基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討通竅活血湯治療顱腦損傷的作用機(jī)制

杜勇 張淑敏 王雷 王文鑫 東瀟博 劉佳霖 蔡旭 陳嘉琪 王革生

摘要 目的：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討通竅活血湯治療顱腦損傷（TBI）的作用機(jī)制。方法：通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）數(shù)據(jù)庫篩選出通竅活血湯潛在活性成分及靶點，采用GeneCard與OMIM數(shù)據(jù)庫獲得顱腦損傷疾病靶點，得到通竅活血湯的中藥與TBI的交集靶點，使用Cytoscape 3.7.2軟件繪制活性成分靶點疾病交互網(wǎng)絡(luò)圖。采用String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）信號通路富集分析。結(jié)果：篩選后收集得所有中藥成分127個，收集疾病靶點1 811個，疾病與藥物交集靶點共62個。PPI網(wǎng)絡(luò)提示核心靶點為ALB、IL6、CASP3、EGFR、VEGFA等;GO功能注釋得到73條富集結(jié)果，包括DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性，RNA聚合酶Ⅱ特異性等，富集得到PI3K-AKT等75條核心的KEGG通路。結(jié)論：通竅活血湯治療顱腦損傷具有多成分、多靶點、多通路的作用機(jī)制特點。

關(guān)鍵詞 通竅活血湯;顱腦損傷;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);靶點;蛋白互作網(wǎng)絡(luò);信號通路;富集分析;作用機(jī)制

Action Mechanism of Tongqiao Huoxue Decoction in the Treatment of Traumatic

Brain Injury Based on Network Pharmacology

DU YONG1，ZHANG Shumin2，WANG Lei1，WANG Wenxin1，DONG Xiaobo1，

LIU Jialin1，CAI Xu1，CHEN Jiaqi3，WANG Gesheng1

（1 Dongfang Hospital Beijing University of Chine Medicine，Beijing 100078，China; 2 Civil Aviation General Hospital，

Beijing 100123，China; 3 Beijing University of Chine Medicine，Beijing 100029，China）

Abstract Objective：To explore the mechanism of Tongqiao Huoxue Decoction in the treatment of craniocerebral injury based on network pharmacology.Methods：The potential active ingredients and targets of Tongqiao Huoxue Decoction were screened by searching the TCMSP database，and the target diseases of brain injury were obtained using GeneCard and OMIM database，and the intersection target of the Chinese medicinal of Tongluo Huoxue Decoction and TBI intersection target were obtained.Cytoscape 3.7.2 software was used to draw the interactive network diagram of the active ingredient target disease.The String database was used to construct the target interaction PPI network，and the GO function enrichment analysis and KEGG signal pathway enrichment analysis were performed.Results：A total of 127 Chinese medicinal components were collected，1811 disease targets were collected，and a total of 62 disease and drug intersection targets were collected.The PPI network suggested that the core targets were ALB，IL6，CASP3，EGFR，VEGFA，etc.; GO function annotations yielded 73 enrichment results，including DNA binding transcription activator activity，RNA polymerase Ⅱ transformation，etc.，enrichment yielded PI3K-AKT，etc.and 75 core KEGG pathways.Conclusion：Tongqiao Huoxue Decoction has the characteristics of multi-component，multi-target and multi-path mechanism in the treatment of craniocerebral injury.

Keywords Tongqiao Huoxue Decoction; Traumatic brain injury; Network pharmacology; Targets; Protein protein interaction network; Signal pathway; Enrichment analysis; Mechanism of action

中圖分類號：R285文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.15.012

創(chuàng)傷性顱腦損傷（Traumatic Brain Injury，TBI）是創(chuàng)傷患者死亡和致殘的主要原因，為臨床常見疾病[1-3]。由于TBI治療難度大、治療費用高，致殘率與致死率均較高，給患者個人及其家庭在經(jīng)濟(jì)、精神上造成巨大負(fù)擔(dān)[1，4-5]。西醫(yī)治療上，TBI可分為內(nèi)科保守常規(guī)治療和外科手術(shù)治療。而TBI的中醫(yī)治療亦具有豐富的臨證經(jīng)驗，但未形成系統(tǒng)的規(guī)范指導(dǎo)體系，因此關(guān)于中醫(yī)藥治療TBI以降低死亡率、致殘率，改善預(yù)后、提高生命質(zhì)量的研究意義重大。

TBI沒有中醫(yī)對應(yīng)的具體病名，可歸屬中醫(yī)學(xué)“外傷性腦病”“頭部內(nèi)傷病”等范疇。腦為元神之府，諸陽之匯，遭受外傷后，氣滯血瘀，阻塞清竅，腦氣逆亂，神明擾亂，神機(jī)失用為其主要發(fā)病機(jī)制。臟腑功能失調(diào)，正氣受損，痰瘀阻絡(luò)，為虛實夾雜之證。但瘀血阻滯則貫穿整個疾病過程。歷代醫(yī)家也認(rèn)可在臨床上應(yīng)用活血化瘀法治療顱腦損傷[6]。近年來，活血化瘀中藥治療廣泛應(yīng)用于顱腦損傷的救治;王永忠和伍世杰[7]通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)在西醫(yī)治療的基礎(chǔ)上配合以“活血化瘀”法為主中藥治療急性期腦挫裂傷對促進(jìn)早期清醒，降低致殘率方面有明顯療效。而徐澤彪等[8]通過臨床觀察更是發(fā)現(xiàn)通竅活血湯可以促進(jìn)顱腦損傷后患者腦血流的恢復(fù)、減輕腦血管痙攣，從而達(dá)到改善患者預(yù)后的效果，并且沒有誘發(fā)再出血的風(fēng)險。通竅活血湯由清·王清任所創(chuàng)，由赤芍，川芎，桃仁，紅花等藥物組成，具有活血化瘀，通竅活絡(luò)的作用，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實：桃仁、紅花、川芎、赤芍等的有效成分苦杏仁苷、紅花苷、川芎嗪等能通過血腦屏障，改善顱內(nèi)血液循環(huán)，提高腦部新陳代謝，以增強(qiáng)其對缺氧的耐受性[9]。上述諸藥合用可增加腦血管血流量，改善腦細(xì)胞血液循環(huán)及缺氧狀態(tài)[10]，從而加速顱內(nèi)血腫吸收，減輕腦組織因炎癥反應(yīng)所致的腦組織水腫，從而緩解顱高壓，促進(jìn)機(jī)體神經(jīng)功能的恢復(fù)，減低死亡率，提高生存率。而且目前通竅活血湯在創(chuàng)傷性顱腦損傷所致的腦外傷綜合征、神昏以及情志障礙方面的防范應(yīng)用已達(dá)成共識[11]。近期研究揭示了通竅活血湯改善顱腦損傷的作用機(jī)制為通過激活線粒體自噬從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，為顱腦損傷的臨床治療提供新的實驗支持和理論依據(jù)[12]。但是通竅活血湯治療TBI的關(guān)鍵作用靶點、信號通路目前仍不十分清楚，有待進(jìn)一步研究。融合系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)提出的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可構(gòu)建藥物-靶點-疾病之間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，利用網(wǎng)絡(luò)分析理論從整體角度研究藥物作用機(jī)制。運(yùn)用絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測通竅活血湯對TBI干預(yù)與影響的相關(guān)成分與靶點及通路，從整體探討藥物對TBI的調(diào)控作用，為進(jìn)一步闡明其活性成分、作用靶點以及發(fā)揮臨床療效的科學(xué)內(nèi)涵提供依據(jù)，探索TBI治療的新作用靶點與信號通路，并為后續(xù)研究提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 藥物相關(guān)活性成分及藥物靶點的篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）將通竅活血湯中的主要中藥（桃仁、紅花、川芎、赤芍、蔥白、生姜、大棗）進(jìn)行成分檢索，獲取每個中藥對應(yīng)的成分編號，根據(jù)對應(yīng)的口服生物利用度（OB）、類藥性（DL）值，以O(shè)B≥30%，DL≥0.18作為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出候選活性成分并整理對應(yīng)藥活性成分及潛在靶點信息，然后把獲得的靶點蛋白名通過UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）轉(zhuǎn)換為基因名。

1.2 核心靶點篩選與“活性成分-作用靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將“Traumatic Brain Injury”作為關(guān)鍵詞在OMIM（http：//www.omim.org/）與Genecards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫檢索TBI疾病靶點信息，之后與中藥活性成分靶點比對獲取交集靶點，以此繪制成通竅活血湯中藥活性成分靶點和TBI疾病靶點交集韋恩圖。然后在Cytoscape 3.7.2軟件中構(gòu)建“中藥活性成分-潛在靶點”“中藥-重要活性成分-疾病靶點”作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

獲得TBI與通竅活血湯的交集靶點后，使用STRING 11.0數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，分析條件設(shè)置如下：蛋白質(zhì)種類設(shè)置為“homo sapiens（人類）”，作用閾值設(shè)置為“medium confidence（中等）”，其他條件維持設(shè)置默認(rèn)。根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)中靶點的Count值作為依據(jù)篩選重要靶點蛋白，并進(jìn)行相應(yīng)分析。

1.4 基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

獲得通竅活血湯與TBI共同作用靶點蛋白后，進(jìn)行GO富集功能注釋分析和KEGG信號通路富集分析，探討通竅活血湯治療TBI的重要生物學(xué)過程與相關(guān)信號通路。從KEGG富集的結(jié)果中篩選具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）的信號通路，分析該關(guān)鍵靶標(biāo)和關(guān)鍵信號通路的含義，利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“KEGG信號通路-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 活性成分

共檢索通竅活血湯的中藥成分共1 065個，其中桃仁66個、紅花189個、川芎189個、赤芍119個、蔥白104個、生姜265個、大棗133個活性成分。篩選后收集得所有中藥成分127個，其中桃仁23個、紅花22個、川芎9個、赤芍29個、蔥白10個、生姜5個、大棗29個活性成分。見表1。包括鞣花酸、芍藥苷、黃芩素、楊梅酮、谷甾醇、豆甾醇等。去除重復(fù)后中藥靶點有122個，收集疾病靶點1 811個，疾病與藥物交集靶點共62個。見圖1。

2.2 中藥有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖與疾病-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

Cytoscape 3.7.2繪制中藥有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，圖中顯示106個節(jié)點，240條邊。見圖2。繪制疾病-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖中有118個節(jié)點，407條邊。見圖3。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將62個交集靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫獲取的相互作用關(guān)系的PPI網(wǎng)絡(luò)。見圖4。根據(jù)Count值大小排列前40個核心靶點。見表2。其中ALB、IL6、CASP3、EGFR、VEGFA為Count值最大的前5個靶點。

2.4 GO富集結(jié)果

GO富集相關(guān)73個條目。見表3。包括DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性，RNA聚合酶Ⅱ特異性，細(xì)胞黏附分子結(jié)合，類固醇結(jié)合，內(nèi)肽酶活性，類固醇激素受體活性等。

2.5 KEGG富集結(jié)果

KEGG富集結(jié)果共獲75條相關(guān)通路。根據(jù)Count值大小從中篩選前20條有顯著意義的富集信號通路。見表4。并用氣泡圖表示。見圖5。繪制通路與靶點相互作用的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。見圖6。其中PI3K-AKT、Kaposi sarcoma-associ-ated herpesvirus infection、Human cytomegalovirus in-fection、Fluid shear stress and atherosclerosis、Proteoglycans in cancer等與TBI關(guān)系最為密切。

3 討論

TBI的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜[13]，包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，但皆為外傷造成的暫時性或永久性的神經(jīng)元損傷。其中原發(fā)性損傷是指外力直接打擊造成的顱腦損傷，而繼發(fā)性損傷發(fā)生是指在原發(fā)性損傷的基礎(chǔ)上，因分子、化學(xué)物質(zhì)以及炎癥的級聯(lián)反應(yīng)造成的再次腦組織損傷，如神經(jīng)元去極化，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平升高，進(jìn)而激活蛋白酶、自由基等發(fā)生細(xì)胞凋亡，損傷神經(jīng)細(xì)胞;炎癥反應(yīng)的發(fā)生能使更多神經(jīng)元損傷、血腦屏障破壞以及腦水腫，引起凝血酶激活、炎癥反應(yīng)、紅細(xì)胞溶解[14]，繼而形成細(xì)胞凋亡、炎癥、神經(jīng)細(xì)胞壞死等最終導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙[15-17]。

我們通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法對通竅活血湯治療TBI的作用機(jī)制進(jìn)行了分析，共獲得127個有效成分，62個作用靶點，75條相關(guān)信號通路。中藥有效成分包括鞣花酸、芍藥苷、黃芩素、黃芩苷、β-谷固醇、阿魏酸等，其中鞣花酸具有抗氧化作用，對內(nèi)皮功能障礙治療、維持氧化還原平衡起作用[18-19];實驗表明芍藥苷對于小鼠腦損害的微血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用[20];黃芩素具有抗炎、抗凋亡、抗氧化應(yīng)激以及刺激神經(jīng)發(fā)生和促進(jìn)神經(jīng)保護(hù)因子的表達(dá)等多種藥理活性[21];有實驗證明黃芩苷可顯著抑制PI3K、AKT、GSK-3β的水平，對于凋亡生物過程起干預(yù)作用[22];植物固醇中的β-谷固醇直接或間接影響腦組織中關(guān)鍵物質(zhì)的合成，進(jìn)而可能影響大腦功能[23]，從而改善TBI治療預(yù)后;阿魏酸具有抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用等多種特性，能夠通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活來緩解炎癥反應(yīng)，減輕腦水腫，改善記憶功能，起到神經(jīng)保護(hù)作用[24]。上述表明通竅活血湯中各藥材在TBI治療中的共同協(xié)同作用，體現(xiàn)了中藥多成分協(xié)同保護(hù)神經(jīng)的特性。

PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果顯示，ALB、IL-6、CASP3、EGFR、VEGFA為前5位的重點靶點。ALB是血漿中最主要的功能性蛋白，與患者機(jī)體損傷存在密切相關(guān)性，維持血漿ALB水平有助于改善TBI預(yù)后[25]。IL-6是經(jīng)典的炎癥指標(biāo)，在腦損傷患者中，腦脊液和血清IL-6顯著上調(diào)與急性期反應(yīng)和腦脊液中神經(jīng)生長因子的釋放有關(guān)[26]。CASP3對調(diào)控細(xì)胞凋亡有重要作用，與凋亡誘導(dǎo)因子起相互作用[27]。內(nèi)皮生成因子VEGFA有維護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞完整，調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞生成、修復(fù)受損血管的作用，并且通過壞死物的清除與氧和代謝物的交換，以輔助神經(jīng)功能的修復(fù)[28]。表皮生長因子（EGF）及其受體EGFR在炎癥反應(yīng)、活性氧生成、髓鞘脫失和神經(jīng)元修復(fù)過程中發(fā)揮作用，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和修復(fù)相關(guān)[29-30]。ALB、CASP3、IL-6、EGFR與VEGFA上述5個核心靶點總體上與炎癥、血管、神經(jīng)功能調(diào)節(jié)、凋亡等相關(guān)，表明通竅活血湯的作用機(jī)制與上述生物功能相關(guān)。GO富集分析所得到的生物過程涉及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性，RNA聚合酶Ⅱ特異性，細(xì)胞黏附分子結(jié)合，類固醇結(jié)合，內(nèi)肽酶活性，類固醇激素受體活性，GO富集分析所得到的生物過程涉及DNA、RNA，細(xì)胞因子、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)，提示通竅活血湯通過上述生物過程治療TBI。KEGG信號通路分析示PI3K-AKT為主要信號通路。PI3K-AKT為凋亡信號通路，實驗發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號通路調(diào)節(jié)TBI大鼠腦皮質(zhì)區(qū)凋亡水平，側(cè)面證實PI3K/AKT信號通路發(fā)揮抗凋亡作用[31];黃芩素具有調(diào)控包括血管生成和促進(jìn)凋亡的生物學(xué)作用，并且可能與其具有抑制PI3K/AKT/GSK-3β通路的作用有關(guān)[32]。本研究預(yù)測通竅活血湯很可能是通過相關(guān)通路直接或間接地作用于某些靶點而發(fā)揮作用，具體的調(diào)節(jié)機(jī)制還需進(jìn)一步實驗的驗證。

4 結(jié)語

綜上所述，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能夠從整體把握中藥治療疾病的有效成分、關(guān)鍵作用靶點及主要信號通路，通過本研究，我們發(fā)現(xiàn)通竅活血湯療TBI作用機(jī)制中，主要通過中藥中芍藥苷、黃芩素等成分對ALB、IL-6、CASP3、EGFR、VEGFA等靶點發(fā)揮作用，其中PI3K-AKT為最主要的信號通路，推測其在抑制細(xì)胞凋亡與炎癥，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，從而抑制TBI病理發(fā)展過程，這也為后續(xù)研究通竅活血湯治療TBI提供了實驗研究方向。

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（2020-09-10收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）

基金項目：國家中醫(yī)藥管理局國家中醫(yī)臨床研究基地業(yè)務(wù)建設(shè)科研專項課題（JDZX2015043）——破血化瘀法治療出血性中風(fēng)急性期干預(yù)時點及風(fēng)險的研究;北京中醫(yī)藥大學(xué)2018年度基本科研業(yè)務(wù)青年教師項目（2018-JYBZZ-JS145）——通竅活血湯對顱腦損傷后患者神經(jīng)功能恢復(fù)及神經(jīng)因子含量的實驗研究

作者簡介：杜勇（1980.06—），男，碩士研究生在讀，主治醫(yī)師，研究方向：神經(jīng)外科疾病的中西醫(yī)結(jié)合診治，E-mail：dy2zsm@sina.com

通信作者：王革生（1967.11—），男，博士，主任醫(yī)師，研究方向：神經(jīng)外科疾病的中西醫(yī)結(jié)合診治，E-mail：wanggesh@sina.com