氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜法測定茶葉中63種農藥的多殘留

◎ 陳 喆

（福建省南平市食品藥品檢驗檢測中心，福建 南平 353000）

茶葉作為一種富含有機酸、鞣質、色素、生物堿、多酚及嘌呤等復雜化學成分的植物原料，其多組分農藥殘留測定問題一直是業(yè)界難點，前處理費時、耗力、耗材、費用高、基質效應強等特點成為行業(yè)多農殘分析的熱點靶向基質。一般通過QuEchERS方法（ACAS方法/歐盟方法）、快速濾過凈化管（m-PFC）[1]、傳統(tǒng)TPT或GCB/NH2小柱法[2]、溶劑萃取法、GPC[3]等各種前處理技術的使用，或是雙內標物法、保護劑雙柱串聯(lián)后反吹的儀器技術共同克服基質效應[4]。

本實驗中，茶葉里的待測農藥殘留組分經(jīng)乙腈-乙酸混合溶劑提取，采用QuEchERS凈化方法，通過多反應監(jiān)測模式（MRM）、基質標準工作曲線、內標法定量；優(yōu)化了氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜（GC-MS/MS）的定量離子和定性離子，增加定性識別點個數(shù)，有效減少定性誤判；同時對茶葉基質對多農藥殘留基質效應情況進行了研究。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

64種農藥標準物質及內標物，購于Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、丙酮（色譜純）；冰乙酸、無水乙酸鈉（分析純）；無水硫酸鎂（分析純，用前在500 ℃馬弗爐內烘5 h，冷卻后放入干燥器中備用）；PSA粉、C18粉、石墨化炭黑粉（GCB，購于島津公司）。

氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜儀（TSQ8000 Evo，美國賽默飛世爾公司）；高速離心機（美國Sigma公司）；IKA Tl8均質器（德國IKA公司）；多功能全自動樣品濃縮儀（Biotage）。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

分別準確稱取適量的農藥標準品，用丙酮溶解并定容，配制成1 000 mg·L-1的63種單一農藥標準儲備液和內標儲備液（內環(huán)氧七氯）；移取適量農藥標準儲備溶液至容量瓶中，用丙酮-正己烷（1∶1，V/V）稀釋并定容，配制成10 mg·L-1的農藥混合標準儲備液；移取適量內標儲備溶液至容量瓶中，用丙酮-正己烷（1∶1，V/V）稀釋并定容，配制成10 mg·L-1的內標儲備液；農藥標準溶液均貯存于（-18±1）℃冰箱中。

1.2.2 樣品處理

稱取2 g試樣（精確至0.01 g）于50 mL塑料離心管中，加10 mL水渦旋混勻，靜置30 min。加入15 mL乙腈-醋酸溶液（99∶1，V/V）、6 g無水硫酸鎂、1.5 g醋酸鈉及1顆陶瓷均質子，蓋上離心管蓋，劇烈振蕩1 min后在6 000 r·min-1離心5 min。吸取8 mL上清液加到內含1 200 mg硫酸鎂、400 mg PSA、400 mg C18及200 mg GCB的15 mL塑料離心管中，渦旋混勻1 min。6 000 r·min-1離心5 min，準確吸取2 mL上清液于10 mL試管中，40 ℃水浴中氮氣吹至近干。加入20 μL的內標溶液，加入1 mL丙酮-正己烷（1∶1，V/V）復溶，過微孔濾膜，用于測定。

1.3 氣相色譜-質譜聯(lián)用分析條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Pesticides II with 5 m guard石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國賽默飛公司）；柱溫：40 ℃；程序升溫過程：40 ℃保持1.5 min，以25 ℃·min-1程序升溫至90 ℃，再以25 ℃·min-1升溫至90 ℃，保持1.5 min， 再 以 25 ℃·min-1， 升 溫 至 180 ℃； 再 以5 ℃·min-1升 溫 至 280 ℃， 再 保 持 1.5 min； 再 以10 ℃·min-1，升溫至300 ℃，保持5 min。載氣：氦氣，碰撞氣：氮氣，純度均≥99.999%，載氣流速1.2 mL·min-1；進樣口溫度：270 ℃；進樣量：1 μL；進樣方式：不分流進樣。

1.3.2 質譜條件

EI電壓：70 eV；離子源溫度：300 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；數(shù)據(jù)采集方式：多反應監(jiān)測（MRM）；溶劑延遲：5 min，63種農藥成分的保留時間及優(yōu)化的MRM參數(shù)見表1。

表1 63種農藥成分的保留時間及優(yōu)化的MRM參數(shù)表

續(xù)表1

續(xù)表1

2 結果與分析

2.1 線性范圍、線性方程

精確吸取一定量的混合標準溶液，逐級用丙酮-正己烷（1∶ 1，V/V）釋成質量濃度為 5 μg·L-1、10 μg·L-1、50 μg·L-1、100 μg·L-1、200 μg·L-1和 500 μg·L-1的標準工作溶液?？瞻谆|溶液氮氣吹干，加入20 μL內標溶液，分別加入1 mL上述標準工作溶液復溶，過微孔濾膜配制成系列基質混合標準工作溶液，供氣相色譜-質譜聯(lián)用儀測定。以農藥定量離子峰面積和內標物定量離子峰面積的比值為縱坐標，農藥標準溶液質量濃度和內標物質量濃度的比值為橫坐標，繪制標準曲線，在5.0～500.0 μg·L-1的濃度范圍內，各目標組分在茶葉基質響應值比率與含量呈現(xiàn)良好的線性關系，相關系數(shù)（R2）均大于0.99，具體結果見表2。

表2 茶葉-基質標準溶液回歸方程、相關系數(shù)表

2.2 回收率、精密度、檢出限

2.2.1 樣品加標回收率和精密度

按1.2樣品處理和實驗條件，取茶葉樣品（綠茶、紅茶、烏龍茶），做3個濃度水平（分別為50 mg·kg-1、250 mg·kg-1、500 mg·kg-1）的標準加入回收實驗，稱取樣品后分別加入混合標準溶液，每個濃度添加水平均按本方法做6次平行測定，結果各農殘目標組分回收率為66.1%～126.1%，相對標準偏差（RSD）為1.7%～16.6%，詳見表3。

表3 茶葉樣品（加標樣品）中64種農藥殘留回收率、精密度表（n=6）

續(xù)表3

2.2.2 檢出限范圍情況

本次研究以綠茶作為茶葉基質代表，以S/N=3計算檢出限（LOD）。從圖1可以看出，63種農藥殘留目標分析物中有52種檢出限低于0.01 mg·kg-1，其中檢出限低于0.001 mg·kg-1的有 14種，檢出限為 0.001～ 0.005 mg·kg-1的有17種，檢出限為0.005～0.01 mg·kg-1的有20種；檢出限為0.01～0.05 mg·kg-1的有10種，僅有2種目標分析物檢出限大于0.05 mg·kg-1。

圖1 茶葉基質中63種農藥殘留目標分析物的檢出限范圍圖

2.3 定性能力

按照歐盟方法學標準[5]，質譜方法定性確證必須達到最少4個識別點要求，定性點越多定性越準確，反之則容易出現(xiàn)假陽性結果。對于低分辨質譜，MRM監(jiān)測模式下，至少選擇2個離子對進行定性確認，一對離子計為2～2.5個定性點。若是1個母離子加上2個子離子則識別點為4，若是2個母離子，且每個有1個子離子則識別點為5。

因此本實驗中，選擇1個定量離子對和2個定性離子對，且有34種農殘目標物MRM選擇離子對的母離子都不同，按照計算可以得到農藥殘留目標物的識別點達到7.5個，極大地保證了定性的準確性。對茶葉這一類基質效應影響較大、基質干擾物（如氨基酸、色素、鞣制等）比較復雜的樣品，可以有效解決前處理也可能無法消除的定性誤判問題。

圖2（A）為250 mg·L-1硫丹標準溶液3個檢測離子的MRM色譜峰相對離子強度比較圖，圖2（B）為250 mg·L-1硫丹（茶葉基質）溶液3個檢測離子MRM色譜峰相對離子強度比較圖。從圖2（A）可以看到離子對194.9→125的檢測離子125（b）與離子對194.9→159的檢測離子159（a）的相對離子強度比為80.41%，而圖2（B）可以看到離子對194.9→159的檢測離子159（a）有比較大的離子干擾，造成檢測離子159的色譜峰展寬拖尾嚴重，檢測離子125與檢測離子159的相對離子強度比為0.83%，不符合“檢測離子的相對離子強度比＞50%、相對離子強度應在±20%”的要求，誤判為陰性；而舍去離子對194.9→159的檢測離子159（a），使用選擇離子對194.9→125的檢測離子125（b），選擇離子對240.6→205.9的檢測離子205.9（c），有兩個母離子且每個都有1個子離子，定性識別點有5個，仍可滿足定性確證必須達到確認需要最少4個識別點要求，仍舊可將樣品判出陽性檢出。

圖2 硫丹3個檢測離子的MRM色譜峰相對離子強度比較圖

與常規(guī)方法比較，每個化合物多選擇一對定性離子對，當另外一對定性離子對受到通過前處理也無法消除的基質干擾時，仍舊不影響定性判定，在實際工作中靈活性強、便捷性高、應用范圍更廣，克服基質帶來的干擾更加有效。

2.4 基質效應對比

色譜分析中，由于樣品基質成分的存在，減少了色譜系統(tǒng)活性位點與目標分子作用的機會，使得目標分析物響應比純溶劑中的色譜響應高，出現(xiàn)基質效應增強的效果。基質效應的相對強度（Matrix Effect，ME）=（基質標準溶液的峰面積比值/溶劑標準溶液的峰面積比值）×100%。將綠茶、紅茶、烏龍茶、蘋果和大米空白基質按樣品方法進行處理，氮氣吹干，加入20 μL內標溶液，分別加入1 mL上述50 mg·L-1標準工作溶液復溶，過微孔濾膜配制成各種基質混合標準溶液，供氣相色譜-質譜聯(lián)用儀測定，得到定量離子峰面積與內標溶液之比值，與純溶劑50 mg·L-1標準溶液的對應目標物比值，按上述公式進行計算，可得農殘目標物的基質效應的相對強度。

從圖3可知，同一目標物在不同基質中所受的基質效應的大小各有不同，其中茶葉與其他植物源基質的基質效應比較而言尤為不同。其他植物源基質如蘋果對于有些農藥殘留目標分析物存在基質效應減弱的情況（ME小于100%），ME小于150%占到了1/3；而對于茶葉來說，不論綠茶、紅茶、烏龍茶都不存在目標分析物基質效應減弱的情況，64種農藥殘留分析基質效應影響超過600%占了1/2以上，而基質效應影響小于150%低于3%，說明茶葉基質對農藥殘留分析的影響更為復雜，目標分析物基質效應呈現(xiàn)強增強效應，必須使用基質加標曲線才能最大程度減小由于基質效應帶來的測定不準確性。

圖3 不同基質效應比較圖

通過3種茶葉對相應目標物基質效應的對比也可以發(fā)現(xiàn)，不同茶葉之間基質效應增強的情況比較一致，定量分析時使用一種茶葉基質作為基質加標曲線，即可有效克服基質效應，這也有利于日常開展茶葉農藥殘留的分析，減少工作的煩瑣程度。

2.5 實際樣品檢測

用所建立的方法對市售的3種茶葉（紅茶、綠茶、烏龍茶）共30例樣品進行測定，共有10批檢測出陽性目標物，其中綠茶和紅茶樣品農藥的檢出率較高，檢出頻率較高的農藥為毒死蜱、氟蟲腈、硫丹、聯(lián)苯菊酯、氯氰菊酯、高效氯氟氰菊酯，但均未超過最大殘留限量。

3 結論

本文建立了對茶葉中64種農藥殘留進行的QuEChERS-GC/MS/MS方法。該方法準確性和重復性好、操作簡便，適用茶葉類等復雜基質的多種農藥殘留的同時測定。優(yōu)化了氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜（GC-MS/MS）的定量離子和定性離子，增加定性識別點個數(shù)，有效減少定性誤判和克服離子干擾，研究了茶葉基質對多農藥殘留基質效應情況，為茶葉多農殘分析研究提供了可靠的檢驗方法。