miR-601在胃癌中的表達(dá)及其對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡、侵襲的影響

王石健 陳旭麗

胃癌是全球第5大常見的惡性腫瘤，也是第3大癌癥死亡原因，每年約有723 000例胃癌患者死亡[1]，且大多數(shù)患者首次發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于晚期。盡管晚期胃癌可通過手術(shù)和（或）化學(xué)療法治療，但患者總體5年生存率仍不到24%[2-3]。胃癌的特征是致癌基因發(fā)生了多種遺傳和表觀遺傳學(xué)改變，這些改變擾亂了關(guān)鍵基因的表達(dá)[4-5]。然而，胃癌發(fā)生、發(fā)展的確切分子機(jī)制尚未完全闡明，因此發(fā)現(xiàn)潛在胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子生物標(biāo)志物具有重要的意義。miRNA是一類內(nèi)源性小分子非編碼RNA分子，可通過與mRNA的3′-非翻譯區(qū)結(jié)合從而在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)[6]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-601與前列腺癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、肝癌、胰腺癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[7-10]。目前，miR-601在胃癌中的研究不多，miR-601如何介導(dǎo)胃癌的發(fā)生、發(fā)展需要進(jìn)一步研究[11]。本文將探討miR-601在胃癌中的表達(dá)及其對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡、侵襲的影響。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2018年8月至2019年8月臺(tái)州市立醫(yī)院收治的經(jīng)病理學(xué)檢查確診為胃癌的30例患者的癌組織及相應(yīng)癌旁（距離腫瘤≥2 cm）正常組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者術(shù)前未進(jìn)行放、化療等手段治療；（2）患者未患有其他重大疾病。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者及家屬均知情同意。

1.2 材料和試劑 人胃癌細(xì)胞株AGS、HGC-27、MGC-803和正常胃細(xì)胞株GES-1均購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司（批號(hào)：A4192301）；噻唑藍(lán)（MTT）粉末購(gòu)自上海碧云天有限公司（批號(hào)：ST1537）；引物由上海生工生物工程公司合成；RNA提取試劑TRIzol、real-time PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及Lipofectamine 3000均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司（批號(hào)：15596018、A28138、12594100 及 L3000001）；miR-601抑制物（miR-601 inhibitor）和陰性對(duì)照序列（inhibitor NC）均由上海吉瑪基因公司設(shè)計(jì)合成；AnnexinV-APC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司（批號(hào)：SY0478）；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司（批號(hào)：354480）；基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、GADPH抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司（批號(hào)：ab92536、ab76003及 ab9485）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人胃癌細(xì)胞株AGS、HGC-27、MGC-80、正常胃細(xì)胞株GES-1用含10%FBS和1%鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 將AGS細(xì)胞按照3×105個(gè)細(xì)胞/孔接種在6孔板中培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，當(dāng)細(xì)胞融合為一層時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000將miR-601 inhibitor和inhibitor NC轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞，并分為miR-601 inhibitor組和inhibitor NC組。具體操作嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染48 h后收集總RNA，進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.3.3 miR-601相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 采用qRT-PCR法。采用TRIzol提取總RNA，以RNA為模板，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成，按照real-time PCR試劑盒的說明書進(jìn)行反應(yīng)，擴(kuò)增miR-601。定量PCR條件：95℃，10 min（1 個(gè)循環(huán)），95 ℃、15 s，60 ℃、60 s（40 個(gè)循環(huán)），95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s。引物序列：miR-601-F：5′-CACTAGATTGTGAGCTCCTGGA-3′，miR-601-R 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；GAPDH-F：5′-TCAA －GAAGGTGGTGAAGCAGG-3′，GAPDH-R：5′-TCAAAG GTGGAGGAGTGGGT-3′。U6為內(nèi)參照，以miR-60與U6拷貝數(shù)的比值為 miR-601相對(duì)表達(dá)量，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

1.3.4 細(xì)胞抑制率檢測(cè) 采用MTT法。將轉(zhuǎn)染后的AGS細(xì)胞按照2×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板中，分別在24、48和72 h時(shí)每孔加入MTT溶液，再培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)上清液，加入150 μl DMSO，室溫振蕩5 min溶解甲臜結(jié)晶，在波長(zhǎng)490 nm處用酶標(biāo)儀檢測(cè)相應(yīng)的吸光度值（OD值），計(jì)算細(xì)胞抑制率，細(xì)胞抑制率=1－miR-601 inhibitor組OD值/inhibitor NC組OD值×100%。

1.3.5 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。將轉(zhuǎn)染后的AGS細(xì)胞按照3×105個(gè)/孔接種在6孔板中培養(yǎng)，收集細(xì)胞上清液，PBS清洗后加入不含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞，于4℃下1 100 r/min離心5 min，重懸細(xì)胞后加入流式管。流式管避光加入5 μl AnnexinV-APC染色10 min，再加入5 μl 7-AAD染色5 min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行收集檢測(cè)。

1.3.6 細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。將轉(zhuǎn)染后的AGS細(xì)胞按照3×105個(gè)細(xì)胞/孔接種在6孔板中培養(yǎng)，并繼續(xù)培養(yǎng)孵育至生長(zhǎng)為80%左右，用200 μl無菌移液器槍頭每孔垂直劃3條平行線；棄培養(yǎng)基，PBS洗滌，加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，拍照時(shí)用PBS緩沖液代替培養(yǎng)基，隨機(jī)取10個(gè)視野，在0 h和24 h通過倒置顯微鏡拍攝，計(jì)算細(xì)胞遷移率，細(xì)胞遷移率=（0 h劃痕寬度－培養(yǎng)后劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.3.7 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)。將事先液化的Matrigel用無血清RPMI1640培養(yǎng)基1∶6比例稀釋，取100 μl轉(zhuǎn)染后的AGS細(xì)胞加入上層Transwell小室，37℃使其固化，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出小室后用棉簽拭去上層小室未遷移的細(xì)胞，甲醇固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，隨機(jī)取10個(gè)視野，通過倒置顯微鏡拍攝，計(jì)算細(xì)胞侵襲數(shù)。

1.3.8 MMP-2、MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 采用Western blot法。將轉(zhuǎn)染后的AGS細(xì)胞按照3×105個(gè)/孔接種在6孔板中培養(yǎng)，加入細(xì)胞裂解液裂解，離心收集細(xì)胞裂解液。制備分離膠和濃縮膠，蛋白上樣電泳，再轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉，加入一抗再孵育24 h，然后加入二抗再室溫孵育2 h，顯影曝光。使用軟件分析蛋白條帶，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 不同組織或細(xì)胞中miR-601相對(duì)表達(dá)量比較 與癌旁正常組織比較，胃癌組織中miR-601相對(duì)表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與GES-1比較，其余3株胃癌細(xì)胞miR-601相對(duì)表達(dá)量均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與inhibitor NC組比較，miR-601 inhibitor組miR-601相對(duì)表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1～3。

表1 胃癌組織和癌旁正常組織中miR-601相對(duì)表達(dá)量比較

表2 不同細(xì)胞株中miR-601相對(duì)表達(dá)量比較

表3 兩組細(xì)胞中miR-601相對(duì)表達(dá)量比較

2.2 兩組細(xì)胞抑制率比較 結(jié)果顯示與inhibitor NC組相比，轉(zhuǎn)染 miR-601 inhibitor后 24、48、72 h時(shí) miR-601 inhibitor組細(xì)胞抑制率均較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05），見圖 1。

圖1 兩組細(xì)胞抑制率比較（與inhibitor NC組比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

2.3兩組細(xì)胞凋亡率比較 與inhibitor NC組比較，miR-601 inhibitor組的細(xì)胞凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖 2、表 4。

圖2 兩組細(xì)胞凋亡率的流式細(xì)胞圖

表4 兩組細(xì)胞凋亡率比較（%）

2.4 兩組細(xì)胞細(xì)胞遷移率和細(xì)胞侵襲數(shù)比較 與inhibitor NC組比較，miR-601 inhibitor組的細(xì)胞遷移率明顯升高，而細(xì)胞侵襲數(shù)明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05），見圖 3、表5和圖4（插頁(yè)）、表6。

表5 兩組細(xì)胞遷移率比較（%）

表6 兩組細(xì)胞侵襲數(shù)比較（個(gè)）

圖3 兩組細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)圖

圖4 兩組細(xì)胞侵襲數(shù)比較（結(jié)晶紫染色，×200）

2.5 兩組細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量比較與inhibitor NC組比較，miR-601 inhibitor組MMP-2和MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖 5和表7。

表7 兩組細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

圖5 兩組細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)電泳圖（MMP為基質(zhì)金屬蛋白酶）

3 討論

胃癌是人類消化系統(tǒng)的常見惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率逐年上升[1]。鑒定具有高靈敏度和特異度的腫瘤標(biāo)志物對(duì)于早期胃癌的臨床篩查非常重要。越來越多的研究證明，抑癌基因或癌基因異常表達(dá)都會(huì)介導(dǎo)胃癌的發(fā)生和發(fā)展[7]。因此，探索有潛力的抑癌基因?qū)τ谖赴┭芯窟M(jìn)展具有重要的臨床意義。

近年來，已在胃癌的腫瘤樣本中廣泛檢測(cè)到miRNA的異常表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)這些miRNA在胃癌進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用。Qiu等[12]的研究結(jié)果表明miR-671-5p在胃癌中處于低表達(dá)水平，但miR-671-5p過表達(dá)后能夠通過靶向細(xì)胞增殖上調(diào)因子抑制胃癌細(xì)胞增殖。還有研究發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中miR-376a呈低表達(dá)，且miR-376a與胃癌患者的生存密切相關(guān)[13]。因此，探討miRNA的臨床和功能作用仍具有重要意義，可為胃癌提供有效的治療方法。

miR-601是miRNA家族的重要成員，已在多種人類癌癥中檢測(cè)到miR-601的異常表達(dá)。但是miR-601作為癌基因或抑癌基因的作用隨癌癥類型而不同。例如，研究發(fā)現(xiàn)miR-601在在肝癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)顯著下調(diào)，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明miR-601可能通過直接靶向結(jié)合磷脂酰肌醇3激酶調(diào)節(jié)亞基3和調(diào)節(jié)蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路來抑制肝癌的進(jìn)展[9]。Cao等[10]也證明了miR-601在胰腺癌組織中表達(dá)明顯下調(diào)，且發(fā)現(xiàn)miR-601可能抑制Sirtuin1的表達(dá)參與胰腺癌的進(jìn)展。但Scheffer等[14]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-601在膀胱癌組織中的表達(dá)水平上調(diào)。最新的研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA人類同源盒基因轉(zhuǎn)錄反義間RNA可通過介導(dǎo)miR-601靶向鋅指轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)乳腺癌的發(fā)展[15]。但miR-601是如何介導(dǎo)胃癌的發(fā)展目前尚不明確。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-601在胃癌組織中表達(dá)升高，且進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)相對(duì)于正常胃細(xì)胞GES-1，miR-601在胃癌細(xì)胞株AGS、HGC-27、MGC-803表達(dá)升高，這與Min等[11]的結(jié)果相一致。以上組織學(xué)及細(xì)胞學(xué)水平的檢測(cè)結(jié)果均證實(shí)，miR-601在胃癌中表達(dá)升高，初步提示miR-601可能是胃癌的的促癌基因，抑制miR-601的表達(dá)可以抑制胃癌的發(fā)生、發(fā)展。

本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)AGS細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-601 inhibitor后，AGS細(xì)胞中的miR-601的表達(dá)降低；同時(shí)發(fā)現(xiàn)抑制miR-601的表達(dá)后，AGS細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制，說明miR-601參與了胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。目前，有大量研究發(fā)現(xiàn)miRNAs與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的密切相關(guān)。例如，miR-519d可通過靶向結(jié)合人表皮生長(zhǎng)因子受體3抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[16]。miR-216B在人類皮膚鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)降低，但miR-216B表達(dá)上調(diào)后能夠通過下調(diào)Xklp2靶蛋白表達(dá)從而抑制皮膚鱗狀癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[17]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-601也可介導(dǎo)胃癌的侵襲和遷移。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)AGS細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-601 inhibitor后，AGS細(xì)胞的遷移能力明顯降低；同時(shí)，Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-601后，胃癌細(xì)胞AGS侵襲能力也明顯下降。MMP-2和MMP-9是MMPs的成員，它們與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移關(guān)系最為緊密[18]，進(jìn)一步行Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，下調(diào)miR-601表達(dá)后，MMP-2和MMP-9的表達(dá)降低，說明了miR-601可通過降低MMP-2和MMP-9的表達(dá)介導(dǎo)胃癌的侵襲和遷移。

綜上所述，本研究初步發(fā)現(xiàn)miR-601在胃癌組織和細(xì)胞中表達(dá)升高，且抑制miR-601表達(dá)后能夠抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和遷移，但miR-601上下游的靶基因和細(xì)胞通路仍然不清楚，需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步研究。