HPLC-PDA聯(lián)合UPLC-Triple TOF MS法確證恩諾沙星注射液中的非法添加物

宋慧敏，熊 玥，汪云花，孫 瑤，石慧慧

(江蘇省獸藥飼料質(zhì)量檢驗(yàn)所，南京 210036)

自2008年發(fā)現(xiàn)第一例獸藥處方外非法添加物以來，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部對(duì)獸藥處方外非法添加的監(jiān)管與打擊力度不斷加大。除有針對(duì)性的出臺(tái)相關(guān)法律法規(guī)進(jìn)行處罰外，還相繼發(fā)布了一系列公告作為獸藥處方外非法添加物檢查的依據(jù)[1-2]。隨著監(jiān)管手段不斷加強(qiáng)，檢查方法日臻完善，非法添加現(xiàn)象大幅減少，但仍有少數(shù)商家為了搶占市場份額，謀取利益最大化，采取各種手段尋求新的非法添加物。這些物質(zhì)一般不常見，無論是作為獸藥還是人用藥，早已在市場上悄聲匿跡，或才剛上市未進(jìn)入公眾視野，有的甚至還在研發(fā)階段。而目前已發(fā)布的檢查方法多針對(duì)市場份額占有率較高的常用藥，或有跡可循，或可預(yù)測的藥物，這些新開發(fā)的藥物無疑為非法添加的篩查帶來了新的挑戰(zhàn)。目前已發(fā)布的獸藥處方外非法添加物的檢查方法主要采用HPLC-PDA法，少數(shù)采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，這兩種方法均需一定數(shù)量的譜庫數(shù)據(jù)為支撐，而對(duì)于譜庫外非法添加物的識(shí)別和確證就成了非法添加工作中的難點(diǎn)。隨著高分辨質(zhì)譜的飛速發(fā)展，UPLC-TOF MS技術(shù)已越來越多的用于非法添加未知物的篩查。近日，在做非法添加物HPLC-PDA法常規(guī)篩查時(shí)，發(fā)現(xiàn)一批恩諾沙星注射液中有一未知物，根據(jù)其紫外光譜特征及高分辨質(zhì)譜提供的信息推測出疑似添加物，再用HPLC-PDA和UPLC-Triple TOF MS進(jìn)行雙重驗(yàn)證，最終確認(rèn)該非法添加物為加替沙星。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀(Waters Arc 2998)，配二極管陣列檢測器(PDA2998)；超高效液相色譜儀(Shimadzu UPLC LC-30A)-四級(jí)桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(SCIEX Triple TOF 4600)；分析天平(METTLER XS205)。乙腈、三乙胺、甲酸為色譜純(Merk)，水為超純水，磷酸為優(yōu)級(jí)純。

1.2 試藥 加替沙星(含量97.2%)購自中國藥品生物制品檢定所；恩諾沙星(含量99.5%)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；恩諾沙星注射液(100 mL∶2.5 g)為江蘇省內(nèi)風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC-PDA法初篩

2.1.1 色譜條件 XBrige C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；以磷酸溶液A(取磷酸3.0 mL，加水至1000 mL，用三乙胺調(diào)pH值至3.0 ± 0.1，加乙腈50 mL)-甲醇(88∶12)為流動(dòng)相；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；采集波長范圍為190～400 nm，分辨率為1.2 nm；記錄292 nm波長處的色譜圖，同時(shí)記錄光譜圖。

2.1.2 供試品溶液的制備 量取恩諾沙星注射液1.0 mL，置具塞錐形瓶中，加2%磷酸溶液-乙腈(1∶1)50 mL，超聲處理15 min，放置至室溫，取5.0 mL，用磷酸溶液A(2.1.1項(xiàng)下)稀釋至50 mL，搖勻，作為HPLC-PDA 初篩用供試品溶液。

2.1.3 對(duì)照品溶液的制備 稱取恩諾沙星對(duì)照品25 mg，置50 mL容量瓶中，按2.1.2項(xiàng)下方法操作，稀釋制成每1 mL含約50 μg的對(duì)照品溶液。

2.1.4 結(jié)果分析 取供試品溶液和對(duì)照品溶液，在2.1.1項(xiàng)色譜條件下分別進(jìn)樣，供試品溶液色譜圖中未出現(xiàn)與恩諾沙星保留時(shí)間一致的色譜峰，但在30.773 min處有一未知峰。該未知峰在326、292、232 nm處有最大吸收，其紫外光譜與喹諾酮類藥物光譜特征相似，推測此峰為喹諾酮類藥物或類似物。將該光譜圖與建立的非法添加物光譜圖庫進(jìn)行比對(duì)，未匹配到疑似添加物，需借助質(zhì)譜做進(jìn)一步分析。未知物光譜及色譜圖見圖1。

圖1 未知物光譜及色譜圖

2.2 質(zhì)譜法分析

2.2.1 色譜條件 ACQUITY HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，B為0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫(0～6 min，由90% A線性變化為10% A；6～10 min，保持10% A；10～14 min，由10% A線性變化為90% A；14～15 min，保持90% A)；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離(ESI)：正離子模式；噴霧電壓：5500 V；霧化氣：55 psi；加熱輔助氣：55 psi；氣簾氣：35 psi；離子源溫度：500 ℃；掃描模式：MS mode，質(zhì)量范圍100～1000 Da，掃描時(shí)間100 ms；MS/MS mode，質(zhì)量范圍100～1000 Da，掃描時(shí)間50 ms，去簇電壓(DP)80 V，碰撞能量(CE)35 eV，擴(kuò)展碰撞能量(CES)15 eV。

2.2.3 供試品溶液的制備 取供試品溶液1.0 mL，置100 mL量瓶中，用50%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻；取1.0 mL，用50%乙腈溶液稀釋至100 mL，搖勻；再取1.0 mL，用50%乙腈溶液稀釋至100 mL，搖勻，即得。

2.2.4 結(jié)果分析 在2.2.1項(xiàng)和2.2.2項(xiàng)條件下，采集得到未知物的二級(jí)質(zhì)譜圖，利用PeakView軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。根據(jù)預(yù)先導(dǎo)入的40種喹諾酮類化合物譜庫信息，獲得未知物提取離子流(XIC)圖，對(duì)照40個(gè)化合物的TOF-MS 質(zhì)量精度和同位素分布情況，以及TOF-MS/MS譜圖，得到匹配度。最終，在供試品中提取到和Gatifloxacin(加替沙星)相似的一級(jí)質(zhì)譜圖，其精確質(zhì)量數(shù)為376.1667，一級(jí)質(zhì)譜質(zhì)量偏差為0.3 ppm，母離子天然同位素比對(duì)結(jié)果良好(圖2)。另從圖譜解析的角度看，二級(jí)質(zhì)譜圖(圖3)高質(zhì)荷比區(qū)[M+H]+m/z376.1667離子強(qiáng)度最大，且和相鄰碎片里子(m/z358.1561)質(zhì)荷比相差18，屬于合理丟失，推測應(yīng)為未知物的分子離子峰，從而得知該未知物的分子量為375，且分子中含奇數(shù)個(gè)N原子。又從圖中同位素峰的比例看，該未知物不含Cl原子，結(jié)合PDA光譜圖知其應(yīng)為恩諾沙星同類物質(zhì)，推測分子中應(yīng)含有F。對(duì)比40種喹諾酮類化合物，只有加替沙星符合以上所有特征，和譜庫篩選結(jié)果一致。為進(jìn)一步確認(rèn)篩查結(jié)果，分別用HPLC-PDA法和UPLC-Triple TOF MS法對(duì)未知物進(jìn)行驗(yàn)證。

圖2 母離子天然同位素圖

圖3 供試品二級(jí)質(zhì)譜圖

2.3 HPLC-PDA法驗(yàn)證和定量

2.3.1 供試品溶液制備 同2.1.2項(xiàng)下供試品溶液。

2.3.2 對(duì)照品溶液制備 稱取加替沙星對(duì)照品25 mg，按2.1.2項(xiàng)下操作，稀釋制成每1 mL含50 μg的對(duì)照品溶液。

2.3.3 色譜條件 同2.1.1項(xiàng)初篩色譜條件。

2.3.4 結(jié)果分析 將供試品中的未知物與加替沙星保留時(shí)間及紫外光譜圖(圖4)進(jìn)行比對(duì)，以及不同濃度本底添加對(duì)供試品中的未知物進(jìn)行驗(yàn)證。供試品中未知色譜峰與加替沙星的保留時(shí)間一致，紫外光譜圖一致；不同濃度(取對(duì)照品溶液與供試品溶液按 1∶4、1∶1、4∶1 的比例混合)的本底添加試驗(yàn)顯示，添加前后，供試品色譜峰的純度角度均小于純度閾值，可認(rèn)為是單一物質(zhì)峰，光譜的匹配角度均小于匹配閾值，可認(rèn)為是同一化合物。驗(yàn)證結(jié)果表明，供試品溶液中未知物即為加替沙星，驗(yàn)證數(shù)據(jù)和結(jié)果見表1、表2。同時(shí)測得恩諾沙星注射液中非法添加加替沙星的含量為2.2%。

表1 HPLC-PDA 驗(yàn)證結(jié)果

圖4 加替沙星對(duì)照品光譜指數(shù)圖

表2 峰純度與光譜相似度檢查結(jié)果

2.4 UPLC-Triple TOF MS法驗(yàn)證

2.4.1 對(duì)照品溶液的制備 稱取加替沙星對(duì)照品25 mg，用50%乙腈溶液稀釋制成每1 mL含50 ng的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.4.2 供試品溶液的制備 使用2.2.3項(xiàng)下供試品溶液作為確證用供試品溶液。

2.4.3 儀器條件 同2.2.1項(xiàng)和2.2.2項(xiàng)。

2.4.4 結(jié)果分析 在與供試品相同分析條件下，得到加替沙星母離子準(zhǔn)確分子量、母離子天然同位素、二級(jí)質(zhì)譜圖、保留時(shí)間四大信息，并將信息載入軟件譜庫中。將供試品中未知物的譜圖信息與加替沙星譜圖信息進(jìn)行比較，得到一級(jí)質(zhì)譜質(zhì)量偏差為0.2 ppm, 二級(jí)譜庫匹配度為100%，保留時(shí)間基本一致，總體匹配度98%，非法添加的未知物確證為加替沙星(圖5)。為進(jìn)一步增強(qiáng)質(zhì)譜信息的可信度，對(duì)裂解規(guī)律進(jìn)行了推導(dǎo)(圖6)。

圖5 未知物二級(jí)譜圖與加替沙星二級(jí)譜圖的匹配圖

圖6 未知物可能裂解規(guī)律

3 討 論

3.1 非法添加加替沙星合理性分析 恩諾沙星為第三代喹諾酮類藥物，收載于《中國獸藥典》2015版一部[3]，是動(dòng)物專用的廣譜抗菌藥物。加替沙星為第四代喹諾酮類藥物[4]，與大多數(shù)氟喹諾酮抗菌藥相比，增強(qiáng)了對(duì)革蘭陽性菌及厭氧菌的抗菌作用，提高了生物利用度，從而表現(xiàn)出殺菌力強(qiáng)、選擇性高的特點(diǎn)。臨床上多用于呼吸、泌尿、生殖及消化系統(tǒng)等的感染，屬人用藥物。在恩諾沙星注射液中非法添加抗菌作用更強(qiáng)的加替沙星，顯然是為了片面追求療效，搶占經(jīng)營市場。

3.2 非法添加物篩查及確證的一般模式 目前，獸藥制劑中非法添加物的篩查主要基于HPLC-PDA法，將未知物的光譜圖與譜庫中數(shù)據(jù)匹配，根據(jù)匹配結(jié)果，再用對(duì)照品譜圖信息進(jìn)行確證。這不僅要求有一定容量的數(shù)據(jù)庫，而且對(duì)未知物的判定也僅限于庫中化合物。本文將UPLC-Triple TOF MS法與HPLC-PDA法相結(jié)合，利用高分辨質(zhì)譜提供的精確質(zhì)量數(shù)、同位素分布情況、二級(jí)質(zhì)譜圖等信息推測出疑似添加物，再分別用兩種方法進(jìn)行確認(rèn)。在不具備高分辨質(zhì)譜的條件下，也可利用低分辨質(zhì)譜先獲取未知物一級(jí)質(zhì)譜圖，根據(jù)譜圖中分子離子峰和丟失碎片離子特征，結(jié)合譜圖解析和PDA光譜圖推測可能化合物，再進(jìn)行確證。

3.3 擴(kuò)充數(shù)據(jù)庫的重要性 超高效液相色譜串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜不僅能測得化合物的分子式和精確分子量，同時(shí)具備完全定性、定量的特性，具有高分辨率、高靈敏度和高掃描速度等特點(diǎn)[5-6]。但這一切優(yōu)勢都需以強(qiáng)大的數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，所以只有不斷完善、豐富化合物數(shù)據(jù)庫，才能充分發(fā)揮數(shù)據(jù)庫的優(yōu)勢，發(fā)揮儀器本身的優(yōu)勢，進(jìn)而對(duì)可能的非法添加物進(jìn)行全面的篩查和確證。

近年來，在非法添加物的篩查中，恩諾沙星制劑多檢出甲氧芐啶、苯甲酸、煙酰胺、水楊酸等非法添加物，加替沙星的檢出尚屬首次，且在其他制劑中也未曾檢出過加替沙星。說明在高壓的監(jiān)管、處罰手段下，非法添加更加隱蔽，添加方式也更加多樣。希望本文能給獸藥中非法添加物檢查提供一定的方法借鑒，同時(shí)也為監(jiān)督管理部門提供監(jiān)管思路。