金銀花中肌醇的復(fù)合酶法提取及抗氧化活性評價

馬瀟瀟，田成，向福，2*，艾勇泉

（1.黃岡師范學(xué)院經(jīng)濟林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室，湖北 黃岡 438000；2.湖北省中科產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，湖北 黃岡 438000）

金銀花（Lonicerae japonica Thunb.），屬忍冬科又名忍冬，以其干燥花蕾或帶初開的花入藥，含綠原酸、木犀草苷、肌醇、皂甙、鞣質(zhì)等生物活性物質(zhì)[1-2]。大別山具有豐富的金銀花資源，“羅田金銀花”被批準(zhǔn)為中國國家地理標(biāo)志產(chǎn)品，因此科學(xué)利用好本地的金銀花資源具有現(xiàn)實意義。

肌醇是維生素B族中的一種，與維生素有類似的功能，可用于治療各種維生素缺乏癥[3]；而且能促進肝中脂肪的代謝，臨床上用于治療肝硬化、脂肪肝、肝炎等疾病[4]；同時還能降低血液中膽固醇含量[5]。作為生長因子，肌醇可用于多種菌種的培養(yǎng)并且具有促進酵母生長等作用[6]。在食品工業(yè)，肌醇作為食品營養(yǎng)強化劑具有抗氧化、抗衰老等功效[7-9]。目前，全球肌醇消耗量約為3 600 t，我國肌醇產(chǎn)量為1 600 t，約90%用于出口[10]。

肌醇制備主要有菲汀法[11]、化學(xué)合成法[12]、微生物法[13]、電滲析法[14]等方法。這些方法中有的工藝路線比較復(fù)雜，對設(shè)備要求較高、能量消耗高，隨之消費也比較高；還有一些方法在生產(chǎn)過程中，需要使用大量的酸、堿溶液，對環(huán)境造成了不可逆污染，致使處理“三廢”的費用增加[15]。因此，面對日益增長的應(yīng)用需求，探討從天然植物中制備肌醇的安全加工工藝具有應(yīng)用價值。

酶能溫和高效地降解植物細(xì)胞壁，酶法提取不會破壞物質(zhì)活性，且副產(chǎn)物少，實用安全。其中，纖維素酶能破壞金銀花細(xì)胞壁，使活性物質(zhì)從細(xì)胞中釋放出來[16]。半纖維素酶能夠水解與肌醇相連的半纖維素，有利于肌醇的浸出。本試驗利用纖維素酶和半纖維素酶協(xié)同，探討羅田金銀花中肌醇的酶法提取工藝，從而為大別山金銀花資源的科學(xué)利用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅田金銀花：羅田縣塔山，自然陰干，粉碎過80目篩備用；肌醇標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：上海源葉生物科技有限公司；維生素C標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：武漢睿辰標(biāo)物科技有限公司；纖維素酶（1 800 U/ng）、半纖維素酶（200 000 U/g）：上海金穗生物科技有限公司；高氯酸（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；九水硝酸鐵（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；總抗氧化試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

CP413電子天平：奧豪斯儀器（常州）有限公司；DEKW-D-2型電熱恒溫水浴鍋：北京西城區(qū)醫(yī)療器械廠；UV1901PCS型雙光束紫外可見光分光光度計：上海佑科儀器儀表有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式多用真空泵：河南省予華儀器有限公司；DHG-9147A電熱恒溫干燥箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；KQ-500DB型臺式數(shù)控超聲波清洗器：東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司；GL-21M醫(yī)用離心機：湖南平凡科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 肌醇標(biāo)準(zhǔn)曲線及提取率測定

根據(jù)文獻[17-19]，精確稱取肌醇標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，用超純水溶解配制1 g/L的肌醇標(biāo)準(zhǔn)品母液。取2 mL母液于 100 mL 容量瓶中，加 0.05%Fe（NO3）3溶液（用1%HClO4配制）2 mL，用超純水定容至刻度線，以超純水作空白對照，在200 nm～800 nm處掃描，確定最大吸收波長為201 nm。

精密吸取 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL 標(biāo)準(zhǔn)母液置于7個10 mL的容量瓶中，加0.05%Fe（NO3）3溶液（用1%HClO4配制）2 mL，用超純水定容至刻度線，配制成肌醇濃度為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 g/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以超純水作空白，在201 nm波長下測吸光度，除去0.7 g/L濃度，得到肌醇標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A=1.492 9C+0.02，R2=0.999，A表示吸光度，C表示肌醇質(zhì)量濃度，結(jié)果表明肌醇質(zhì)量濃度在0.1 g/L～0.6 g/L范圍內(nèi)與吸光值線性關(guān)系良好。并按下式計算金銀花中肌醇提取率。

式中：Y為肌醇提取率，%；C為樣品中肌醇質(zhì)量濃度，mg/mL；N為稀釋倍數(shù)；M為金銀花粉末的質(zhì)量，g；V為提取液體積，mL。

1.3.2 精密度試驗

取肌醇標(biāo)準(zhǔn)母液5 mL于10 mL容量瓶，加0.05%Fe（NO3）3溶液 2 mL，用超純水定容至刻度線，以超純水作空白，以最大吸收波長201 nm處測吸光度，并計算其肌醇含量。平行5次，求平均值及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.3 加樣回收率

根據(jù)文獻[20]方法，取8個50 mL容量瓶，分4組。每組容量瓶中各準(zhǔn)確加入0.1 mL肌醇提取液，分別加入肌醇標(biāo)準(zhǔn)母液 0（1～2號試管）、3 mL（3～4號試管）、5 mL（5～6號試管）、7 mL（7～8號試管），然后用超純水定容至50 mL，于201 nm下測其吸光值，并計算其肌醇含量。

1.3.4 單因素試驗

平行稱取3份金銀花粉末5 g分別置于圓底燒瓶中，加入適量的纖維素酶和半纖維素酶，按照1∶20（g/mL）料液比加入 100 mL 超純水，攪拌均勻，置于恒溫水浴鍋中酶解一段時間后放入沸水浴鍋中滅酶10 min后，冷卻到50℃～60℃左右抽濾，定容制得肌醇提取液。考察復(fù)合酶（纖維素酶和半纖維素酶）質(zhì)量比（5∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2）、復(fù)合酶添加量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、酶解時間（60、90、120、150、180 min）、酶解溫度（40、45、50、55、60、65℃）對金銀花肌醇提取率的影響。

1.3.5 正交優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取對金銀花中肌醇提取率影響較為顯著的復(fù)合酶質(zhì)量比、復(fù)合酶添加量和酶解時間3個因素，進行正交試驗設(shè)計，正交試驗因素和水平如表1所示。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Orthogonal test factors and level

1.3.6 總抗氧化能力檢測試驗

根據(jù)文獻方法[21-22]，分別加入 2、4、6、8、10 mL 肌醇提取液于10 mL容量瓶，超純水定容至刻度線，得到系列肌醇樣液。以VC為陽性對照，根據(jù)總抗氧化試劑盒說明書操作，將測試管和對照管中樣液在520 nm波長處測定吸光度，并按下式計算其總抗氧化能力。

式中：T為總抗氧化能力，U/mL；As為測定管吸光度；Ac為對照管吸光度；V為反應(yīng)液總體積，mL；Vt為取樣量，mL；n為稀釋倍數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用正交設(shè)計助手II（v.3.1）和Microsoft Excel 2010等軟件完成試驗設(shè)計和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

精密度試驗的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為3.4%，加樣回收率試驗的RSD為1.7%，且加樣回收率在98.3%～103.1%之間，表明試驗所用的測量儀器精密度良好，檢測方法可靠。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 復(fù)合酶添加量對肌醇提取率的影響

按照纖維素酶和半纖維素酶質(zhì)量比1∶1，料液比1∶20（g/mL）加入超純水，攪拌均勻，置于 60 ℃恒溫水浴鍋中酶解120 min，根據(jù)1.3.4的方法考察復(fù)合酶添加量對金銀花中肌醇提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 復(fù)合酶添加量對肌醇提取率的影響Fig.1 Effect of the amount of multi-enzyme on the extraction rate of inositol

由圖1可知，肌醇提取率隨復(fù)合酶添加量的增加呈現(xiàn)先升后降趨勢，當(dāng)復(fù)合酶添加量為1.0%時，提取率最高，為1.94%；繼續(xù)增加復(fù)合酶量，提取率則下降。這可能是因為復(fù)合酶量增加到一定時，酶分子過于飽和，一部分酶不能與底物結(jié)合，使得酶水解細(xì)胞壁的速度變慢，并且太多的酶具有黏附性，能夠阻塞肌醇的溶出，導(dǎo)致提取率下降[23]。因此，不考慮其他因素的情況下，復(fù)合酶添加量以1.0%為宜。

2.2.2 復(fù)合酶質(zhì)量比對肌醇提取率的影響

按照復(fù)合酶添加量1.0%，料液比1∶20（g/mL）加入超純水，攪拌均勻，置于60℃恒溫水浴鍋中酶解120 min，根據(jù)1.3.4的方法考察纖維素酶和半纖維素酶質(zhì)量比對金銀花中肌醇提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 復(fù)合酶質(zhì)量比對肌醇提取率的影響Fig.2 Effect of the mass ratio of multi-enzyme on the extraction rate of inositol

由圖2中可知，肌醇提取率隨著纖維素酶與半纖維素酶質(zhì)量比的變化呈現(xiàn)明顯的先增后減趨勢，在復(fù)合酶質(zhì)量比2∶1時達到最高，此時肌醇提取率為1.96%。其中復(fù)合酶質(zhì)量比 4∶1、2∶1、1∶1 對肌醇提取率的影響均不明顯，當(dāng)復(fù)合酶質(zhì)量比為1∶2時肌醇提取率明顯下降。纖維素酶能破壞金銀花細(xì)胞壁，使肌醇便于從細(xì)胞中釋放出來，半纖維素酶能夠水解與肌醇相連的半纖維素，有利于肌醇的浸出。因此，復(fù)合酶（纖維素酶∶半纖維素酶）質(zhì)量比以2∶1為宜。

2.2.3 酶解溫度對肌醇提取率的影響

按照復(fù)合酶添加量1.0%，纖維素酶和半纖維素酶的質(zhì)量比 1∶1，料液比 1∶20（g/mL）加入超純水，攪拌均勻，酶解120 min，根據(jù)1.3.4的方法考察酶解溫度對金銀花中肌醇提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 酶解溫度對肌醇提取率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on the extraction rate of inositol

由圖3中可知，酶解溫度由40℃升到60℃時，肌醇提取率逐漸增加，最高為1.94%；升溫至65℃時，提取率則顯著降低。這可能是隨著酶解溫度的升高，擴散速度加快，復(fù)合酶分子活性增加，同時復(fù)合酶與底物的碰撞速率也加快了，使得復(fù)合酶水解細(xì)胞壁的反應(yīng)速率加快，提取率增加[24]。當(dāng)溫度升高至65℃，肌醇提取率急劇下降，則是由于溫度升高導(dǎo)致酶分子的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，大部分復(fù)合酶失活所致。因此，酶解溫度以60℃為宜。

2.2.4 酶解時間對肌醇提取率的影響

按照復(fù)合酶添加量1.0%，纖維素酶和半纖維素酶的質(zhì)量比 1∶1，料液比 1∶20（g/mL）加入超純水，攪拌均勻，置于60℃恒溫水浴鍋中酶解，根據(jù)1.3.4的方法考察酶解時間對金銀花中肌醇提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 酶解時間對肌醇提取率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on the extraction rate of inositol

由圖4可知，當(dāng)酶解時間從60 min增加到90 min時，肌醇提取率迅速增加到最大值，為1.95%。隨著酶解時間延長至150 min，提取率略有下降但不明顯；當(dāng)酶解時間增加到180 min時，提取率則明顯降低。因此，酶解時間對肌醇提取影響明顯，考慮實際操作成本，以90 min為宜。

2.3 正交試驗結(jié)果

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，固定酶解溫度為60℃，以肌醇提取率為評價指標(biāo)，選取酶解時間（A）、復(fù)合酶添加量（B）、復(fù)合酶質(zhì)量比（C）為自變量，設(shè)計L9（34）肌醇提取工藝正交優(yōu)化試驗，結(jié)果如表2所示，方差分析如表3所示。

表2 肌醇提取工藝優(yōu)化試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal test for inositol extraction

表3 正交試驗方差分析Table 3 Analysis and variance of orthogonal test

由表2、表3可知，酶解時間對肌醇提取率影響最大，其次為復(fù)合酶添加量，復(fù)合酶質(zhì)量比影響最??；優(yōu)化工藝條件為A2B3C3，即酶解時間90 min、復(fù)合酶添加量1.5%、復(fù)合酶質(zhì)量比為1∶1。

2.4 驗證試驗

根據(jù)預(yù)測的優(yōu)化條件，按復(fù)合酶質(zhì)量比為1∶1，復(fù)合酶添加量1.5%，酶解時間90 min，根據(jù)1.3.4的方法，平行測定 5次，得肌醇提取率為（1.99±0.02）%，高于表2中最大提取率1.96%。

2.5 總抗氧化能力評價

依據(jù)1.3.1測得優(yōu)化工藝所得金銀花提取液肌醇濃度為（0.99±0.01）g/L；根據(jù)1.3.6的方法，制得肌醇質(zhì)量濃度為 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L 的稀釋液，并以相同濃度VC為陽性對照，計算各溶液的總抗氧化能力，結(jié)果如圖5所示。

圖5 肌醇和VC的總抗氧化能力Fig.5 The total antioxidant capacity of inositol and VC

由圖5可知，肌醇和VC的總抗氧化能力變化趨勢一致，在0.2 g/L～0.6 g/L濃度范圍內(nèi)線性增長關(guān)系明顯，0.6 g/L時達到峰值，分別為（5.31±0.10）U/mL和（41.38±0.35）U/mL；繼續(xù)增加濃度則趨于穩(wěn)定。相同質(zhì)量濃度肌醇的總抗氧化能力相當(dāng)于VC的10.0%～12.8%。

3 結(jié)論

本試驗以羅田金銀花為材料，利用正交試驗優(yōu)化金銀花中肌醇的纖維素酶和半纖維素酶協(xié)同提取工藝，即復(fù)合酶質(zhì)量比1∶1、復(fù)合酶添加量1.5%、料液比1∶20（g/mL），60℃酶解 90 min，肌醇提取率為 1.99%，其總抗氧化能力為相同質(zhì)量濃度VC的10.0%～12.8%。該工藝條件溫和，簡單可行，可用于金銀花中肌醇提取物的工業(yè)化制備。