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    橘子不同部位活性成分含量及其體外抗氧化能力研究

    2021-09-16 07:52:12劉仙俊李文華孫紅艷尤金美張紅陽張?zhí)煊?/span>郝春燕衛(wèi)樂
    食品研究與開發(fā) 2021年17期
    關(guān)鍵詞:橘絡(luò)橘皮總酚

    劉仙俊,李文華*,孫紅艷,尤金美,張紅陽,張?zhí)煊?,郝春燕,衛(wèi)樂

    (1.太原科技大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院,山西 太原 030024;2.山東省臨沂市第十八中學(xué),山東 臨沂 276000)

    橘子,蕓香科柑橘屬(Citrus reticulata Blanco)植物[1],不僅具有豐富的營養(yǎng)價值更具有抗氧化、抗癌、抗菌、抗炎、保護(hù)神經(jīng)、預(yù)防糖尿病和心血管疾病等重要的醫(yī)學(xué)價值[2-3]。橘肉香氣清爽,口感酸甜,富含營養(yǎng)成分,是人們的常食部位,橘皮、橘絡(luò)具有化痰止咳、健脾和胃、順氣活血的功效,經(jīng)常入藥使用[3-5]。橘子各部位的營養(yǎng)價值和其富含多酚類、黃酮類、多糖、礦物質(zhì)、維生素等生物活性物質(zhì)是分不開的[2,6-10],這些天然活性物質(zhì)大多具有抗氧化的作用,能夠清除人體內(nèi)多余的自由基,使機(jī)體免受活性氧自由基傷害而導(dǎo)致的蛋白質(zhì)和核酸受損、酶失活、脂質(zhì)過氧化等不良后果[11-21]。目前對橘子生物活性物質(zhì)的研究主要集中在橘皮,孫紅彥[3]研究表明橘子皮提取物可以保護(hù)機(jī)體免疫器官、提高機(jī)體免疫水平、抑制體內(nèi)實(shí)體瘤的生長從而實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用;劉存芳等[5]研究發(fā)現(xiàn)橘皮多糖對羥基自由基具有較強(qiáng)的清除作用且存在一定量效關(guān)系,但對橘皮、橘肉和橘絡(luò)的生物活性成分含量及其抗氧化性的比較研究很少有報道。

    本文以橘皮、橘肉、橘絡(luò)作為研究對象,分別對其總酚、總黃酮和多糖含量及體外抗氧化性能進(jìn)行檢測和比較分析,旨在為橘皮、橘肉、橘絡(luò)的深加工提供充足的參考依據(jù),為橘子各部位相關(guān)產(chǎn)品在抗氧化功效方面的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    橘子:市售,臨海涌泉蜜橘,新鮮優(yōu)質(zhì)且無壞果。

    沒食子酸、蘆丁、葡萄糖(均為色譜純):美國Sigma公司;福林酚、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(均為色譜純):上海源葉生物科技有限公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris)、七水硫酸亞鐵(均為分析純):上海生工生物工程股份有限公司;無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水碳酸鈉、正丁醇、乙醚、氯仿、抗壞血酸、水楊酸、濃鹽酸、過氧化氫、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉(均為分析純):國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    臺式離心機(jī)(D-37520型):德國賽默飛世爾科技公司;紫外可見分光光度計(jì)(UV-5200型):上海元析儀器有限公司;高速萬能粉碎機(jī)(FW-200型)、電熱恒溫水浴鍋(HH-2A型):北京科偉永興儀器有限公司;電子分析天平(FA1004型):上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;酸度計(jì)(PHS-3C型):上海佑科儀器儀表有限公司;真空冷凍干燥箱(Pilot5-8M型):北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 材料預(yù)處理及樣品溶液制備

    將橘子去灰洗凈,分離出橘皮、橘肉、橘絡(luò),分別切碎后擺在凍干盤內(nèi)真空冷凍干燥,粉碎后過篩(60目)備用。稱取2 g凍干粉末樣品,加入70%的乙醇溶液,使料液比達(dá)到 1∶10(g/mL),60℃下,以 250 r/min振蕩2 h后,7 000 r/min離心10 min,緩慢吸取上清液,剩余殘?jiān)谕葪l件下再提一次,兩次上清液合并且定容備用,所有試驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.3.2 測定橘子不同部位的總酚含量

    1.3.2.1 繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

    沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1,得到具有良好線性關(guān)系的回歸方程:Y=106.25X+0.0243,回歸系數(shù)R2=0.9909(X為沒食子酸標(biāo)液濃度,mg/mL;Y為吸光度)[22]。

    圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of gallic acid

    1.3.2.2 測定總酚含量

    取25 mL容量瓶,加入樣品溶液1 mL、Na2CO3溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%)2 mL、福林酚1 mL,定容至刻度,避光反應(yīng)2 h,測765 nm處吸光度,根據(jù)公式(1)計(jì)算橘皮、橘肉、橘絡(luò)的總酚含量。

    式中:P為樣品總酚含量,mg/g;C為經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的反應(yīng)液總酚濃度,mg/mL;V為反應(yīng)液體積,mL;N為稀釋倍數(shù);M為樣品干重,g。

    1.3.3 測定橘子不同部位的總黃酮含量

    1.3.3.1 繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

    蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2,得到線性關(guān)系良好的回歸方程:Y=10.602X+0.015 9,回歸系數(shù) R2=0.994 9(X 為蘆丁標(biāo)液濃度,mg/mL;Y 為吸光度)[9]。

    圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of rutin

    1.3.3.2 測定總黃酮含量

    取10 mL容量瓶,加入樣品液2.0 mL、70%的乙醇3 mL、質(zhì)量濃度5%的NaNO2溶液0.3 mL,混勻,靜置6 min后,取質(zhì)量濃度10%的Al(NO3)3溶液0.3 mL加入其中,混勻,再靜置6 min;取4%的NaOH溶液(質(zhì)量濃度)4 mL加入其中,最后用70%的乙醇定容到10 mL,混勻,12 min靜置結(jié)束后立即測510 nm處吸光度,根據(jù)公式(2)計(jì)算橘皮、橘肉、橘絡(luò)的總黃酮含量。

    式中:P為樣品總黃酮含量,mg/g;C為經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的反應(yīng)液總黃酮濃度,mg/mL;V為反應(yīng)液體積,mL;N為稀釋倍數(shù);M為樣品干重,g。

    1.3.4 測定橘子不同部位的多糖含量

    1.3.4.1 繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

    參照文獻(xiàn)[22],繪制苯酚-硫酸法測樣品多糖含量所用的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖3所示。得到線性關(guān)系良好的回歸方程:Y=73.103X+0.032 1,回歸系數(shù)R2=0.994(X為葡萄糖濃度,mg/mL;Y為吸光度)。

    圖3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curve of glucose

    1.3.4.2 測定多糖含量

    準(zhǔn)確稱取樣品凍干粉末300 mg于10 mL離心管,加蒸餾水定容至10 mL,混勻后水浴(85℃)并振蕩2 h,8 000 r/min離心10 min,轉(zhuǎn)移上清液至另一潔凈離心管,加 10 mL 的 Sevage試劑[正丁醇:氯仿=1∶4(體積比)],振蕩 5 min,8 000 r/min 離心 10 min,將水相轉(zhuǎn)移到3倍體積80%的乙醇中,搖勻,靜置2 h后離心15 min(5 000 r/min),所得沉淀干燥即為粗多糖,其用蒸餾水溶解定容到25 mL,吸取1 mL定容液,按參考文獻(xiàn)[23]測吸光度,根據(jù)公式(3)計(jì)算橘皮、橘肉、橘絡(luò)的多糖含量(以葡萄糖計(jì))。

    式中:P為樣品多糖含量,mg/g;C為經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的反應(yīng)液多糖濃度,mg/mL;V為反應(yīng)液體積,mL;N為稀釋倍數(shù);M為樣品干重,g。

    1.3.5 測定DPPH自由基(DPPH·)清除率

    取3支潔凈試管,分別準(zhǔn)確吸取0.5 mL樣品溶液(樣品組)、抗壞血酸溶液(陽性對照組)和蒸餾水(空白組),然后分別加入0.004%的DPPH溶液2.5 mL,輕輕混勻后于37℃避光反應(yīng)30 min,冷卻至室溫(25℃),測515 nm處吸光度,根據(jù)公式(4)計(jì)算橘子不同部位的DPPH·清除率。

    式中:Ai為樣品吸光度;Aj為陽性對照吸光度;A0為空白對照吸光度。

    1.3.6 測定超氧陰離子自由基(O2-·)清除率

    3支空試管中分別移取0.5 mL樣品溶液(樣品組)、抗壞血酸溶液(陽性對照組)和蒸餾水(空白組),再分別加入4.0 mL的Tris-HCl緩沖液(0.2 mol/L,pH 8.2),混勻,靜置4 min,加入2滴8 mol/L鹽酸立即終止反應(yīng),測420 nm處吸光度,根據(jù)公式(4)計(jì)算樣品的O2-·清除率。

    1.3.7 測定羥基自由基(·OH)清除率

    取3支空試管,分別準(zhǔn)確移取0.5 mL的樣品溶液(樣品組)、抗壞血酸溶液(陽性對照組)和蒸餾水(空白組),再分別加入2 mmol/L的水楊酸0.4 mL、6 mmol/L的 H2O2溶液 1 mL、0.15 mmol/L的 FeSO4溶液 1 mL及蒸餾水0.4 mL,混勻,37℃下水浴1 h,冷卻至室溫(25℃)后于510 nm處測吸光度,根據(jù)公式(4)計(jì)算樣品的·OH清除率。

    1.3.8 測定過氧化氫(H2O2)清除率

    向3支空試管中各吸取3.4 mL樣品溶液(樣品組)、抗壞血酸溶液(陽性對照組)和蒸餾水(空白組),再分別加入40 mmol/L的H2O2溶液(用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液配制)0.6 mL,混勻,測230 nm處吸光度,根據(jù)公式(4)計(jì)算樣品H2O2清除率。

    1.4 統(tǒng)計(jì)分析

    試驗(yàn)均重復(fù)3次,數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0進(jìn)行相關(guān)性、顯著性分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 橘子不同部位的活性成分含量

    分別對橘皮、橘肉、橘絡(luò)中的總酚、總黃酮和多糖含量進(jìn)行了測定,結(jié)果見表1。

    表1 橘子不同部位中活性成分含量Table 1 The contents of active components in different parts of tangerine

    如表1所示,橘子不同部位各活性成分含量均存在顯著差異(P<0.05)。橘皮、橘肉、橘絡(luò)中總酚含量最高的是橘肉,為(10.51±0.36)mg/g,其次是橘皮,橘絡(luò)總酚含量最低,為(6.38±0.27)mg/g。橘子不同部位的總黃酮含量也有顯著差異,在(1.54±0.05)mg/g~(6.13±0.23)mg/g的范圍內(nèi),其總黃酮含量最高是橘皮,為(6.13±0.23)mg/g,其次是橘肉,橘絡(luò)總黃酮含量最低。從表1可以看出,橘子不同部位的總黃酮含量都低于其總酚含量,這可能是由于大多數(shù)的黃酮類化合物都屬于多酚類物質(zhì)。橘皮、橘肉、橘絡(luò)中的多糖含量在(18.05±0.24)mg/g~(36.40±0.11)mg/g 的范圍內(nèi),其中橘皮多糖含量最高,為(36.40±0.11)mg/g,其次是橘肉,橘絡(luò)多糖含量最低。橘子不同部位的多糖含量都高于其總酚和總黃酮含量,橘皮和橘肉的總酚、總黃酮和多糖含量都高于橘絡(luò)。

    2.2 橘子不同部位抗氧化能力比較

    各種抗氧化成分具有不同的抗氧化機(jī)理[24-25],且橘子各部位的活性成分及含量也具有差異,所以需要綜合不同的檢測方法分析其抗氧化能力,本研究通過對 DPPH·、O2-·、·OH 和 H2O2的清除率來分析橘子不同部位的抗氧化能力,具體結(jié)果見表2。

    表2 橘子不同部位的自由基清除率Table 2 Free radical scavenging rate of different parts in tangerine

    由表2可知,橘子不同部位對4種自由基的清除率均存在明顯差異,這可能是由于橘子不同部位所含的抗氧化活性成分及含量不同。

    DPPH·是一種穩(wěn)定性較好的自由基,被廣泛用于天然活性物質(zhì)的抗氧化能力研究[26],由表2可見,橘皮、橘肉、橘絡(luò)的DPPH·清除率存在顯著差異(P<0.05),其中橘皮DPPH·清除率最高,為(82.99±0.91)%,其次是橘肉和橘絡(luò),DPPH·清除率分別為(76.60±0.73)%和(56.90±1.26)%。

    O2-·是一種性質(zhì)活潑的自由基,可致衰老、機(jī)體脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞損傷,并誘發(fā)多種皮膚病、心血管疾病和癌癥等[25],從表2可以看出,橘皮、橘肉、橘絡(luò)的O2-·清除率也有顯著差異(P<0.05),但相比其它3種自由基的清除率來說相對較低,其中O2-·清除率最高是橘肉,為(58.27±0.98)%,其次是橘皮和橘絡(luò),O2-·清除率分別為(49.83±0.82)%和(36.34±0.47)%。

    ·OH是一種氧化性極強(qiáng)的自由基,具有強(qiáng)大的得電子能力,使其對生物體有強(qiáng)毒害,常導(dǎo)致人體產(chǎn)生各種復(fù)雜疾病[25]。如表2所示,橘子不同部位·OH清除率具有一定差異,其中清除率最高的為橘肉,高達(dá)(89.83±0.96)%,其次是橘皮和橘絡(luò),二者之間的·OH清除率差異不顯著(P>0.05),分別為(70.00±1.62)%和(69.58±1.12)%。

    H2O2也是造成人體疾病和衰老的重要原因之一,雖然從結(jié)構(gòu)看并不同于一般自由基,但其對人體的傷害與自由基類似,主要損害人體內(nèi)生物大分子[25]。由表2可以看出,橘皮、橘肉、橘絡(luò)的H2O2清除率差異顯著(P<0.05),其中橘皮的H2O2清除率最高,為(69.61±0.75)%,其次是橘肉,H2O2清除率為(63.27±0.45)%,清除率最低的是橘絡(luò),為(46.72±0.61)%。

    2.3 橘子不同部位活性成分含量與抗氧化能力之間的相關(guān)性

    通過SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對橘子不同部位活性成分含量及其 DPPH·、O2-·、·OH 和 H2O2清除率之間進(jìn)行相關(guān)性分析,所得各變量間的Pearson相關(guān)系數(shù)以及顯著性(雙側(cè))檢驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

    表3 橘子不同部位活性成分含量與其抗氧化活性之間的相關(guān)性Table 3 The coefficients among the contents of active components and antioxidant capacity of different parts in tangerine

    從表3可以看出,橘子不同部位的總酚、總黃酮和多糖含量之間都呈現(xiàn)正相關(guān),其中多糖含量和總酚、總黃酮含量間的相關(guān)性都較高(相關(guān)系數(shù)分別為0.698和 0.933);橘子各部位總酚含量與 DPPH·、O2-·、·OH和H2O24種自由基清除率都呈正相關(guān),其中與O2-·清除率相關(guān)性顯著(P<0.05,相關(guān)系數(shù)為0.999);總黃酮含量與DPPH·、O2-·和H2O23種自由基清除率呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)分別為0.883、0.438和0.899);橘子不同部位多糖含量與4種自由基清除率之間也都呈正相關(guān),其中與DPPH·和H2O2清除率相關(guān)性較高(相關(guān)系數(shù)分別為0.993和0.996);橘子4種自由基清除率之間都呈正相關(guān),其中DPPH·和H2O2清除率相關(guān)性顯著(P<0.05,相關(guān)系數(shù)為 0.999)。

    3 結(jié)論

    橘子不同部位的總酚、總黃酮和多糖含量均存在顯著差異(P<0.05),其中總酚含量以橘肉為最高,為(10.51±0.36)mg/g,橘皮中總黃酮和多糖含量均最高,分別為(6.13±0.23)mg/g 和(36.40±0.11)mg/g,橘子各部位的多糖含量都高于其總酚含量,其總酚含量都高于其總黃酮含量,橘皮和橘肉的總酚、總黃酮和多糖含量都高于橘絡(luò)。

    橘子不同部位清除各種自由基的能力都比較強(qiáng),但也存在明顯差異,其中橘皮對DPPH·和H2O2清除率最高,分別為(82.99±0.91)%和(69.61±0.75)%,橘肉對O2-·和·OH清除率最高,分別為(58.27±0.98)%和(89.83±0.96)%。橘皮和橘肉對4種自由基清除率都高于橘絡(luò)。

    相關(guān)性分析表明橘子不同部位的總酚含量、總黃酮含量及多糖含量之間都呈正相關(guān),且橘子總酚含量、多糖含量與4種自由基清除率之間也都呈正相關(guān),其O2-·清除率與總酚含量間呈顯著正相關(guān)(P<0.05,相關(guān)系數(shù)為0.999),總黃酮含量與DPPH·、O2-·和H2O2這3種自由基清除率之間也呈正相關(guān)。

    總之,橘皮、橘肉和橘絡(luò)中都含有豐富的多酚、黃酮和多糖類物質(zhì),且具有比較強(qiáng)的抗氧化能力,該研究可為橘子不同部位的深加工及天然抗氧化產(chǎn)品的開發(fā)提供理論參考。

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