香鱗毛蕨DfGNOM基因的克隆及其表達(dá)分析

邱曉杰，湯 珣，官亞琳，張冬瑞，蘇 穎，常 纓*

(1 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2 北京師范大學(xué) 南山附屬學(xué)校，廣東 深圳 518000)

小G蛋白(small G protein)作為一種“分子開關(guān)”在真核生物的生命活動(dòng)中起著重要的作用，它調(diào)控了多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并與蛋白質(zhì)的分配運(yùn)輸、細(xì)胞骨架的形成以及細(xì)胞分化有著密切聯(lián)系[1-2]。GNOM是介導(dǎo)小G蛋白從非活性狀態(tài)(ARF-GDP)轉(zhuǎn)變/轉(zhuǎn)換為活化狀態(tài)(ARF-GTP)的關(guān)鍵因子，處于活化狀態(tài)的小G蛋白能夠與效應(yīng)器分子作用而共同完成相應(yīng)的生理功能[3]，同時(shí)參與ADP 核糖基化因子(ADP-ribosylation factor，ARF)的活化來調(diào)控細(xì)胞內(nèi)蛋白的囊泡運(yùn)輸和生物膜轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而影響生物的生長發(fā)育和對生物脅迫的抗性[2,4]。據(jù)報(bào)道，GNOM是冷脅迫反應(yīng)途徑的重要組成部分；GNOM的過度表達(dá)和膜定位的改變通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)生長素的穩(wěn)態(tài)來增強(qiáng)擬南芥(Arabidopsisthaliana)的抗寒性[5]。研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因擬南芥中過表達(dá)AtGNOM，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)生長素的穩(wěn)態(tài)賦予轉(zhuǎn)基因植株對低溫脅迫的耐受性[5]。GNOM是ARF-GEF家族成員之一，定位于細(xì)胞的內(nèi)體，參與蛋白的分揀[2]，是蛋白質(zhì)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基運(yùn)輸所必需的成員[6-8]，與植物的生長發(fā)育和生長素的正常運(yùn)輸相關(guān)[9-11]。AtGNOM突變體植株產(chǎn)生gnom胚胎畸形，胚根缺失[12]等現(xiàn)象。AtGNOM蛋白可以通過介導(dǎo)乳突合成關(guān)鍵元件 PEN1 的運(yùn)輸，從而提高植物對非生物脅迫的抗性，該過程需要 SA、JA 和 ET 等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的參與[13-14]。小麥(Trticumaestivum)TaGNOM1基因在不同非生物脅迫(高溫、低溫和高鹽)和外源ABA呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式[15]，但是其參與非生物脅迫(高溫、低溫、干旱和高鹽等)和植物激素(ABA、SA、Eth、IAA和MeJA等)的機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步探索。

香鱗毛蕨(Dryopterisfragrans)是鱗毛蕨科鱗毛蕨屬植物，具有抗真菌、抗腫瘤、抗過敏、治療銀屑病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等作用[16-22]，是一種非常珍貴的藥用草本植物，多生長于高寒地區(qū)的滑石坡、森林中的碎石坡上和火山周圍的巖漿縫隙中[23]。因此，香鱗毛蕨是在蕨類植物中研究DfGNOM基因抗逆功能的珍貴材料。本研究克隆了DfGNOM基因，通過qRT-PCR檢測DfGNOM基因在不同組織以及不同脅迫下的表達(dá)，為深入研究香鱗毛蕨DfGNOM基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為探索香鱗毛蕨的抗逆機(jī)制提供參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

本研究所用的香鱗毛蕨為人工快繁的孢子體幼苗，培養(yǎng)溫度為22 ℃，相對濕度50%左右，光周期條件為(光照/黑暗)16 h/8 h[24]。

取幼苗數(shù)株，流水沖洗植株表面，用吸水紙吸干水分，對照組葉片噴灑蒸餾水，實(shí)驗(yàn)組分別為葉片噴灑10 μmol·L-1IAA、10 μmol·L-1ABA、100 μmol·L-1MeJA和500 μmol·L-1ETH等4種激素，整株澆灌200 mmol·L-1NaCl、20% PEG3350，以及42 ℃高溫和4 ℃低溫處理，在處理0、0.5、1、3、6、12、24和48 h后分別取樣。取樣時(shí)將樣品剪成1 cm小段并包裝，置于液氮中速凍后放-80 ℃冰箱中備用。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成香鱗毛蕨不同組織的總RNA提取，包括根、葉柄以及葉片，采用Trizol法(擎科,中國哈爾濱)參考說明書進(jìn)行。cDNA合成采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(擎科,中國哈爾濱)說明書進(jìn)行。

1.2.2DfGNOM基因克隆在香鱗毛蕨轉(zhuǎn)錄組中利用擬南芥中的AtGNOM基因進(jìn)行Blast，獲得DfGNOM基因CDS全長。根據(jù)基因全長設(shè)計(jì)正、反向引物以及進(jìn)行拼接的正、反向引物，引物序列詳見表1，擴(kuò)增目的基因。用反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，PCR體系為：①1 μL模板DNA，1 μL CDS正向引物，1 μL拼接反向引物，10 μL 2×Taq酶緩沖液，加滅菌水補(bǔ)至20 μL。②1 μL模板DNA，1 μL 拼接正向引物，1 μL CDS反向引物，10 μL 2×Taq酶緩沖液，加滅菌水補(bǔ)至20 μL。③1 μL①模板DNA，1 μL②模板DNA，CDS正、反向引物各1 μL，10 μL 2×Taq酶緩沖液，加滅菌水補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min，95 ℃ 15 s，59 ℃ 15 s，72 ℃ 40 s，30個(gè)循環(huán)；最后4 ℃保溫。每個(gè)樣品重復(fù)3次。擴(kuò)增引物純化回收后，對其進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后將其連接到克隆載體pEASY-T18上，經(jīng)過菌落以及菌液PCR檢測后送往哈爾濱睿博生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。所用PCR引物由哈爾濱擎科生物技術(shù)有限公司合成。

表1 試驗(yàn)所用引物

1.2.3 生物信息學(xué)分析利用ExPASy-ProtParam tool對DfGNOM蛋白的氨基酸序列進(jìn)行組成成分以及理化性質(zhì)的分析，并利用在線軟件進(jìn)行DfGNOM亞細(xì)胞定位、信號肽、跨膜區(qū)和保守基序(motif)等預(yù)測。具體網(wǎng)站詳見表2。

表2 生物信息學(xué)分析所用網(wǎng)址

運(yùn)用NCBI中的Blastp進(jìn)行其他物種的GNOM蛋白同源氨基酸序列檢索，使用DNAMAN進(jìn)行GNOM蛋白的氨基酸序列同源比對，獲得序列再利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析其與其他物種之間的進(jìn)化關(guān)系。

1.2.4DfGNOM的表達(dá)分析DfGNOM基因的qRT-PCR特異引物使用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，并以Df18sRNA為內(nèi)參基因，所用引物序列詳見表1。PCR反應(yīng)試劑為SYBR Premix Ex TaqTM(擎科，中國哈爾濱)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)系統(tǒng)為Mx- 3000p Real-Time PCR System。反應(yīng)體系及程序參考試劑說明書，采取2-ΔΔCt法計(jì)算待測基因的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。所用引物由哈爾濱擎科生物技術(shù)有限公司合成。數(shù)據(jù)顯著性分析采用SPSS 26.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 DfGNOM基因的獲得

根據(jù)設(shè)計(jì)出的DfGNOM基因的CDS引物以及拼接引物，對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，電泳結(jié)果與目標(biāo)片段長度基本一致，拼接序列上游、拼接序列下游以及基因全長分別為2 220、2 120和4 338 bp(圖1)。

M.DL5000; 1.拼接序列上游; 2. 拼接序列下游; 3.DfGNOM圖1 DfGNOM基因的RT-PCR擴(kuò)增M. DL5000; 1. Upstream of splicing sequence; 2. Downstream of splicing sequence; 3. DfGNOMFig.1 RT-PCR of DfGNOM gene

2.2 DfGNOM蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

DfGNOM基因4 338 bp，共編碼1 445個(gè)氨基酸。經(jīng)ExPASy-ProtParam tool在線預(yù)測DfGNOM蛋白的一級結(jié)構(gòu)結(jié)果表明，相對分子質(zhì)量為161.13 kD，理論等電點(diǎn)(PI)為5.67，為酸性蛋白；其不穩(wěn)定系數(shù)為50.12，屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)；保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示，DfGNOM蛋白第561～745個(gè)氨基酸為sec7。DfGNOM蛋白的信號肽以及跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析顯示，DfGNOM蛋白無信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域；利用Softberry在線程序?qū)fGNOM蛋白預(yù)測結(jié)果顯示，DfGNOM定位于細(xì)胞質(zhì)中。

2.3 DfGNOM蛋白質(zhì)多序列比對、系統(tǒng)進(jìn)化樹和motif分析

經(jīng)過DNAMAN9.0軟件進(jìn)行多序列比對顯示，香鱗毛蕨GNOM蛋白質(zhì)與江南卷柏(Selaginellamoellendorffii)、水稻(Oryzasativa)和玉米(Zeamays)的GNOM蛋白質(zhì)相似性分別為68.10%、60.69%和59.82%。在DfGNOM蛋白質(zhì)序列中561～745 為sec7保守結(jié)構(gòu)域(圖2)。

黑色下劃線為sec7結(jié)構(gòu)域圖2 DfGNOM蛋白質(zhì)多序列比對The black underlined is the sec7 domainFig.2 Multiple sequence alignment of DfGNOM protein

利用MEGA7.0軟件對江南卷柏、阿月渾子(Pistaciavera)、川桑(Morusnotabilis)等物種與香鱗毛蕨DfGNOM蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對分析，進(jìn)化樹結(jié)果如圖3所示，香鱗毛蕨DfGNOM與江南卷柏SmGNOM的親緣關(guān)系較近，與麻風(fēng)樹和蓖麻等植物的GNOM關(guān)系較遠(yuǎn)。

經(jīng)在線分析軟件MEME對DfGNOM蛋白質(zhì)的保守motif進(jìn)行預(yù)測(圖3)，DfGNOM蛋白含有15個(gè)motif，每個(gè)motif的長度均為50 aa。motif功能分析表明，motif 1、3、8中含有sec7結(jié)構(gòu)域，motif 2、9、12與高爾基體運(yùn)輸功能相關(guān)。香鱗毛蕨與江南卷柏和玉米中的GNOM蛋白具有相同的motif。

2.4 DfGNOM基因的組織表達(dá)分析

為進(jìn)一步推測DfGNOM基因的功能，以Df18sRNA為內(nèi)參，采用qRT-PCR分析DfGNOM基因在香鱗毛蕨根、葉柄和葉中的表達(dá)(圖4)。其中，DfGNOM基因在香鱗毛蕨葉片中相對表達(dá)量最豐富，其次是葉柄，而根中的相對表達(dá)量較低，但是后兩者差異不顯著。

不同字母表示處理間顯著差異(P<0.05)圖4 香鱗毛蕨不同組織中DfGNOM的相對表達(dá)Different letters indicated significant differences among treatments (P < 0.05)Fig.4 Relative expression of DfGNOM in different tissues of D. fragrans

2.5 植物激素處理后DfGNOM基因的表達(dá)特性

在IAA、ABA、MeJA和ETH等4種植物激素處理下，對香鱗毛蕨葉片中DfGNOM的表達(dá)進(jìn)行了qRT-PCR分析。結(jié)果(圖5)表明，DfGNOM的相對表達(dá)量在4種植物激素處理后均發(fā)生改變。其中，在10 μmol·L-1IAA處理下，DfGNOM的相對表達(dá)量總體表現(xiàn)為上調(diào)，在48 h顯著高于對照；在10 μmol·L-1ABA處理下，DfGNOM的相對表達(dá)量總體上呈下調(diào)，但在6 h處理下顯著高于對照；在100 μmol·L-1MeJA和500 μmol·L-1ETH處理后，DfGNOM相對表達(dá)量的變化趨勢正好相反。在MeJA處理12 h后，其相對表達(dá)量大約是0 h的2.5倍。DfGNOM相對表達(dá)量在ETH所有處理時(shí)間均明顯下調(diào)且顯著低于對照，于48 h達(dá)到最低，大約是0 h的1/5(圖5)。

處理內(nèi)不同小寫字母表示處理時(shí)間之間在0.05水平存在顯著性差異，下同圖5 不同植物激素處理下香鱗毛蕨葉片中DfGNOM的相對表達(dá)The different normal letters within same treatments indicate significant difference among times at 0.05 level, the same as belowFig.5 Relative expression of DfGNOM in D. fragrans leaves under different plant growth regulator stresses

2.6 不同非生物脅迫處理后DfGNOM基因的表達(dá)特性

在干旱、NaCl、高溫和低溫處理下,對香鱗毛蕨葉片中DfGNOM的表達(dá)進(jìn)行了qRT-PCR分析。結(jié)果(圖6)表明，在干旱處理下，DfGNOM基因隨著處理時(shí)間的增加，其相對表達(dá)量呈現(xiàn)“升-降-升-降”的變化趨勢，在1 h時(shí)達(dá)到峰值。NaCl處理后呈

圖6 不同非生物脅迫處理香鱗毛蕨葉片中DfGNOM的相對表達(dá)Fig.6 Relative expression of DfGNOM in D. fragrans leaves under different abiotic stresses

現(xiàn)“降-升-降”的變化趨勢。在高溫處理下，DfGNOM基因相對表達(dá)量在0.5 h時(shí)達(dá)到峰值，約為0 h的8倍，而其他處理時(shí)間下均低于0 h。與0 h相比，低溫處理0.5、48 h后相對表達(dá)量有顯著差異，處理1～24 h相對表達(dá)量無明顯差異。本研究結(jié)果顯示，非生物脅迫對DfGNOM的表達(dá)有影響，說明在香鱗毛蕨面對非生物脅迫時(shí)DfGNOM可能具有一定調(diào)節(jié)功能。

3 討 論

GNOM編碼小G蛋白的GDP/GTP交換因子，參與GTP酶的激活，導(dǎo)致結(jié)合的GDP從GTP酶中解離[25]。ARF-GEFs高度保守的sec7結(jié)構(gòu)域促進(jìn)了ARF的結(jié)合和GDP/GTP交換，該結(jié)構(gòu)域有助于通過膜運(yùn)輸招募效應(yīng)蛋白[26]。本研究克隆和鑒定了香鱗毛蕨中GNOM的同源基因DfGNOM，綜合多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹，該基因編碼的蛋白含有sec7 保守結(jié)構(gòu)域，與江南卷柏和玉米的GNOM具有高度同源性。另外，在保守motif分析中除了發(fā)現(xiàn)sec7結(jié)構(gòu)域，還發(fā)現(xiàn)了關(guān)于鳥嘌呤核苷酸交換因子在高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)N端和關(guān)于Ⅲ類細(xì)胞色素C家族的結(jié)構(gòu)域，證實(shí)DfGNOM是屬于香鱗毛蕨ARF-GEF基因家族的成員。本研究鑒定的DfGNOM的保守結(jié)構(gòu)域可能為后續(xù)該基因的功能研究提供依據(jù)和參考。

關(guān)于對GNOM的組織表達(dá)特異性目前在擬南芥、水稻、大麥(Hordeumvulgare)和小麥等植物中有報(bào)道[15]。有研究表明，GNOM可能在不同的組織中發(fā)揮不同的作用[11,27]。本研究中，DfGNOM基因在香鱗毛蕨地上及地下等不同組織中均表達(dá)。因此DfGNOM基因可能參與調(diào)節(jié)香鱗毛蕨體內(nèi)物質(zhì)的運(yùn)輸從而影響植株生長。

目前關(guān)于GNOM的研究主要集中在擬南芥，認(rèn)為其是通過參與植物的囊泡運(yùn)輸來影響植物的生長發(fā)育[28-30]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在外源激素IAA處理下，香鱗毛蕨葉片中DfGNOM的相對表達(dá)量總體上調(diào)。在外源激素ETH處理下，香鱗毛蕨葉片中DfGNOM在所有時(shí)間處理后其相對表達(dá)量均顯著低于對照。這說明DfGNOM與乙烯以及生長素信號途徑有明顯關(guān)系，與脫落酸等信號途徑關(guān)系不明顯。此外，GNOM在植物受到非生物脅迫時(shí)，可以通過調(diào)控植物囊泡運(yùn)輸，從而影響植物的抗逆性[31-33]。本試驗(yàn)研究表明，在低溫處理下，與對照組相比，DfGNOM相對表達(dá)量顯著上調(diào)。在擬南芥中也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象，可能是由于GNOM蛋白質(zhì)激活A(yù)RF-GTP酶來招募提供抗寒脅迫的效應(yīng)蛋白，同時(shí)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)生長素的穩(wěn)態(tài)來增強(qiáng)擬南芥的抗寒性[5]。在水稻中，GNOM的過表達(dá)顯著提高了水稻的耐冷性，而GNOM的下調(diào)導(dǎo)致了水稻對冷害的敏感性[34]。在干旱和NaCl處理下，DfGNOM的相對表達(dá)量總體上呈上升趨勢，但在干旱處理下與對照組相比有顯著差異，說明DfGNOM基因可能對干旱脅迫比較敏感，受滲透脅迫誘導(dǎo)[35]。這與小麥GNOM在干旱脅迫下表達(dá)量的變化相似[15]。在高溫處理下，DfGNOM的相對表達(dá)量也有不同程度的變化。可能是因?yàn)橄泖[毛蕨本身就是生長在火山周圍的巖漿縫隙中[36]，可忍耐高溫[37]，獨(dú)特的生理特性增加了香鱗毛蕨對高溫的適應(yīng)能力，這可能是它在長期進(jìn)化中自然馴化的結(jié)果。這些結(jié)果進(jìn)一步表明該基因可能參與香鱗毛蕨非生物逆境脅迫的調(diào)控。DfGNOM基因是否具有及如何參與調(diào)控響應(yīng)香鱗毛蕨抗逆等方面的功能仍需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，DfGNOM響應(yīng)IAA、ABA、MeJA、ETH以及干旱、高鹽、高溫、低溫8種脅迫處理，且相對表達(dá)量均呈不同程度的變化，說明DfGNOM可能參與了抗逆途徑，這為后續(xù)研究香鱗毛蕨抗逆性以及植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的響應(yīng)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。