALAT1和HOTAIR可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞活力、侵襲和遷移，可作為宮頸癌不良預(yù)后的一個(gè)生物標(biāo)志[9,12-15]。本研究發(fā)現(xiàn)的linc-STXBP5-1也將是一個(gè)新的宮頸癌診斷生物標(biāo)志及潛在的治療靶點(diǎn)。

目前僅少數(shù)的lncRNA在宮頸癌中的作用機(jī)制被闡明。MALAT1可通過miR-124、miR-145及上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化等作用參與宮頸癌的發(fā)展[12,16-17]，而HOTAIR不但可通過調(diào)節(jié)VEGF、MMP-9及其它EMT相關(guān)基因表達(dá)促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖遷移[13-15]，而且可抑制p21促進(jìn)宮頸癌惡性表型和放射治療的抵抗[18]。但是，關(guān)于linc-STXBP5-1調(diào)控機(jī)制迄今尚無相關(guān)研究報(bào)道。本研究通過檢測(cè)細(xì)胞核和細(xì)胞漿中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)linc-STXBP5-1主要分布于細(xì)胞核內(nèi)。研究顯示，約50%的lincRNA可通過招募多種染色質(zhì)修飾復(fù)合物，如PCR2蛋白復(fù)合體，發(fā)揮表觀遺傳學(xué)調(diào)控作用[19]。而基因組染色體上linc-STXBP5-1相鄰的區(qū)域含TCF21、SYNE1、AKAP12、IL20RA、ACAT2等高度甲基化的抑癌基因[20]。是否linc-STXBP5-1通過招募染色體修飾復(fù)合物影響其鄰近區(qū)域抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)的表觀遺傳學(xué)調(diào)控有待進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Expression and intervention effect of long noncoding RNA linc-STXBP5-1 in cervical cancer

ZOU Ruan-min1, YU Xia2, ZHANG Wen-miao1, CHEN Guan-ge1, ZHU Hua1, SU Hua-fang3

(1DepartmentofObstetrics&Gynecology,2DepartmentofPathology,3DepartmentofRadiationOncology,TheFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China.E-mail: 23444176@qq.com; 12602639@qq.com)

[KEY WORDS]Long noncoding RNA; Cervical carcinoma; Cell viability; Cell invasion

[ABSTRACT]AIM: To determine the expression of long noncoding RNA linc-STXBP5-1 in cervical cancer and its clinical significance, and to further explore its effect on the viability and invasion of cervical cancer cell line.METHODS: The expression levels of linc-STXBP5-1 in the cervical squamous-cell carcinoma tissues, cervical intraepithelial neoplasia (CIN)Ⅱ-Ⅲ, CINⅠ, and normal cervical tissues were detected by real-time PCR. The correlation between linc-STXBP5-1 expression and clinicopathological features of cervical cancer was further analyzed. Linc-STXBP5-1 knockdown was established by transfecting siRNA into human cervical cancer SiHa cells. The effect of linc-STXBP5-1 on cell viability and invasion ability was evaluated by CCK-8 assay and transwell assay, respectively. To determine the subcellular localization of linc-STXBP5-1 expression, the nuclear and cytoplasmic RNA fractions were isolated, and linc-STXBP5-1 expression was quantified by real-time PCR.RESULTS: Compared with CINⅠand normal cervical tissues, the level of linc-STXBP5-1 was significantly upregulated in the cervical squamous-cell carcinoma and CINⅡ-Ⅲ (P<0.05). No significant difference was observed either between the cervical squamous-cell carcinoma and CINⅡ-Ⅲ, or between CINⅠ and the normal cervical tissues. The clinical correlation analysis suggested that linc-STXBP5-1 expression in G3 cervical squamous-cell carcinoma tissues was obviously higher than that in G1 and G2 (P<0.05). At the same time, linc-STXBP5-1 expression in the cervical squamous-cell carcinoma with stage Ⅲ -Ⅳ was significantly higher than that with stage Ⅰ-Ⅱ (P<0.05). The expression level of linc-STXBP5-1 did not relate to age, tumor size and tumor type. Knockdown of linc-STXBP5-1 expression by siRNA reduced the viability and invasion in HPV16 (+) SiHa cervical cancer cells. Analysis of subcellular localization indicated that the transcript of linc-STXBP5-1 was mainly expressed in the nucleus of SiHa cells, rarely in cytoplasm. CONCLUSION: The upregulation of linc-STXBP5-1 expression may function as an oncogene in the development and progression of cervical carcinoma.

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)06- 1127- 06

[收稿日期]2016- 03- 24[修回日期] 2016- 04- 26

*[基金項(xiàng)目]浙江省自然科學(xué)青年基金科研資助項(xiàng)目(No. LQ15C010002);溫州市科技局科研基金資助項(xiàng)目(No. Y20140308)

通訊作者△Tel: 0577-88069216; E-mail: 朱華 23444176@qq.com; 蘇華芳 12602639@qq.com

[中圖分類號(hào)]R730.23；R711.74

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.028