百子蓮脫水素基因ApY2SK2逆境應(yīng)答模式及啟動子調(diào)控功能研究

陳曉童，呂 可，2，劉 濤，張 荻*

(1 上海交通大學(xué) 設(shè)計學(xué)院 風(fēng)景園林系，上海 200240；2 杭州千島湖全域旅游有限公司，杭州 311700)

干旱、極端溫度和鹽堿等逆境脅迫會導(dǎo)致植物組織或器官的機械損傷，細胞失水，膜脂過氧化等脅迫傷害，甚至導(dǎo)致植物的死亡[1]。脫水素是植物抵御逆境脅迫的一類重要保護蛋白，它具有穩(wěn)定細胞膜、清除自由基和保護細胞免受脫水傷害等功能[2]。一些植物遭受干旱、低溫和滲透等逆境脅迫，脫水素類保護蛋白會大量表達積累。研究表明植物的抗逆能力與脫水素基因在逆境脅迫下的表達相關(guān)，通常在抗逆植株中的脫水素表達量高于敏感型植株[3-4]。啟動子是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的控制中心，可響應(yīng)多種上游調(diào)控信號[5-6]。不同植物的脫水素的蛋白功能與響應(yīng)模式差別巨大[7-8]。因此，挖掘具有抗逆保護功能的脫水素基因及揭示其基因應(yīng)答機制對于植物逆境脅迫具有重要研究意義。

脫水素等基因的啟動子通常含有較多的與組織定位、逆境和激素響應(yīng)相關(guān)的順式調(diào)控元件，能夠有效控制基因的組織表達，逆境及激素信號響應(yīng)。已有研究報道表明，陸地棉(Gossypiumhirsutum)LEA基因D34啟動子可以驅(qū)動GUS基因在擬南芥種子中的特異性表達，具有嚴(yán)格的種子表達專一性[9]。水稻OsPM1啟動子和番茄(Solanumlycopersicum)脫水素基因SlDHN2b的啟動子序列含多個與逆境相關(guān)的順式調(diào)控元件，可以響應(yīng)干旱、高鹽、ABA等逆境和激素信號[10-11]。厚藤(Ipomoeapes-caprae)脫水素基因的啟動子可驅(qū)動基因在異源植物中穩(wěn)定表達，且在鹽、滲透脅迫和ABA激素處理下基因呈上調(diào)表達趨勢[12]。啟動子上順式調(diào)控元件間可協(xié)同發(fā)揮作用，ABRE元件可以同CE3、DRE、CRT及其他順式調(diào)控元件共同參與干旱脅迫下的ABA應(yīng)答反應(yīng)[13]。研究基因的啟動子在一定程度上可以揭示基因的功能，并為基因的表達調(diào)控機制研究提供基礎(chǔ)。

超低溫保存可以用來保存植物胚性細胞等珍貴離體種質(zhì)資源，超低溫保存為防止胞內(nèi)冰晶形成，利用植物玻璃化液(PVS)進行預(yù)處理，但在超低溫保存的預(yù)處理過程中，存在低溫脅迫、高滲脅迫、脫水脅迫等復(fù)合逆境脅迫，這些脅迫會對植物胚性細胞造成離子毒害、氧化脅迫傷害等。前期本團隊在百子蓮胚性愈傷組織超低溫處理過程中篩選出能積極響應(yīng)復(fù)合逆境脅迫的脫水素蛋白ApY2SK2[14-15]，并開展了一系列蛋白保護功能的相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)ApY2SK2脫水素蛋白中含有2個Y片段，1個S片段和2個K片段，屬于YnSKn型脫水素，并在滲透、脫水和低溫脅迫下對植物細胞具有重要的保護功能[16]。為進一步了解ApY2SK2脫水素基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式，利用染色體步移法克隆出ApY2SK2脫水素基因上游約1 200 bp的啟動子序列，進行順式調(diào)控元件預(yù)測分析，利用基因表達定量分析百子蓮脫水素基因ApY2SK2表達模式，分別利用瞬時轉(zhuǎn)化煙草和穩(wěn)定轉(zhuǎn)化擬南芥探究不同脅迫和激素處理下ApY2SK2啟動子不同缺失片段的活性，明確了該啟動子的類型和核心功能區(qū)域，以揭示在不同逆境下脫水素基因ApY2SK2的應(yīng)答調(diào)控模式，為園林植物抗逆遺傳改良提供一種基因調(diào)控工具。

1 材料和方法

1.1 植物材料與實驗試劑

百子蓮(Agapanthuspraecox)‘藍色大花’(Big Blue)、野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana)為Col-0、本氏煙草(Nicotianabenthamiana)、pBI121質(zhì)粒均由本實驗室長期保存；染色體步移試劑盒、植物基因組DNA提取試劑盒、RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB Green Premix EX TaqTM Ⅱ、限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶購于大連寶生物工程有限公司。大腸桿菌感受態(tài)DH5α和農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101購自上海唯第生物有限公司。SanPrep柱式DNA 膠回收試劑盒和常規(guī)生化藥品與引物合成由上海生工生物有限公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 百子蓮ApY2SK2啟動子序列克隆及順式調(diào)控元件分析利用染色體步移法，以百子蓮基因組DNA為模板，經(jīng)過兩次3輪連續(xù)的熱不對稱巢式PCR，克隆ApY2SK2脫水素基因5′-端上游啟動子序列。下游特異性引物(ApY2SK2-SP1-1/2/3，ApY2SK2-SP2-1/2/3)見表1，上游引物AP Primer和具體的PCR程序均參考 TaKaRa 染色體步移試劑盒。第一次染色體步移以ApY2SK2-SP1-1/2/3特異性引物和AP1隨機引物進行3輪熱不對稱PCR。根據(jù)第一輪染色體步移獲得的基因序列設(shè)計ApY2SK2-SP2-1/2/3作為特異性引物進行第二次染色體步移，進行3輪PCR。Clustalx(1.81)軟件拼接和修正兩次克隆的測序結(jié)果，最終得到ApY2SK2基因上游的啟動子序列。利用Promoter 2.0 Prediction Server和plantCARE啟動子分析軟件，預(yù)測其轉(zhuǎn)錄起始位點與順式調(diào)控元件。

1.2.2 百子蓮ApY2SK2脫水素基因表達模式分析取百子蓮植株的根、葉、花和果不同組織的樣品進行RNA提取、cDNA反轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR測定不同組織中ApY2SK2基因的表達量?；谡n題組前期對脫水素ApY2SK2轉(zhuǎn)基因擬南芥研究[16]及百子蓮抗逆性相關(guān)研究文獻[17-18]，選取干旱(20% PEG)、滲透(400 mmol/L甘露醇)、鹽(3% NaCl)、低溫(4 ℃)、高溫(45 ℃)對百子蓮幼苗進行脅迫處理。在0、1、3、6、12和24 h對根尖和葉尖進行取樣；對百子蓮幼苗進行ABA激素(100 mol/L)噴施處理，于0、0.5、1、2、4 和8 h進行根尖和葉尖取樣。提取樣品總RNA、反轉(zhuǎn)錄成cDNA，應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)測定不同脅迫和激素處理下百子蓮根和葉中ApY2SK2基因的表達量。以Ap-Actin為內(nèi)參基因，引物見表1，數(shù)據(jù)處理采用2-ΔΔCt法。

1.2.3ApY2SK2啟動子缺失片段克隆及植物表達載體構(gòu)建根據(jù)ApY2SK2啟動子順式調(diào)控元件分析結(jié)果，進行ApY2SK2啟動子5′-缺失片段克隆，5條正向引物和1條反向引物見表1。將5個ApY2SK2啟動子5′-缺失片段和pBI121載體經(jīng)HindⅢ和XbaⅠ雙酶切后相連，分別用5個ApY2SK2啟動子5′-缺失片段替換pBI121載體的CaMV35S啟動子，形成融合表達載體。轉(zhuǎn)化大腸桿菌，選取陽性菌進行測序，利用凍融法將5個ApY2SK2融合表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，檢測并保存。

表1 實驗中使用的引物

1.2.4ApY2SK2啟動子缺失片段瞬時轉(zhuǎn)化煙草葉片人工氣候箱(溫度26 ℃，光周期16 h光照/8 h黑暗)培養(yǎng)至4～6周的本氏煙草用于瞬時表達分析，方法參照Wang等[19]的方法。以含pBI121空載的GV3101農(nóng)桿菌株為陽性對照，GV3101菌株為陰性對照。培養(yǎng)農(nóng)桿菌菌液至OD600為0.5左右，離心10 min收集菌體，MS液體培養(yǎng)基重懸菌體至OD為0.6，加入AS(終濃度0.2 mmol/L)和MES溶液(終濃度10 mmol/L)混勻，于28 ℃黑暗中靜置3 h用于侵染。含各ApY2SK2啟動子5′-缺失片段融合表達載體菌液以及陽性對照和陰性對照菌液分別注射煙草葉片，侵染后的煙草暗培養(yǎng)24 h后用于后續(xù)不同逆境、激素誘導(dǎo)實驗。用注射器向葉片注入4% PEG溶液、200 mmol/L NaCl溶液和50 mol/L ABA溶液后暗培養(yǎng)24 h。對整株煙草進行4 ℃低溫處理4 h后暗培養(yǎng)4 h。應(yīng)用打孔器取樣進行GUS蛋白組織染色分析，方法參照J(rèn)efferson[20]的方法。取植物材料，于GUS染色液中37 ℃保溫24 h后，用70%的酒精進行脫色處理，體視顯微鏡下鏡檢觀察并拍照保存。

1.2.5 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化與陽性植株的篩選鑒定利用花序侵染法將上述構(gòu)建完成的植物融合表達載體遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥。將獲得的轉(zhuǎn)基因T1代種子在含50 mg/L卡那霉素(Kana)的MS固體培養(yǎng)基上篩選陽性轉(zhuǎn)化植株。以表1中載體通用引物和Kana基因特異性引物進行PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)基因植株。直至獲得T3代種子，用于后續(xù)實驗檢測。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS組織化學(xué)染色取ApY2SK2啟動子轉(zhuǎn)基因擬南芥5、7、10和14 d的幼苗和成熟葉片、花以及不同發(fā)育階段的角果進行GUS組織化學(xué)染色，37 ℃保溫24 h后，用70%的酒精進行脫色，體視顯微鏡觀察并拍照保存。

1.2.7 不同逆境與外源激素誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS活性測定經(jīng)消毒后的T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子播種于MS固體培養(yǎng)基上，放置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d后分別移入20% PEG、400 mmol/L D-Mannitol、200 mmol/L NaCl的MS固體培養(yǎng)基進行干旱、滲透和鹽脅迫處理，移入4 ℃低溫培養(yǎng)箱進行低溫脅迫處理；噴施100 mol/L ABA進行外源激素處理。以轉(zhuǎn)入pBI121空載的擬南芥為陽性對照，以不做任何外源處理的植株為空白對照。參照Wang等[19]的方法，對不同逆境與外源激素處理下轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS活性進行定量檢測。GUS活性測定參照J(rèn)efferson[20]的方法，取各處理組轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，液氮研磨后進行蛋白的提取，考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量，使用酶標(biāo)法測定GUS催化生成的產(chǎn)物4-MU的熒光強度，根據(jù)4-MU濃度標(biāo)曲計算出各樣品的GUS活性。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SAS 9.1.3對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，LSD(least significant difference test，最小顯著差異檢驗)進行差異顯著性分析，Origin 9.1軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 百子蓮ApY2SK2啟動子序列及順式調(diào)控元件分析

以百子蓮基因組DNA為模板，經(jīng)過兩次3輪連續(xù)的熱不對稱巢式PCR，克隆出ApY2SK2脫水素基因5′-端上游啟動子序列。第一次染色體步移經(jīng)3輪熱不對稱PCR后，以ApY2SK2-SP1-1和AP1為引物的第3泳道(圖1，A)獲得5′-端上游710 bp的基因序列。第二次染色體步移，以ApY2SK2-SP2-1/2/3作為特異性引物(表1)，經(jīng)3輪PCR后獲得932 bp啟動子序列(圖1，B)。Clustalx(1.81)軟件拼接和修正2次克隆的測序結(jié)果，最終得到ApY2SK2基因上游1 200 bp的啟動子序列。

M. DL2000；A. 第一次染色體步移：1. ApY2SK2-SP1-1；2. ApY2SK2-SP1-2；3. ApY2SK2-SP1-3; B. 第二次染色體步移：1.ApY2SK2-SP2-1；2. ApY2SK2-SP2-2；3. ApY2SK2-SP2-3圖1 百子蓮脫水素基因ApY2SK2啟動子染色體步移凝膠電泳M. DL2000; A. Primary chromosome walking：1. ApY2SK2-SP1-1; 2. ApY2SK2-SP1-2; 3. ApY2SK2-SP1-3; B. Secondary chromosome walking：1. ApY2SK2-SP2-1; 2. ApY2SK2-SP2-2; 3. ApY2SK2-SP2-3Fig.1 Agarose gel electrophoresis of chromosome walking for ApY2SK2 promoter

將百子蓮ApY2SK2啟動子序列提交PlantCARE在線分析，預(yù)測結(jié)果(圖2，表2)表明，ApY2SK2啟動子含有多個結(jié)構(gòu)元件如TATA BOX和CAAT BOX，3種激素響應(yīng)元件CE3/ABRE(脫落酸應(yīng)答元件)、GARE-motif(赤霉素應(yīng)答元件)，6種脅迫響應(yīng)元件LTR(低溫應(yīng)答元件)、MBS(MYB結(jié)合位點干旱應(yīng)答元件)、HSE(熱激應(yīng)答元件)、GC-motif(厭氧誘導(dǎo)增強子)、ARE(厭氧應(yīng)答元件)和TC-rich repeats(防御與應(yīng)激應(yīng)答元件)，5種光響應(yīng)元件G-box、GATA-motif、GT1-motif、I-box和ACE，兩種生長發(fā)育調(diào)控元件Skn-1 motif和RY-element。

起始密碼子 “ATG”的“A”被指定為“+ 1”。順式作用元件使用方框，下劃線標(biāo)記，紅色標(biāo)注的為與逆境脅迫及激素調(diào)控相關(guān)的元件，水平箭頭表示方向。序列上方的垂直箭頭表示不同缺失片段的起始點; 藍色核苷酸序列代表用于擴增缺失片段的特殊正向引物圖2 ApY2SK2啟動子DNA序列The “A” of the translation initiation code “ATG” of ApY2SK2 was designated as “+ 1”. Putative cis-acting elements are boxed and underlined. Cis-elements related with stress and hormone are marked in red. The horizontal arrows show their directions.The vertical arrow above the sequence indicates the start point of different deletion fragments; the blue nucleotide sequences represent special primers for amplifying deletion fragmentsFig.2 DNA sequences of ApY2SK2 promoter

表2 ApY2SK2啟動子區(qū)域順式調(diào)控元件預(yù)測

2.2 百子蓮脫水素基因ApY2SK2在不同組織和逆境下表達模式分析

利用實時熒光定量PCR分析脫水素基因ApY2SK2在百子蓮根、葉、花等不同組織中的表達情況。結(jié)果(圖3)表明，ApY2SK2的表達具有組織特異性，其中在葉和果中表達量較高，且差異顯著，在根和花中微量表達。

不同小寫字母代表同一處理下于不同組織間差異著性(P<0.05)圖3 百子蓮ApY2SK2基因在不同組織中的表達Different normal letters represent significant differences among different tissues(P<0.05)Fig.3 Expression patterns of ApY2SK2 gene in different tissues of A. praecox

百子蓮脫水素基因ApY2SK2啟動子序列含有多種與逆境脅迫和激素相關(guān)的順式調(diào)控元件，為了進一步探究逆境脅迫、激素與脫水素基因ApY2SK2的表達模式之間的調(diào)控關(guān)系，對百子蓮幼苗進行干旱、滲透、鹽、低溫和高溫逆境處理，噴施 ABA進行激素處理，分析ApY2SK2基因在不同脅迫、激素處理下的表達模式。結(jié)果(圖4)表明，在百子蓮幼苗空白對照(0 h)處理下，ApY2SK2基因在根和葉中的轉(zhuǎn)錄表達水平較低，說明正常生長的百子蓮幼苗中ApY2SK2基因的轉(zhuǎn)錄水平較低；而在逆境和激素處理下，百子蓮幼苗中的ApY2SK2基因轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，其中根中ApY2SK2基因?qū)Ω珊?、滲透和鹽處理具有積極的響應(yīng)，而葉片中ApY2SK2對高溫、低溫和ABA處理響應(yīng)較強。在PEG(干旱)脅迫處理下，ApY2SK2基因于12 h在根中表達量達到峰值，與0 h相比，上調(diào)18.34倍(圖4，A)；在滲透處理下，ApY2SK2基因在根和葉中的表達均呈現(xiàn)單峰模式，在12 h達到峰值，與0 h相比，在根中的表達上調(diào)266.10倍，在葉中的表達上調(diào)75.58倍(圖4，B)；在NaCl(鹽)處理下，與0 h相比，6 h時ApY2SK2基因在根中的表達達到峰值，上調(diào)116.74倍，而在葉中的表達變化小(圖4，C)；在低溫處理下，與0 h相比，3 h時ApY2SK2基因在葉中的表達達到峰值，上調(diào)187.18倍，而在根中的上調(diào)表達幅度小(圖4，D)；在高溫處理下，與0 h相比，ApY2SK2基因在葉和根中的表達變化均小，于1 h時在葉中ApY2SK2基因的表達達到峰值，上調(diào)2.55倍(圖4，E)；在ABA處理下，ApY2SK2基因主要在葉中上調(diào)表達，于處理2 h時達到峰值，上調(diào)126.24倍(圖4，F(xiàn))。綜上，百子蓮ApY2SK2基因的表達顯著受非生物逆境，如干旱、鹽、滲透、低溫和高溫，以及ABA激素信號的誘導(dǎo)。百子蓮ApY2SK2基因?qū)B透和低溫脅迫信號響應(yīng)最強，其次是鹽和ABA，對高溫信號響應(yīng)較弱。

不同小寫字母代表同一組織不同處理時間差異顯著(P<0.05)圖4 百子蓮葉和根在逆境脅迫和激素處理下ApY2SK2基因的相對表達量Different normal letters represent significant differences among different time points with the same tissue(P<0.05)Fig.4 Expression patterns of ApY2SK2 gene in leaves and roots of Agapanthus praecox under virous abiotic stress and hormone treatments

2.3 ApY2SK2啟動子缺失片段克隆及植物表達載體構(gòu)建與鑒定

為明確ApY2SK2啟動子的核心功能區(qū)域，根據(jù)啟動子順式調(diào)控元件分析結(jié)果對獲得的啟動子片段進行5′-端缺失克隆，并且成功構(gòu)建了5個植物融合表達載體(圖5)。將植物融合表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，并用含有上述植物融合表達載體的農(nóng)桿菌侵染液成功侵染擬南芥，經(jīng)抗性篩選和PCR檢測鑒定，獲得T3代純和轉(zhuǎn)基因擬南芥株系用于后續(xù)實驗。

Ⅰ. ApY2SK2啟動子∷GUS載體構(gòu)建體的示意圖；nos pro，胭脂堿合成酶啟動子；nos terminator，胭脂堿合成酶終止子；GUS，β-葡萄糖苷酶基因；RB 和 LB，左右T-DNA 邊界；ApY2SK2啟動子在載體中的插入位置用限制性內(nèi)切酶位點表示(Hind Ⅲ和Xba Ⅰ)。 Ⅱ. 用于測定轉(zhuǎn)基因擬南芥和本氏煙草葉中 GUS 活性的不同 5′-缺失ApY2SK2啟動子構(gòu)建體的示意圖。標(biāo)尺為ATG起始位點上游堿基數(shù)目，不同形狀和顏色的圖形代表主要的順式作用元件圖5 ApY2SK2啟動子及其缺失片段表達載體載體構(gòu)建示意圖Ⅰ. Schematic representation of ApY2SK2 promoter∷GUS vector constructs; nos pro, nopaline synthase promoter; nos ter, nopaline synthase terminator; GUS, β-glucosidase gene; RB and LB, left and right T-DNA borders; The insertion position of the ApY2SK2 promoter in the vector is indicated with restriction enzyme sites (Hind Ⅲ and Xba Ⅰ). Ⅱ. Schematic representation of the different 5′-deletion ApY2SK2 promoter constructs used to assay GUS activity in transgenic Arabidopsis thaliana and tobacco leaves. These constructs are based on the pBI121 vector. The main cis-elements are represented with different patternsFig.5 Schematic representation of construction of different deletion constructions of ApY2SK2 promoter

2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS組織化學(xué)染色分析

為揭示ApY2SK2基因的啟動子活性及其在植物發(fā)育過程中的組織表達模式，分別對轉(zhuǎn)基因擬南芥不同生長時間(5、7、10和14 d)的植株、成熟葉片、花、不同發(fā)育階段的角果進行GUS組織化學(xué)染色，結(jié)果如圖6所示，ApY2SK2基因的啟動子能夠驅(qū)動GUS基因的正常表達，具有啟動子活性。ApY2SK2基因的啟動子驅(qū)動的GUS基因在擬南芥幼苗的根和葉中均具有較高的表達活性，在成熟葉片和花中可穩(wěn)定表達，在成熟果實中也具有一定表達活性，但在未成熟果實中無明顯表達。

a. 5 d幼苗；b. 7 d幼苗；c. 10 d幼苗；d. 14 d苗；e. 成熟葉；f. 花；g. 未成熟角果；h. 成熟角果圖6 轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS染色a. 5-day-old seedling; b. 7-day-old seedling; c.10-day-old seedling; d. 14-day-old seedling; e. Mature leaf; f. Flowers; g. Immature siliques; h. Mature siliquesFig.6 GUS histochemical staining of transgenic Arabidopsis thaliana

2.5 轉(zhuǎn)基因煙草在脅迫和激素處理下的GUS瞬時表達

為驗證ApY2SK2啟動子各缺失片段活性及在不同脅迫和激素處理下的響應(yīng)模式，對不同脅迫和激素處理的轉(zhuǎn)基因煙草葉片進行GUS組織化學(xué)染色，結(jié)果如圖7，陽性對照可檢測到GUS基因的表達，葉片呈現(xiàn)深藍色；而陰性對照均無GUS基因的表達，葉片未能染色。在空白處理下(CK)，5個5′-啟動子缺失片段均可驅(qū)動GUS基因表達，說明各缺失片段均具有啟動子活性；而在非生物脅迫處理下，不同5′-啟動子缺失片段驅(qū)動的GUS基因表達有明顯差異性。ABA激素處理下，與空白對照相比各5′-啟動子缺失片段驅(qū)動GUS基因表達均明顯增強，說明各缺失片段均可響應(yīng)ABA激素。干旱處理下，與空白對照相比pApY2SK2-1199、pApY2SK2-946、pApY2SK2-670驅(qū)動的GUS基因表達明顯增強，說明-1 199～-262 bp可響應(yīng)干旱脅迫。而在鹽和低溫脅迫處理下，僅pApY2SK2-1199驅(qū)動的GUS基因表達有顯著差異，說明-1 199～-946 bp可響應(yīng)鹽和低溫脅迫。

圖7 ApY2SK2啟動子及其缺失片段在不同脅迫激素處理下煙草葉片中瞬時表達Fig.7 Transient expression of different ApY2SK2 promoter deletions in tobacco under various abiotic stress or hormone treatments

2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥在脅迫和激素處理下的GUS表達分析

正常環(huán)境(CK)下轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS活性如圖8，pApY2SK2-1199、pApY2SK2-946、pApY2SK2-670啟動子片段驅(qū)動的GUS活性(110.4、84.2、47.0 nmol·min-1·mg-1)與pApY2SK2-262、pApY2SK2-167(2.2、1.5 nmol·min-1·mg-1)存在顯著性差異，表明-1 199～-262 bp為ApY2SK2啟動子的重要活性區(qū)段。

大寫字母代表不同啟動子缺失片段在相同脅迫的顯著差異(P<0.05)；小寫字母代表相同啟動子缺失片段在不同脅迫下的顯著差異(P<0.05)圖8 ApY2SK2啟動子及其缺失片段在不同脅迫激素處理下的GUS活性Capital letters represent the significance of difference between the different ApY2SK2 promoters in the same treated condition (P<0.05); normal letters represent the significance among the same ApY2SK2 promoter under different treatments (P<0.05)Fig.8 GUS activity of transgenic Arabidopsis seedlings containing ApY2SK2 promoter and its deletion constructs under virous abiotic stress and hormone treatments

不同脅迫和激素處理下的轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS基因表達如圖8，PEG處理下，pApY2SK2-1199和pApY2SK2-946的GUS活性與對照相比有顯著差異，分別為對照的6.87、1.80倍，證明ApY2SK2啟動子-1 199～-670 bp可以響應(yīng)干旱脅迫，而位于-1 047～-1 041 bp的 MBS干旱脅迫響應(yīng)元件可參與干旱脅迫應(yīng)答。Mannitol處理下，與干旱結(jié)果一致，pApY2SK2-1199和pApY2SK2-946的GUS酶活與對照相比有顯著性差異，分別為對照的3.46、2.67倍，表明ApY2SK2啟動子-1 199～-670 bp同樣為滲透脅迫的主要響應(yīng)區(qū)域，根據(jù)順式調(diào)控元件分析結(jié)果，-812～-807 bp處的ABRE元件可能參與滲透脅迫應(yīng)答。NaCl處理下，pApY2SK2-1199、pApY2SK2-946、pApY2SK2-670、pApY2SK2-167的GUS活性與對照相比有顯著差異，為對照的1.50～8.64倍，證明ApY2SK2啟動子-1 199～-262 bp、-167～0 bp可以響應(yīng)鹽脅迫。Cold處理下，pApY2SK2-1199與對照相比有顯著差異，為對照的8.44倍，證明ApY2SK2啟動子-1 199～-946 bp存在順式調(diào)控元件可以響應(yīng)低溫脅迫，與啟動子順式調(diào)控元件預(yù)測結(jié)果一致，-1 040～-1 034 bp的 LTR為低溫脅迫響應(yīng)順式調(diào)控元件。ABA激素處理下，與對照相比，pApY2SK2-1199、pApY2SK2-946、pApY2SK2-670的GUS活性上調(diào)3.25、4.70、3.24倍，證明ApY2SK2啟動子-1 199～-262 bp為ABA激素的響應(yīng)區(qū)域，而-373～-211 bp處存在多個ABRE順式調(diào)控元件可響應(yīng)ABA激素。

3 討 論

脫水素是一種在多種植物中廣泛分布的逆境保護蛋白[21]。研究發(fā)現(xiàn)部分植物脫水素蛋白的組織定位具有時空特異性，即脫水素基因表達受發(fā)育階段和組織器官的影響。基因的表達受啟動子的調(diào)控，啟動子的順式調(diào)控元件能夠決定該基因的表達受哪些轉(zhuǎn)錄因子的控制。為探究ApY2SK2基因的時空表達模式，通過實時熒光定量PCR測定ApY2SK2基因在百子蓮不同組織中表達情況，研究結(jié)果顯示ApY2SK2基因在百子蓮的各組織中均可正常表達，在葉和果中表達量較高；為進一步揭示ApY2SK2啟動子的活性和組織特異性。對ApY2SK2啟動子轉(zhuǎn)基因擬南芥進行GUS組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示ApY2SK2啟動子驅(qū)動下的GUS基因在擬南芥的各發(fā)育階段均可穩(wěn)定表達，但在擬南芥未成熟角果中無明顯表達而在成熟角果中表達。同時ApY2SK2啟動子序列信息分析結(jié)果顯示，在啟動子區(qū)域具有與種胚發(fā)育相關(guān)的生長發(fā)育調(diào)控元件Skn-1 motif、RY-element存在，這正好與上述GUS基因在擬南芥未成熟角果和成熟角果中表達差異特性相吻合，推測ApY2SK2啟動子可調(diào)控種胚的發(fā)育。有文獻報道，棉花的LEA基因D34的啟動子含種子發(fā)育相關(guān)順式調(diào)控元件，貯藏蛋白基因特異表達調(diào)控元件2SSEEDPROTBANAPA (CAAACAC)和胚乳表達必需的調(diào)控元件Skn-1motif (GTCAT)等，并且可以驅(qū)動GUS基因在種子發(fā)育后期特異表達，與ApY2SK2啟動子類似，具有組織特異性和發(fā)育階段性調(diào)控功能[9]。而擬南芥角果在發(fā)育成熟階段，需經(jīng)歷脫水這一過程，亦可推測ApY2SK2啟動子可以響應(yīng)種胚成熟脫水過程中的脅迫信號從而調(diào)控脫水素的表達進而保護細胞免受脫水傷害。

逆境信號與脫水素的轉(zhuǎn)錄調(diào)控間存在密切關(guān)系。已有研究證實，當(dāng)植物遭受干旱、低溫、鹽堿和滲透等脅迫時，脫水素會大量表達積累以增強植物的抗逆性。應(yīng)用實時熒光定量PCR測定ApY2SK2基因在不同脅迫和激素處理下的ApY2SK2表達水平，結(jié)果顯示其表達量在滲透、低溫、鹽脅迫、干旱和ABA激素處理下顯著上調(diào)。而ApY2SK2啟動子序列含有2種ABA激素響應(yīng)元件CE3、ABRE和6種脅迫響應(yīng)元件LTR、MBS、HSE、GC-motif、ARE和TC-rich repeats，表明該啟動子可能受ABA激素及多種逆境信號的誘導(dǎo)進而調(diào)控基因的表達。為進一步證明了ApY2SK2啟動子具有響應(yīng)不同逆境和激素信號的調(diào)控功能，基于其順式調(diào)控元件分布情況，對ApY2SK2啟動子進行5′-缺失實驗驗證。煙草葉片瞬時表達分析結(jié)果顯示，各ApY2SK2啟動子缺失片段均具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性，且在不同脅迫和激素處理下各缺失片段活性存在較大差異，其中各缺失片段對干旱和ABA激素信號具有較強的響應(yīng)。對不同脅迫和激素處理下的ApY2SK2啟動子各缺失片段轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗進行了GUS活性測定，結(jié)果表明ApY2SK2啟動子的多個ABRE元件響應(yīng)ABA、干旱與高滲信號； MBS元件響應(yīng)干旱脅迫； LTR元件可響應(yīng)低溫脅迫。ApY2SK2啟動子-1 199～-262 bp存在8個ABRE元件，并參與多種脅迫和激素信號的應(yīng)答，這與文獻所報道的ABRE元件可以參與干旱、鹽、低溫和ABA等多種逆境和激素應(yīng)答一致[22-24]。據(jù)文獻報道稱，脫水素基因的表達可以分為依賴ABA和不依賴ABA途徑兩種，ABA依賴型脫水素基因上游響應(yīng)ABA調(diào)控的一類順式元件是ABREs[4, 25-26]。ApY2SK2啟動子-373～-211 bp區(qū)段存在多個串聯(lián)ABRE元件，且GUS活性隨ABREs拷貝數(shù)減少而降低，說明ABREs的拷貝數(shù)與啟動子對ABA激素的響應(yīng)程度間存在正相關(guān)關(guān)系，這與已有文獻報道的ABRE元件單拷貝不足以賦予ABA誘導(dǎo)型啟動子轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性的結(jié)果一致[27-29]。本研究中發(fā)現(xiàn)-233～-126 bp的2個ABRE和1個CE3元件不響應(yīng)ABA信號。有報道表明， ABA響應(yīng)元件ABRE和CE3在單子葉植物水稻和雙子葉植物擬南芥中具有不同分布模式：ABRE-ABRE元件(ABRC)在兩個植物基因組中均較為常見，而擬南芥基因組中幾乎沒有CE3元件存在，而在水稻基因啟動子中可檢測到ABRE和CE3元件基序的組合模式。基于上述分析，推測在擬南芥中可能缺少可以結(jié)合ABRE-CE3元件的轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致ABRE-CE3-ABRE元件無法在擬南芥中響應(yīng)ABA激素[30]，可通過實驗進一步進行探究。

本研究從基因和啟動子兩個層面，初步闡釋了ApY2SK2基因在干旱、滲透、鹽、低溫和ABA激素調(diào)控下應(yīng)答模式。并發(fā)現(xiàn)了關(guān)鍵順式調(diào)控元件ABREs的脅迫和激素應(yīng)答模式，后續(xù)可通過酵母單雜交篩選關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，進一步探究ApY2SK2啟動子在種胚發(fā)育過程中和逆境脅迫及激素處理下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。