芹菜素調(diào)控PTCH1/GLI1/Bcl-2軸對胰腺癌細胞增殖、凋亡的影響

潘巖 劉魯明 花永強

胰腺癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，因其隱匿起病、高度惡性，且缺乏明顯的臨床表現(xiàn)，85%的患者在發(fā)病確診時已屬于癌癥終末期，5年生存率低于7%[1]。Sonic Hedgehog信號通路在胰腺腫瘤的形成發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移、腫瘤多藥耐藥等過程中發(fā)揮重大作用[2]，靶向調(diào)控GLI1轉(zhuǎn)錄因子可改善患者臨床預后[3]。芹菜素作為一種天然黃酮物質(zhì)，普遍存在于食用蔬菜和水果中，研究證明其可通過調(diào)控腫瘤相關基因、誘導細胞凋亡、調(diào)節(jié)信號通路傳導、阻斷腫瘤血管形成、放化療增敏及化學預防等多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[4-5]。有研究報道芹菜素對胰腺癌有明顯的抑制作用[5-7]，但其作用機制尚不明確。本研究以PTCH1/GLI1/Bcl-2軸為切入點，探索芹菜素對胰腺癌細胞增殖和細胞凋亡的影響及其潛在作用機制。

1 材料和方法

1.1 細胞株 人胰腺癌BxPC-3細胞、SW1990細胞均為復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科劉魯明教授惠贈。

1.2 主要試劑與儀器 RPMI1640購自美國Hyclon公司；FBS試劑購自美國Gibco公司；青、鏈霉素雙抗購自德國Sigma公司；體外增殖檢測試劑盒（CCK-8）購自日本本同仁化學研究所；細胞凋亡檢測AnnexinV/PI試劑盒購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒均購自加拿大Fermentas公司；PTCH1、GLI1、Bcl-2和GAPDH引物均由上海生物工程技術有限公司合成；兔抗人PTCH1、GLI1、actin均購自美國 Cell Signalling Technology公司；山羊抗兔二抗購自美國Santa Cruz公司；BD FACalibur System流式細胞分析儀均購自美國BD公司；基因擴增儀購自德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 將人胰腺癌BxPC-3細胞、SW1990細胞接種于含10%FBS、1%青、鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中[8]，在37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，當細胞融合達75%左右時，1∶3傳代。

1.3.2 細胞活力檢測 采用CCK-8法。將制成單細胞懸液的胰腺癌BxPC-3、SW1990細胞以 1×103個/孔接種于96孔板（100 μl/孔）。將芹菜素用0.1%DMSO溶解，并制備成濃度梯度的芹菜素溶液（2、5、10、20、40、60、80 μmol/L）。上述細胞培養(yǎng)24 h后加入0.1%DMSO及濃度梯度的芹菜素進行干預24、48和72 h。檢測細胞活力時每孔加入CCK-8溶液10 μl，培養(yǎng)1 h后用酶標儀在450 nm波長下測定光密度值，計算細胞活力。使用graphpad prism軟件計算BxPC-3、SW1990細胞經(jīng)芹菜素干預48 h后的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.3.3 細胞凋亡率檢測 采用流式細胞術。按照細胞凋亡檢測試劑盒說明書，通過胰蛋白酶消化獲取的胰腺癌BxPC-3、SW1990 細胞，用 PBS 洗滌，加入 195 μl Annexin V-FITC結(jié)合液，常溫避光處理10 min后加入10 μl PI染色液，冰浴避光放置，隨即用流式細胞儀進行檢測。

1.3.4 細胞克隆形成率檢測 采用平板克隆實驗。將制成單細胞懸液的胰腺癌BxPC-3、SW1990細胞以5×102個/孔接種于6孔板（1 ml/孔），待細胞貼壁生長后分別加入 0.1%DMSO、10、20、50 μmol/L 的芹菜素干預 14 d。鏡下觀察5個視野，計數(shù)克隆形成數(shù)目并拍照，取平均值，計算克隆形成率?？寺⌒纬陕剩?）=（克隆數(shù)/接種細胞數(shù)）×100%。

1.3.5 PTCH1、GLI1、Bcl-2 mRNA相對表達量檢測 采用RT-PCR法。BxPC-3、SW1990細胞經(jīng)0.1%DMSO、10、20、50 μmol/L 芹菜素干預 48 h。參考前期研究[9]提取細胞總RNA，采用RT-PCR試劑盒檢測PTCH1、GLI1、Bcl-2 mRNA相對表達量。根據(jù)SYBR Green PCR Master Mix試劑盒說明反應體系20 μl，反應條件：94℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30個循環(huán)。PTCH1引物：上游：5′-CGGCGTTCTCAATGGGCTGGTTTT-3′，下游：5′-GTGGGGCTGCTGTTTCGGGTTCG-3′；GLI1 引物：上游：5′-AGGGAGTGCAGCCAATACAG-3′，下游：5′-ATTGGCCGGAGTTGATGTAG-3′；Bcl-2 引物：上游：5′-GAACTGGGGGAGGATTGTGG-3′，下游：5′-CCGG TTCAGGTACTCAGTCA-3′；GAPDH 引物：上游：5′-CA AGG TCATCCATGACAACTTTG-3′，下游：5′-GTCCACCA CCCTGTTGCTGTAG-3′。最終mRNA的相對表達量使用2-ΔΔCt法定量。

1.3.6 PTCH1、GLI1蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。參考前期研究描述的方法，用RIPA裂解液裂解細胞，進行蛋白提取，BCA法檢測蛋白濃度[9]。取等量蛋白，進行SDS-PAGE凝膠電泳分離樣品；將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉，與一抗4℃孵育過夜。緩沖液洗膜（15 min×3次）后將膜與二抗室溫孵育2 h，化學發(fā)光法檢測蛋白表達豐度。采用Bio-Rad Image Lab 5.2.1軟件進行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 8組BxPC-3、SW1990細胞活力比較 與 0.1%DMSO 組比較，2、5、10、20、40、60、80 μmol/L 芹菜素組24、48、72 h時的IC50均明顯降低，且呈劑量及時間依賴性，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），見圖1。

圖1 8組BxPC-3、SW1990細胞活力比較（a：BxPC-3細胞；b：SW1990細胞）

2.2 4組BxPC-3、SW1990細胞凋亡率比較 與0.1%DMSO 組比較，10、20、50 μmol/L 芹菜素組 BxPC-3、SW1990細胞凋亡率均明顯升高，且呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），見表1、圖2。

圖2 4組 BxPC-3、SW1990細胞凋亡率的流式細胞圖（a：BxPC-3細胞；b：SW1990細胞）

表1 4組BxPC-3、SW1990細胞凋亡率比較（%）

2.3 4組BxPC-3、SW1990細胞克隆形成率比較 與0.1%DMSO 組比較，10、20、50 μmol/L 芹菜素組 BxPC-3、SW1990細胞克隆形成率均明顯下降，且呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），見表2、圖3（插頁）。

圖3 4組BxPC-3、SW1990細胞克隆形成率比較（a：BxPC-3細胞；b：SW1990細胞）

表2 4組BxPC-3、SW1990細胞克隆形成率比較（%）

2.4 4 組 BxPC-3、SW1990 細胞 PTCH1、GLI1、Bcl-2 mRNA相對表達量比較 與0.1%DMSO組比較，10、20、50 μmol/L 芹菜素組 BxPC-3、SW1990 細胞 PTCH1、GLI1、Bcl-2 mRNA相對表達量均明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義（均 P＜0.01），見表 3～5。

表3 4組BxPC-3、SW1990細胞PTCH1 mRNA相對表達量比較

表4 4組BxPC-3、SW1990細胞GLI1 mRNA相對表達量比較

表5 4組BxPC-3、SW1990細胞Bcl-2 mRNA相對表達量比較

2.5 4組BxPC-3、SW1990細胞PTCH1、GLI1蛋白表達水平比較 與0.1%DMSO組比較，10、20、50 μmol/L芹菜素組BxPC-3、SW1990細胞 PTCH1、GLI1蛋白表達水平均明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），見表 6～7、圖 4。

圖4 4組 BxPC-3、SW1990細胞PTCH1、GLI1蛋白表達的電泳圖（a：BxPC-3細胞；b：SW1990細胞）

表6 4組BxPC-3、SW1990細胞PTCH1蛋白表達水平比較

表7 4組BxPC-3、SW1990細胞GLI1蛋白表達水平比較

3 討論

芹菜素是一種常見的黃酮類化合物，廣泛存在于多種水果、蔬菜、豆類和茶葉中，在眾多實體腫瘤中發(fā)揮抗腫瘤作用[5]，這一作用主要通過抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡和自噬來實現(xiàn)[10]。在前列腺癌中，Shukla等[11]發(fā)現(xiàn)芹菜素可以通過下調(diào)NF-κB激酶抑制劑和NF-κB信號通路來抑制腫瘤細胞增殖和誘導細胞凋亡。膽管癌HcCCA-1細胞經(jīng)芹菜素干預24、48、72 h后，細胞生長受抑，細胞凋亡率顯著增加，且這種作用呈劑量和時間相關性[12]。本文探索了芹菜素對胰腺癌細胞增殖、凋亡的影響，結(jié)果提示不同濃度芹菜素對胰腺癌細胞系BxPC-3和SW1990的細胞增殖有不同程度的抑制作用，對細胞凋亡有不同程度的強化作用，芹菜素干預劑量越大、干預時間越長，作用越明顯。這一結(jié)果與前期報道的芹菜素干預胰腺癌細胞系AsPc-1、Panc-1和MiaPaCa-2的實驗結(jié)果一致[6]。

Sonic Hedgehog信號通路異常活化與胰腺惡性腫瘤形成發(fā)展關系密切。PTCH1、GLI1在胰腺腫瘤組織中的表達顯著高于正常胰腺組織[13]。GLI1轉(zhuǎn)錄因子表達與TNM分期、神經(jīng)浸潤、淋巴管轉(zhuǎn)移有關，與分化程度和腫瘤大小無關。GLI1高表達預示著胰腺癌更差的生存預后[14]。因此，Sonic Hedgehog信號通路，尤其GLI1可能是胰腺癌的潛在治療靶點。本研究采用RT-PCR和Western blot法證實了 20 μmol/L 和 50 μmol/L 濃度的芹菜素可以顯著降低胰腺癌BxPC-3和SW1990細胞中PTCH1、GLI1在基因和蛋白水平的表達，且兩者表達變化一致，變化趨勢與腫瘤細胞增殖受抑正性相關，與細胞凋亡增加呈負相關。Slusarz等[15]在前列腺癌的研究中發(fā)表了相似的研究結(jié)果：芹菜素通過降低Hedgehog信號通路中的轉(zhuǎn)錄因子GLI1相對表達量來抑制前列腺癌細胞在體外和小鼠體內(nèi)的生長。

Bcl-2基因是一種抗凋亡因子，參與細胞凋亡。有研究表明芹菜素可通過減少抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bcl-2相關X蛋白的比值從而誘導腦膠質(zhì)瘤SHG-44細胞凋亡，使更多的腫瘤細胞阻滯在G2/M期[16]。本研究進一步發(fā)現(xiàn)胰腺癌BxPC-3和SW1990細胞經(jīng)10、20、50 μmol/L芹菜素干預后，腫瘤細胞凋亡比例呈劑量依賴性顯著性增加，Bcl-2相對表達量逐漸下降，兩者呈負相關。有趣的是，Bcl-2是GLI1基因的下游靶基因，當GLI1被激活后進入細胞核，誘導下游靶基因Bcl-2、PTHC1等的表達，最終致使胰腺腫瘤細胞增殖受抑、細胞凋亡增加。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，芹菜素對胰腺癌細胞增殖的抑制作用和凋亡的誘導作用與下調(diào)PTCH1/GLI1/Bcl-2軸有關。