甲狀腺細針穿刺殘留物標本BRAF V600E突變檢測聯(lián)合細胞學(xué)診斷在甲狀腺乳頭狀癌中的診斷價值

夏 葦,蘇新良,張陽麗,李雪松,程 偉,張玉洪△

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院：1.檢驗科；2.內(nèi)分泌乳腺外科，重慶 400016

隨著超聲檢查技術(shù)的發(fā)展，越來越多的甲狀腺結(jié)節(jié)被檢出[1]，根據(jù)Bethesda分類系統(tǒng)進行細針穿刺(FNA)細胞學(xué)診斷被認為是最經(jīng)典的術(shù)前鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的方法[2]，然而仍有10%～40%接受FNA細胞學(xué)診斷的患者無法獲得確診[3-5]。因此，聯(lián)合其他的檢查方法進一步明確甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性，提高診斷的靈敏度和準確度顯得非常必要。有研究表明，BRAF V600E突變是甲狀腺乳頭狀癌(PTC)中最常見的分子改變，存在于36%～80%的PTC中，對PTC有較高的特異度[6]。FNA細胞學(xué)診斷的同時進行BRAF V600E突變檢測有助于檢出PTC、指導(dǎo)手術(shù)及避免不必要的手術(shù)。目前，BRAF V600E突變檢測使用的標本主要為額外進行FNA獲取的標本、FNA涂片、細胞塊和術(shù)后切除組織等[7-10]。而使用FNA殘留物標本進行BRAF V600E突變檢測，不用額外進行穿刺，可以最大限度地利用有限的穿刺物。因此，本研究探討了使用FNA殘留物標本檢測 BRAF V600E 突變的可行性及其與細胞診斷學(xué)聯(lián)合在PTC中的診斷價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性收集重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2017年3月至2018年12月收治的1 674例進行甲狀腺FNA的患者信息，均具有完整細胞學(xué)診斷、FNA殘留物標本BRAF V600E突變檢測結(jié)果，患者包括男353例，女1 321例；年齡13～89歲，平均(45±12)歲。其中876例患者進行了手術(shù)切除且有組織病理診斷結(jié)果，包括男208例，女668例，平均年齡(43±12)歲。同時有128例手術(shù)患者的配對術(shù)后切除組織進行了BRAF V600E突變檢測。

1.2方法

1.2.1甲狀腺FNA和細胞學(xué)診斷 在超聲引導(dǎo)下進行甲狀腺FNA，每例患者穿刺2～3針。穿刺液制作成酒精固定的涂片，并使用HE染色。病理醫(yī)師根據(jù)Bethesda分類系統(tǒng)進行細胞學(xué)診斷：(1)標本無法診斷或不滿意；(2)良性病變；(3)意義不明確的細胞非典型病變或濾泡性病變(AUS/FLUS)；(4)濾泡性腫瘤或可疑濾泡性腫瘤(FN/SFN)；(5)可疑惡性(SM)；(6)惡性[5]。

1.2.2標本制備和DNA提取 使用5 mL生理鹽水沖洗針頭內(nèi)剩余物質(zhì)，殘留物儲存于EP管中。按照核酸提取試劑盒(成都新百基生物科技有限公司)說明書提取FNA殘留物DNA。將術(shù)后切除組織制成5 μm厚的切片5張，由病理醫(yī)師在顯微鏡下標記切片中腫瘤細胞比例>50%的區(qū)域，并刮取、加入EP管中，按照核酸提取試劑盒(廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司)說明書提取術(shù)后組織DNA。將FNA殘留物和術(shù)后組織提取出的DNA使用紫外分光光度計(美國賽默飛NanoDrop One)進行濃度和純度檢測，并將DNA濃度稀釋至0.4 ng/μL。

1.2.3擴增阻滯突變系統(tǒng)PCR(ARMS-PCR)檢測 使用人類BRAF V600E突變檢測試劑盒(廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司)進行BRAF V600E突變檢測，每個反應(yīng)體系包含5 μL DNA和35 μL試劑。使用Cobas Z480實時熒光定量PCR儀進行ARMS-PCR，反應(yīng)流程如下：第1階段1個循環(huán)，95 ℃ 5 min；第2階段15個循環(huán)，95 ℃ 25 s、64 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s；第3階段31個循環(huán)，93 ℃ 25 s、60 ℃ 35 s、72 ℃ 20 s。待測標本的內(nèi)控(HEX/VIC)信號有明顯的擴增曲線且Ct值為13～21，則確定檢測有效。當標本的FAM信號Ct值等于或低于28時為BRAF V600E突變型，高于28為BRAF V600E野生型。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 以術(shù)后病理診斷作為金標準計算靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和準確度。使用SPSS25.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。FNA殘留物與術(shù)后切除組織的BRAF V600E突變檢測結(jié)果采用Kappa一致性檢驗分析二者的一致性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同特征患者的BRAF V600E突變檢測結(jié)果比較 男性患者BRAF V600E突變率明顯高于女性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.398，P=0.036)，年齡≤50歲患者BRAF V600E突變率明顯高于年齡>50歲患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=20.404，P<0.001)。918例(54.8%)患者檢測到BRAF V600E突變，6個類別細胞學(xué)診斷標本的BRAF V600E突變率不同，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=792.872，P<0.001)，進一步分析顯示惡性患者的BRAF V600E突變率最高，其他依次為SM和AUS/FLUS患者，標本無法診斷或不滿意、良性病變和FN/SFN患者的突變率較低。見表1。

表1 不同特征患者的BRAF V600E突變檢測結(jié)果比較[n(%)]

2.2876例手術(shù)患者的BRAF V600E突變及病理特征 876例手術(shù)患者中，PTC 846例，良性病變30例，良性病變中結(jié)節(jié)性甲狀腺腫8例，濾泡性腺瘤7例，橋本氏甲狀腺炎5例，正常組織5例，透明樣變3例，亞急性甲狀腺炎1例，纖維組織增生伴炎性細胞浸潤1例。術(shù)后病理診斷和相應(yīng)的FNA細胞學(xué)診斷及BRAF V600E突變檢測結(jié)果見表2。846例患者的術(shù)后病理診斷為PTC的患者中733例(86.6%)患者為BRAF V600E突變型。在138例細胞學(xué)診斷為AUS/FLUS的手術(shù)患者中，131例術(shù)后病理診斷為PTC，BRAF V600E突變檢測在AUS/FLUS手術(shù)患者中的靈敏度為84.7%，準確度為84.1%；在5例細胞學(xué)診斷為FN/SFN的手術(shù)患者中，1例術(shù)后病理診斷為PTC，為BRAF V600E野生型。

表2 876例手術(shù)患者的BRAF V600E突變檢測結(jié)果、細胞學(xué)診斷和術(shù)后病理診斷[n(%)]

2.3FNA殘留物和配對術(shù)后切除組織的BRAF V600E突變檢測結(jié)果 128例手術(shù)患者的配對術(shù)后切除組織的BRAF V600E突變檢測結(jié)果見表3，Kappa一致性檢驗顯示，配對術(shù)后切除組織的BRAF V600E突變檢測結(jié)果與FNA殘留物的BRAF V600E突變檢測結(jié)果具有極好的一致性(Kappa=0.890，P<0.001)。

表3 FNA殘留物和配對術(shù)后切除組織的BRAF V600E突變檢測結(jié)果(n)

2.4BRAF V600E突變檢測、細胞學(xué)診斷單獨及二者聯(lián)合的靈敏度及準確度 對于診斷PTC，BRAF V600E突變檢測和細胞學(xué)診斷的靈敏度分別為86.6%和83.5%，特異度分別為80.0%和90.0%，準確度分別為86.4%和83.7%，見表4。將BRAF V600E突變檢測和細胞學(xué)診斷聯(lián)合使用后，診斷PTC的靈敏度上升至97.2%，且準確度達到最高(96.5%)。

表4 BRAF V600E突變檢測、細胞學(xué)診斷單獨及二者聯(lián)合的診斷價值[%(n/n)]

3 討 論

近年來，PTC的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，F(xiàn)NA細胞學(xué)診斷以其微創(chuàng)、經(jīng)濟、準確度高的優(yōu)勢成為術(shù)前診斷甲狀腺結(jié)節(jié)最常用的方法。本研究中單獨使用細胞學(xué)診斷的準確度為83.7%，與文獻[11-12]報道一致。然而，由于標本取材不滿意、細胞數(shù)量偏少、制片過程不當、形態(tài)學(xué)不典型及病理醫(yī)師經(jīng)驗的差異等，單獨使用細胞學(xué)診斷PTC仍存在16.5%的假陰性率和10.0%的假陽性率。如何正確處理細胞學(xué)診斷中無法明確診斷的患者是臨床診治的難點，而分子診斷技術(shù)的發(fā)展有助于PTC的術(shù)前診斷，其中與PTC關(guān)系最密切的分子標志物是BRAF V600E突變。BRAF V600E突變?yōu)榈? 799位點的胸腺嘧啶突變?yōu)橄汆堰?，?dǎo)致第600位編碼氨基酸由纈氨酸變?yōu)楣劝彼?，誘導(dǎo)BRAF蛋白活化，從而引起MAPK信號通路不斷激活，細胞無限增殖、分化，最后導(dǎo)致PTC的發(fā)生、發(fā)展[13]。研究表明，BRAF V600E突變較少存在于甲狀腺濾泡癌和良性病變中，顯示出較高的特異度，為PTC的診斷提供了新的思路[14-15]。

本研究中PTC患者的BRAF V600E突變率高達86.6%，與國內(nèi)隋燕霞等[16]、張亞麗等[17]的研究結(jié)果一致，也與韓國KIM等[18]報道的81.4%相似。因此，術(shù)前檢測BRAF V600E突變成為除細胞學(xué)診斷外的有效方法。對128例手術(shù)患者的殘留物標本與配對術(shù)后切除組織的BRAF V600E突變檢測結(jié)果進行比對，具有極好的一致性(Kappa=0.890，P<0.001)，證明利用FNA殘留物可以代替額外進行FNA獲取的標本、FNA涂片、細胞塊和術(shù)后切除組織等，使檢測簡便、快速，同時也避免了額外進行FNA、延長操作時間和增加感染、出血等不良反應(yīng)。

聯(lián)合BRAF V600E突變檢測和細胞學(xué)診斷后靈敏度由單獨細胞學(xué)診斷的83.5%提高至97.2%，準確度由83.7%提高至96.5%，陽性預(yù)測值高達99.2%，與ZHAO等[19]的研究結(jié)果相符。目前，臨床一般認為BRAF V600E突變型的患者有著更高的惡性風(fēng)險，建議進行甲狀腺全切術(shù)，而對于BRAF V600E野生型的患者仍不能排除PTC診斷，但可采取更為經(jīng)濟保守的治療方式[2,20]。聯(lián)合診斷后靈敏度和準確度的提高主要得益于增加了細胞學(xué)診斷不確定(AUS/FLUS)患者的BRAF V600E突變檢出率(46.7%)。BRAF V600E突變檢測在進行了手術(shù)的AUS/FLUS患者中的靈敏度為84.7%，準確度為84.1%。因此，增加BRAF V600E突變檢測有助于明確甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性，指導(dǎo)臨床制訂具體的手術(shù)計劃，以及減少不必要的檢查，如診斷性甲狀腺手術(shù)、術(shù)中冰凍和重復(fù)FNA等，特別是對于細胞學(xué)診斷不確定的患者。

本研究也存在一些不足：首先，術(shù)后診斷為良性病變的患者偏少，這可能是由于本研究為回顧性研究，外科醫(yī)生在選擇手術(shù)患者時會結(jié)合BRAF V600E突變檢測、細胞學(xué)診斷、超聲檢查及甲狀腺觸診結(jié)果，僅選擇惡性風(fēng)險高的患者進行手術(shù)，以避免不必要的手術(shù)。對于未實行甲狀腺手術(shù)無術(shù)后病理診斷結(jié)果的患者，還需要進行包含長期超聲和FNA隨訪的研究，以進一步證實BRAF V600E突變檢測的診斷價值。其次，F(xiàn)N/SFN患者的數(shù)量較少，這可能是由于病理醫(yī)師在出具細胞學(xué)診斷結(jié)果時比較謹慎，導(dǎo)致AUS/FLUS患者的數(shù)量更多，而FN/SFN患者數(shù)量偏少。

綜上所述，甲狀腺FNA殘留物標本可用于BRAF V600E突變檢測，其可以最大限度地利用有限的穿刺液提供更多的診斷PTC的依據(jù)。BRAF V600E突變檢測聯(lián)合細胞學(xué)診斷可提高PTC診斷的靈敏度和準確度。