環(huán)狀RNA hsa_circ_0000301在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義

李琪兒 邵永富 葉國良

胃癌是人類常見的惡性腫瘤，其全球發(fā)病率居所有惡性腫瘤第5位，而死亡率排名則高居第3位，其中我國因胃癌病死人數(shù)約占全球一半[1-2]。盡管醫(yī)學(xué)治療手段在不斷發(fā)展，但由于大多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期，導(dǎo)致胃癌的預(yù)后仍很差，5年總體生存率僅27%[3-4]。胃癌是一種在組織和分子水平高度異質(zhì)性的疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣[4]。因此，探索胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制、尋找有效的腫瘤標(biāo)志物以及新的治療靶點(diǎn)仍是胃癌診斷和治療的研究熱點(diǎn)。

環(huán)狀RNA是一種普遍存在于真核轉(zhuǎn)錄組中的具有基因調(diào)控作用的非編碼RNA，其具有較高保守性和組織特異性[5]。環(huán)狀RNA與癌癥發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[6]。相較于其他線性RNA，環(huán)狀RNA由于其特殊的共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)而不易被RNA酶所降解，因此具備更高的穩(wěn)定性[5]，使其成為癌癥診斷的潛在新型標(biāo)志物[7]。目前有學(xué)者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些具有潛在診斷價(jià)值的環(huán)狀RNA，如hsa_circ_002059[8]、hsa_circ_0000096[9]和 hsa_circ_0001895[10]等在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，hsa_circ_0058246[11]和hsa_circ_102958[12]等則表達(dá)上調(diào)。Li等[13]通過基因芯片篩選出343個(gè)在胃癌患者血漿中表達(dá)異常的環(huán)狀RNA，其中hsa_circ_0000301是表達(dá)上調(diào)最為明顯的環(huán)狀RNA之一。然而，hsa_circ_0000301在胃癌患者中表達(dá)情況尚不明確。本研究進(jìn)一步探索hsa_circ_0000301在胃癌組織中的表達(dá)情況，并結(jié)合臨床病理因素分析該環(huán)狀RNA的臨床意義。

1 材料和方法

1.1 樣本采集 選取2013年1月至2016年12月于寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除的96例胃癌患者的癌組織及配對(duì)癌旁組織，其中男65例，女31例，年齡27～80（62.3±10.5）歲。根據(jù) hsa_circ_0000301 在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平分為兩組：高表達(dá)組（癌組織表達(dá)水平高于癌旁組織）28例和低表達(dá)組（癌組織表達(dá)水平低于癌旁組織）68例。所有患者術(shù)前均未接受過放化療及靶向治療等全身治療。所有胃癌組織均經(jīng)病理學(xué)檢測(cè)證實(shí)，癌旁組織標(biāo)本均取自于同一患者的手術(shù)切除標(biāo)本，距離腫瘤邊緣超過2 cm，且病理學(xué)檢測(cè)證實(shí)為非癌組織。采集的新鮮組織標(biāo)本立即浸泡于無氮樣品保存液中，并放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩１狙芯拷?jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2013GZ020），所有患者均已簽署知情同意書。

1.2 hsa_circ_0000301表達(dá)水平檢測(cè) 采用RT-qPCR法。采用Trizol（美國Invitrogen公司，批號(hào)：260712，100 ml）試劑提取組織標(biāo)本中總RNA，總RNA濃度采用核酸蛋白分析儀測(cè)定，根據(jù)A260/A280比值以及用1.5%非變性瓊脂糖凝膠電泳條帶完整性鑒定總RNA的質(zhì)量。將提取的總RNA使用GoScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Promega 公司，批號(hào)：0000323588，100 reactions）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，采用GoTaq qPCR Master Mix試劑盒（美國 Promega 公司，批號(hào)：0000372782，25 ml）在Mx3005P熒光定量PCR儀（美國Stratagene公司）上進(jìn)行RT-qPCR。hsa_circ_0000301的引物序列：正向：5′-AGCAGGAAGGTGTGAGCTGG-3′，反向：5′-TGCCTGCTTACAGCCACTCA-3′；外參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的引物序列：正向：5′-ACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3′反向：5′-TGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT-3′。擴(kuò)增條件設(shè)定為：95℃5 min預(yù)變性，95℃ 30 s變性，60℃1 min退火，72℃30 s延伸，循環(huán)45次。每個(gè)樣本進(jìn)行2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)取Ct平均值。環(huán)狀RNA的表達(dá)水平采用ΔCt法計(jì)算，計(jì)算公式為：ΔCt=Ct（hsa_circ_0000301）-Ct（GAPDH）。

1.3 隨訪 96例患者出院后均進(jìn)行隨訪，隨訪方式為電話隨訪和門診隨訪，隨訪內(nèi)容包括一般情況、臨床癥狀、胃鏡檢查及影像學(xué)檢查。隨訪起點(diǎn)為手術(shù)日期，末次隨訪時(shí)間為2019年12月31日，至隨訪截止日，存活66例，病死30例，無失訪患者。

1.4 hsa_circ_0000301功能注釋 基于circbank[14]數(shù)據(jù)庫分析hsa_circ_0000301結(jié)合的miRNA；miRWalk 2.0[15]數(shù)據(jù)庫分析miRNA已知靶向的mRNA；采用Cytoscape 3.8.0構(gòu)建hsa_circ_0000301-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)圖。采用ToppFun[16]數(shù)據(jù)庫對(duì)has_circ_0000301潛在調(diào)控的mRNA進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)通路和基因本體論（GO）富集。

2 結(jié)果

2.1 胃癌和癌旁組織中hsa_circ_0000301表達(dá)水平比較 hsa_circ_0000301在胃癌組織中的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖1。

圖1 胃癌和癌旁組織中hsa_circ_0000301表達(dá)水平比較（**P＜0.01；ΔCt值越大，表達(dá)水平越低）

2.2 不同臨床特征胃癌患者的hsa_circ_0000301表達(dá)水平比較 見表1。進(jìn)一步分析hsa_circ_0000301的表達(dá)水平與胃癌患者不同臨床特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，發(fā)生胃癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)以及癌胚抗原陽性患者h(yuǎn)sa_circ_0000301表達(dá)水平均明顯升高（均P＜0.05）。

表1 不同臨床特征胃癌患者h(yuǎn)sa_circ_0000301表達(dá)水平比較

2.3 不同hsa_circ_0000301表達(dá)水平胃癌患者生存比較 低表達(dá)組患者總生存期（HR=0.285，95%CI：0.107～0.757，P＜0.05）以及無病生存期（HR=0.375，95%CI：0.173～0.812，P＜0.05）均明顯短于高表達(dá)組，見圖 2。

圖2 不同hsa_circ_0000301表達(dá)水平胃癌患者的生存曲線比較（a：總生存期比較；b：無病生存期比較）

2.4 hsa_circ_0000301對(duì)胃癌的診斷價(jià)值 ROC曲線分析結(jié)果顯示hsa_circ_0000301診斷胃癌的AUC為0.672，且當(dāng)截?cái)嘀禐?.57時(shí)，其靈敏度為0.72，特異度為 0.62，見圖 3。

圖3 hsa_circ_0000301診斷胃癌的ROC曲線

2.5 Hsa_circ_0000301潛在功能分析 通過構(gòu)建hsa_circ_0000301-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)顯示，hsa_circ_0000301作為hsa-miR-1178-3p和hsa-miR-362-3p的分子海綿，可分別間接調(diào)控下游211個(gè)和106個(gè)靶基因表達(dá)，見圖4a。對(duì)下游靶基因通路和GO富集進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0000301具有多種生物學(xué)功能，其中包括具有調(diào)控JNK、Wnt等與胃癌發(fā)生密切相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路的潛能，見圖4b-c。

圖4 hsa_circ_0000301潛在功能分析（a：hsa_circ_0000301-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；b：hsa_circ_0000301下游信號(hào)傳導(dǎo)通路；c：hsa_circ_0000301基因本體論富集）

3 討論

我國為胃癌高發(fā)地區(qū)，胃癌的發(fā)病率居惡性腫瘤第2位[17]。目前胃癌的診斷主要依靠胃鏡檢查，而我國是人口大國，醫(yī)療資源有限，胃鏡檢查作為一種有創(chuàng)檢查耗時(shí)、耗力，因此并不是篩查、隨訪的最佳手段，與之相比腫瘤標(biāo)志物檢查則更為方便，但現(xiàn)有的腫瘤標(biāo)志物如糖類抗原（CA）19-9和癌胚抗原（CEA）對(duì)胃癌檢測(cè)的靈敏度和特異度均不理想[18]，因此人們致力于探索新型的分子標(biāo)志物。環(huán)狀RNA作為一種非編碼RNA，因其穩(wěn)定性高且表達(dá)具有組織特異性，而被認(rèn)為是理想的分子標(biāo)志物。研究表明hsa_circ_002059和hsa_circ_0000096等具有胃癌診斷價(jià)值。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0000301在胃癌組織中的表達(dá)較配對(duì)的癌旁組織明顯降低，ROC曲線分析hsa_circ_0000301診斷胃癌的靈敏度和特異度分別為0.72和0.62，而目前傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物CEA和CA199-的靈敏度僅分別為0.30和0.42[19]。因此，hsa_circ_0000301有望成為理想的診斷胃癌的標(biāo)志物。

進(jìn)一步結(jié)合臨床病理因素分析，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0000 301表達(dá)水平越低，越容易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、越容易復(fù)發(fā)、且越容易出現(xiàn)組織CEA陽性，這可能是導(dǎo)致hsa_circ_0000301低表達(dá)組的總生存期以及無病生存期均明顯短于高表達(dá)組的原因。此外，環(huán)狀RNA常作為“miRNA海綿”競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miRNA，進(jìn)而間接調(diào)控下游靶基因表達(dá)[19]。基于該理論，本研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了hsa_circ_0000301-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，分析發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0000301可能通過調(diào)控JNK[20]、Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路[21]等影響胃癌的惡性表型和不良預(yù)后。

而Li等[13]通過基因芯片檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0000301在胃癌患者血漿中的表達(dá)顯著上調(diào)，這與本研究中胃癌組織的結(jié)果相反。本研究團(tuán)隊(duì)推測(cè)hsa_circ_0000301可能通過外泌體等形式大量釋放進(jìn)入血液，從而導(dǎo)致組織中低表達(dá)血漿中高表達(dá)。

本研究證實(shí)了hsa_circ_0000301作為胃癌相關(guān)環(huán)狀RNA，其在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，且其表達(dá)下調(diào)與胃癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。hsa_circ_0000301具有成為胃癌標(biāo)志物的潛力，其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。