非人靈長類帕金森模型的研究進展

劉永芳吳正存馬開利

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所,昆明 650118;2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,醫(yī)學(xué)靈長類研究中心&神經(jīng)科學(xué)中心,北京 100005)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是帕金森氏綜合征廣泛運動障礙中最常見的形式,以步態(tài)不穩(wěn)、肌肉僵直、運動遲緩、靜止性震顫為特征。新的診斷標(biāo)準(zhǔn)將姿勢不穩(wěn)排除在外。目前,全球PD患病人數(shù)超過六百萬,65歲以上人群發(fā)病率大約為1.5%[1],中國占全球發(fā)病人數(shù)的一半。據(jù)統(tǒng)計,隨著人口老齡化,截至2030年,全球50歲以上發(fā)病率將會增加一倍[2]。已有研究表明,PD的病理改變主要是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的進行性丟失、紋狀體多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的減少以及α突觸核蛋白包涵體的形成。臨床上,PD患者確診時已經(jīng)是疾病的中晚期,丟失了50%~60%多巴胺能神經(jīng)元和60%~70%的多巴胺能神經(jīng)遞質(zhì),大多出現(xiàn)運動癥狀,晚期伴有疼痛和抑郁,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。而疾病早期,多數(shù)患者會出現(xiàn)便秘、嗅覺障礙、睡眠障礙等非運動癥狀[3]。在確診之前,這些非運動癥狀往往并不會和PD聯(lián)系起來。目前,PD的治療藥物以多巴胺前體藥物左旋多巴和多巴胺受體激動劑為主,但隨著服用時間的延長,這些藥物的療效會逐漸減弱,并會引起藥物引發(fā)的震顫[4]。近些年來,非侵入性的深部腦刺激療法取得了良好的效果,可以緩解患者的疼痛,干細胞療法也開始走向臨床。但這些治療手段的發(fā)現(xiàn)和評價都離不開動物模型的建立,一個最接近臨床PD患者發(fā)病過程和病理變化的動物模型將有利于PD的發(fā)病機制、診斷、治療方法以及藥物篩選的研究。

嚙齒動物已經(jīng)廣泛用于建立PD模型,而非脊椎動物,如果蠅、線蟲、斑馬魚,由于其神經(jīng)元數(shù)量少,便于操作,可進行藥物高通量篩選,也常用于PD模型的建立。非人靈長類(non-human primate,NHP),在進化上與人類關(guān)系更近,大小、行為、生理、生化、免疫功能方面與人類更相似,更適合用于模擬人類疾病模型。最常用來建立PD模型的NHP有狨猴和獼猴。猴子具有一定的學(xué)習(xí)、認知、情緒、社交能力[5]。這使得相比較于嚙齒動物和豬,猴子更便于測試精細運動和非運動癥狀。猴腦和人腦的高度相似使得能用磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)和正電子發(fā)射計算機斷層顯像(positron emission tomography,PCT)對大腦結(jié)構(gòu)和功能進行非侵入性高分辨率成像。這些證據(jù)均表明NHP是更適合研究PD的動物,因此,本文通過總結(jié)和闡明PD的NHP模型研究現(xiàn)狀,為基于NHP的PD模型的藥物評價及機制研究提供參考和依據(jù)。

1 神經(jīng)毒素誘導(dǎo)模型

1.1 MPTP模型

MPTP,全稱1-甲基-4苯基-1,2,3,6-四氫吡啶,其可通過血腦屏障,被膠質(zhì)細胞膜上的單胺氧化酶B(monoamine oxidase B,MAO-B)代謝為1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridine ion,MPP+),后者可由多巴胺轉(zhuǎn)運體(dopamine transporter,DAT)轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi),與線粒體復(fù)合物Ⅰ結(jié)合,損傷氧化呼吸鏈,選擇性損傷多巴胺能神經(jīng)元[6]。因此,MPTP是最常用的制備PD模型的神經(jīng)毒素。不同獼猴物種對MPTP的敏感性不同,同一物種間不同猴子個體敏感性也有差異。食蟹猴和恒河猴同屬于獼猴。食蟹猴對MPTP的敏感性強于恒河猴[7]。Potts等[7]通過回顧108只獼猴靜脈注射MPTP的方案,給出建議:①單次MPTP注射后,3~8周內(nèi)運動障礙會自發(fā)恢復(fù),因此建議最后一次MPTP注射后,至少8周內(nèi)每周進行一次癥狀評估;②多次低劑量注射MPTP,可以減少并發(fā)癥的發(fā)生;③可根據(jù)動物的行為學(xué)調(diào)整MPTP劑量,直到出現(xiàn)“明顯運動障礙”為止。在靜脈注射MPTP的方案中,猴子雖能保持相對穩(wěn)定的癥狀,但仍然不能模擬PD慢性發(fā)生的過程。Seo等[8]在此基礎(chǔ)上作了改進,建立起一個穩(wěn)定的慢性NHP帕金森模型:一周兩次小劑量(0.2 mg/kg),左股骨區(qū)肌肉注射給藥,給藥48周后,模型猴的紋狀體和黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元明顯丟失,同時還發(fā)現(xiàn)模型猴中的T淋巴細胞慢性浸潤到了腦部。類似的,Masilamoni等[9]采用慢性MPTP給藥方案(0.2~0.5 mg/kg,肌肉注射,一周一次,持續(xù)21周),在猴子模型中重現(xiàn)了PD病人大腦中多巴胺能神經(jīng)元退變的模式。另有團隊采用前17周每周一次肌肉注射給予0.2 mg/kg劑量的MPTP,后4周調(diào)整為0.5 mg/kg的給藥方案,也建立出了穩(wěn)定的獼猴帕金森模型[10]。慢性給藥方案中,模型猴中腦腹側(cè)神經(jīng)元丟失多于背側(cè),而急性方案中腹側(cè)和背側(cè)丟失情況差不多。頸靜脈注射所需要的MPTP劑量一般會比皮下給藥的劑量要小。一周一次0.5 mg/kg MPTP皮下注射狨猴,總劑量2.5 mg/kg和6 mg/kg時,并未發(fā)現(xiàn)腦部明顯的病理變化,行為學(xué)也不明顯并且還發(fā)生恢復(fù)[11-12]。皮下連續(xù)給予MPTP,似乎能有更好的PD癥狀和病理表現(xiàn)。采用連續(xù)3 d分別2 mg/kg、2 mg/kg、1 mg/kg皮下注射的給藥方法,模型猴的左右兩側(cè)大腦損傷程度不一致,行為學(xué)特征持續(xù)了1年以上[13]。

老年猴通常比青年猴更易感。老年恒河猴單側(cè)給予MPTP,可誘導(dǎo)出中度帕金森癥狀。5~9歲恒河猴所需要的MPTP劑量是20~23歲猴的三倍[14]。普遍認為,老年動物可能更能模擬PD病人的實際情況,但也存在不同看法。Shi等[15]發(fā)現(xiàn)給老年恒河猴0.2 mg/kg劑量肌肉注射MPTP,第1次連續(xù)注射15 d,間隔8周后,第2次連續(xù)注射30 d,期間模型猴病情變化不可控,于是采用青年恒河猴分兩段給予MPTP:肌注+靜脈注射,呈現(xiàn)了穩(wěn)定的運動和非運動癥狀[16]。以往的MPTP模型研究中,大多檢測到猴子腦中有α突觸核蛋白(αsynuclein,α-syn)沉積,但沒有發(fā)現(xiàn)磷酸化的α-syn聚集體。但近幾年有研究者將MPTP給予恒河猴后,發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)生p-α-syn和路易病理,但無法重現(xiàn)特發(fā)性PD尾狀核-殼核漸變的特征[17]。NHP的MPTP模型總結(jié)見表1。

表1 非人靈長類MPTP模型總結(jié)Table 1 Summary of MPTP NHP model

1.2 6-OHDA模型

6-OHDA,中文名稱6-羥多巴胺,是一種多巴胺(dopamine,DA)類似物,可競爭性抑制DAT對DA的攝取,進入細胞后可抑制線粒體復(fù)合物Ⅰ和線粒體復(fù)合物Ⅳ的活性。6-OHDA不能通過血腦屏障,一般需要進行腦立體定位注射。對猴腦要進行多點注射,以保證藥物的均勻分布和減少自發(fā)恢復(fù)的發(fā)生。DA神經(jīng)遞質(zhì)的丟失、行為學(xué)的改變與6-OHDA劑量呈正相關(guān)性。關(guān)于6-OHDA關(guān)注的一個問題是注射部位的選擇。研究人員將180~216 μg的6-OHDA多點注射到狨猴的皮層和尾狀核進行比較,發(fā)現(xiàn)二者引起注意力發(fā)展方向不同[18]。單側(cè)注射到狨猴紋狀體內(nèi),5月后病變側(cè)DA能神經(jīng)元丟失46%,運動功能和感覺功能出現(xiàn)異常[19];注射到黑質(zhì),能引起多巴胺能神經(jīng)元丟失80%,非多巴胺能神經(jīng)元丟失77%,猴子出現(xiàn)姿勢改變,記憶障礙[20]。有人認為,單側(cè)模型并不能完全模擬PD的癥狀。2004年,Milton等[21]發(fā)現(xiàn)左側(cè)注射的PD模型猴子表現(xiàn)出空間和運動癥狀的單方面缺陷,而雙側(cè)注射的PD模型可能表現(xiàn)出雙側(cè)的精神障礙。2015年,Santana等[22]分兩個階段對狨猴內(nèi)側(cè)前腦束5個位點進行腦立體定位注射6-OHDA,總劑量為120 μg,發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了持續(xù)的帕金森癥狀。另外研究采用靜脈注射的給藥方式,以50 mg/kg劑量全身應(yīng)用6-OHDA,引起了心臟交感神經(jīng)去支配[23]、炎癥、氧化應(yīng)激、PPARγ激活[24]、近端結(jié)腸兒茶酚胺損失[25]。

2 轉(zhuǎn)基因模型

目前已有的PD轉(zhuǎn)基因模型主要基于α突觸核蛋白野生型及其A53 T突變型(第53位氨基酸由丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸)。同時,利用病毒載體局部或全身過表達制作轉(zhuǎn)基因動物的方式,因方便、快捷而受到科研人員的青睞,并且,有效病毒載體遞呈系統(tǒng)及高效的遞送方式的選擇是轉(zhuǎn)基因動物成功的關(guān)鍵。

2.1 遞呈系統(tǒng)的選擇

目前,常用的轉(zhuǎn)基因制備的病毒載體有腺相關(guān)病毒(adeno-associated viral vector,AAV)和慢病毒(lentivirus,LV)。

2.1.1 AAV病毒系統(tǒng)

AAV是單鏈DNA病毒,包裝容量大約4.7 kb,對外源基因的表達能力中等。因其不整合到宿主基因組中,因此目的基因可能在宿主傳代的過程中丟失。目前共發(fā)現(xiàn)12種血清型(AAV1-AAV12),不同血清型對組織的特異性不同。神經(jīng)領(lǐng)域使用較多的血清型有2、5、8、9型。AAV2型主要針對神經(jīng)系統(tǒng);AAV5型針對肺、眼、神經(jīng)系統(tǒng);AAV8型針對肝、肌肉、眼、神經(jīng)系統(tǒng);AAV9型針對肺、肝、肌肉、心臟和神經(jīng)系統(tǒng),且AAV9型在NHP腦部軸突中可以進行雙向運輸[26]。運用失去復(fù)制能力的AAV假病毒已成為趨勢,尤其是以2型為核心,其他型為衣殼蛋白的血清型病毒。Allocca等[27]發(fā)現(xiàn)AAV2/5型載體可容納的基因組可擴大到8.9 kb。Gerits團隊比較了不同血清型和不同啟動子下報告基因在恒河猴新皮層的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,發(fā)現(xiàn)鈣調(diào)蛋白激酶II(CaMKIIα0.4)啟動子下,病毒的傳播效率為:rAAV2/5>>rAAV2/7>rAAV2/8>rAAV2/9>>rAAV2/1,轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的比例為:rAAV2/1>rAAV2/5>rAAV2/7=rAAV2/9>rAAV2/8[28]。與嚙齒動物不同,通用巨細胞病毒(cytomegalovirus,CMV)啟動子在恒河猴腦中效果最差。而另一研究組給6只獼猴右殼核和同側(cè)內(nèi)囊注入相同劑量的病毒,發(fā)現(xiàn)rAAV2/1、rAAV2/2和rAAV2/5在大腦中的總體擴散沒有顯著差異。而在大腦和遠端神經(jīng)元結(jié)構(gòu)(脊髓和周圍神經(jīng))中,rAAV2/1和rAAV2/5在每個細胞中的載體拷貝數(shù)高于rAAV2/2[29]。利用AAV2/9遞送基因發(fā)現(xiàn),無論動物年齡,轉(zhuǎn)導(dǎo)的最主要的細胞類型都是星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞。據(jù)此,綜合考量與實際案例來看[30-32],目前,AAV2/5型和AAV2/9型可能更適合作為PD造模的血清型,AAV2/1也可作為參考。

2.1.2 LV病毒

LV是一種由人免疫缺陷病毒改造而來的單鏈RNA病毒,包裝容量<9 kb,能隨機整合在宿主基因組中。2001年,美國科學(xué)家將滅活的慢病毒注射進獼猴體外受精的胚泡中,制備了第一只攜帶綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的轉(zhuǎn)基因猴“安迪”,但綠色熒光蛋白基因并不在其生殖細胞中表達[33]。2008年,Yang等[34]在4~8細胞期的胚胎中注射攜帶亨廷頓基因的高滴度的慢病毒,第一個亨廷頓恒河猴模型誕生,但至此,尚未證明基因能向后代傳遞。2009年,日本科學(xué)家將滅活的5.6×109~5.6×1011/mL滴度的EGFP-慢病毒注射到狨猴最早時期的胚胎中,EGFP在狨猴后代中多個器官中表達,實現(xiàn)了種系的傳遞[35]。

2.2 遞送方式

2.2.1 局部注射

在NHP中,腦立體定位普遍針對黑質(zhì)和紋狀體,而未見有報道直接采用腦室注射。2003年,Kirik等[30]率先用AAV2型載體通過腦立體定位注射的方式向黑質(zhì)內(nèi)遞送野生型及A53T突變型的αsyn,16周后發(fā)現(xiàn)A53T突變引起30%~60%的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元丟失,存活的黑質(zhì)神經(jīng)元細胞中90%~95%的細胞有陽性α-syn包涵體。利用rAAV2/5型載體在成年猴腹側(cè)中腦中表達人野生型α-syn,然而神經(jīng)變性僅局限于尾狀核多巴胺能神經(jīng)纖維[31],并且他們還證實過表達人A53T能導(dǎo)致黑質(zhì)多巴胺能細胞死亡[36]。這證明A53T毒性強于野生型α-syn。Koprich等[32]利用AAV2/1型載體讓黑質(zhì)內(nèi)過表達α-syn A53T突變體發(fā)現(xiàn)病毒滴度為1.7×1012時沒有顯著性的病理變化;而當(dāng)?shù)味冗_到5.1×1012時黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元減少50%,紋狀體多巴胺減少60%,且病毒表達持續(xù)至少4個月。這些證據(jù)表明,成年猴腦立體定位注射AAV載體可以實現(xiàn)局部的目的基因表達,并能表現(xiàn)出一定的相關(guān)表型,且可通過調(diào)整病毒滴度來控制目的基因的表達量。

除了腦立體定位外,為了探究α-syn從腸道逆行傳播到大腦的假說,Manfredsson等[37]將AAV2/5-CBA-α-syn注射到結(jié)腸和胃,發(fā)現(xiàn)腸神經(jīng)系統(tǒng)明顯的α-syn病理,但猴子腦中并沒有任何病理出現(xiàn)。

2.2.2 全身給藥

(1)成體全身給藥

為了提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,近幾年開始不斷嘗試宮內(nèi)感染、出生后進行靜脈注射或鞘內(nèi)給藥。2003年,Garrett等[38]將rAAV2-GFP注射進羊膜囊,72 h后開始表達和分泌GFP,并且維持了1年以上。rAAV2/9靜脈注射能通過血腦屏障,并長期表達。獼猴圍生期后期,研究人員將scAAV9-CMV-eGFP通過臍靜脈注射進兩只獼猴胎兒,病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)到了中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)[39]。同時,給P1、P30、P90、3歲的食蟹猴靜脈注射rAAV2/9-GFP,發(fā)現(xiàn)成年猴子比年輕猴子轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低[40]。這些數(shù)據(jù)表明,幼年比成年神經(jīng)元更容易受到病毒感染。AAV9型病毒鞘內(nèi)給藥也可以實現(xiàn)基因的持續(xù)表達,長達4年[41]。

(2)卵母細胞或胚胎時期注射

相比于胎兒或新生兒,更早的時間點還可以選擇卵母細胞或胚胎前期。Niu等[42]以109/mL滴度的人A53T突變型慢病毒遞送至MⅡ期恒河猴卵母細胞,之后進行體外受精(in vitrofertilization,IVF)和胚胎植入,成功制作6只A53T轉(zhuǎn)基因猴,進一步檢測證實A53T突變基因在全身器官中表達,并出現(xiàn)了年齡相關(guān)的認知缺陷和焦慮,并且A53T突變的猴腦比鼠腦具有更廣泛的神經(jīng)變性。其中,值得注意的是,注射時機的選擇對轉(zhuǎn)基因猴組織表達的廣泛性具有重要的作用。2016年,Seita團隊用帶人類巨細胞病毒即刻早期增強子和雞β肌動蛋白啟動子的GFP慢病毒表達載體注射食蟹猴,產(chǎn)生了全身表達GFP的轉(zhuǎn)基因猴[43],但發(fā)現(xiàn)向受精前的成熟卵母細胞注射LV表達系統(tǒng),可在組織中實現(xiàn)均勻的GFP表達,而向受精卵中注射病毒則產(chǎn)生鑲嵌表達的轉(zhuǎn)基因猴。2017年,Tomioka團隊報道,他們使用四環(huán)素誘導(dǎo)的慢病毒載體表達系統(tǒng)產(chǎn)生了新型的轉(zhuǎn)基因猴[44]。

3 基因編輯技術(shù)

基因編輯技術(shù),如鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases,ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENS)、成簇的規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspersed short palindromic repeats,CRISPR),可以實現(xiàn)定點編輯。ZFN是第一個可編程的核酸酶。1996年,有報道將模塊鋅指蛋白(zinc finger protein,ZFP)與Fokl限制酶非特異切割域融合,ZFN由此產(chǎn)生。Folk核酸酶必須二聚體才具有切割功能。ZFP由包含結(jié)合鋅原子的半胱氨酸和組氨酸對的30個氨基酸殘基組成,即ZF基序,每個ZF基序識別3~4 bp的序列,通過將α螺旋插入DNA大溝來與DNA結(jié)合。與ZFN類似,將來源于植物病原體的TAL效應(yīng)子模塊融合到Folk切割域上,稱作TALENS。TALENS制作核酸酶的方式更簡單。CRISPR/Cas是細菌免疫系統(tǒng)的一部分,這個技術(shù)被分為兩部分:單個指導(dǎo)RNA(single guide RNA,sgRNA)和一個Cas核酸內(nèi)切酶。最常用的Cas核酸內(nèi)切酶是Cas 9。ZFN成本高,效率低;TALENS效率高、脫靶率低、構(gòu)建周期短;Cas 9效率是TALENS的5倍,實際操作更簡單。

目前,這幾種技術(shù)在哺乳動物中都有一定的應(yīng)用,但在帕金森猴中的應(yīng)用仍極為有限。近幾年,日本科學(xué)家Coghlan等[45]通過基因組編輯技術(shù)突變了狨猴的SNCA基因,產(chǎn)生了第一只帕金森狨猴模型,狨猴在第一年出現(xiàn)睡眠障礙,第二年腦干出現(xiàn)路易病理,第三年發(fā)生震顫。2019年,國內(nèi)學(xué)者楊偉莉等[46]使用CRIPSR Cas9技術(shù)生成了第一只PINK1敲除猴,其皮層、紋狀體、黑質(zhì)出現(xiàn)顯著神經(jīng)元退性?；蚓庉嬘兄鴱姶蟮膽?yīng)用前景,但基因編輯技術(shù)難度高,仍存在脫靶、鑲嵌表達模式、低同源重組的缺點,仍面臨要攻關(guān)很多問題。

4 PFF模型/LB模型

路易小體(Lewy bodies,LB)是PD的病理性標(biāo)志,而LB中主要成分為淀粉樣纖維聚集體,α-syn是其中含量最高的成分[47]。于是α-syn聚集體和PD的關(guān)系令人著迷。現(xiàn)在普遍認為α-syn單體和規(guī)則整齊的纖維是無毒的,而寡聚體和形成纖維之前的原纖維(preformed fibrils,PFF)是有毒的形式。其PFF的制備已經(jīng)有一定的基礎(chǔ)和成形的方案,而寡聚體的制備仍然存在難度。將制備的α-syn PFF注射進猴子體內(nèi)的確產(chǎn)生了PD病理。Shimozawa等[48]向成年狨猴紋狀體內(nèi)注射α-syn PFF,三月后,α-syn S129磷酸化免疫反應(yīng)檢測陽性,而且α-syn從紋狀體向黑質(zhì)擴散,誘發(fā)了PD樣α突觸核蛋白病理,這是第一個狨猴α-syn傳播模型。有團隊向獼猴腸道接種α-syn PFF,1個月后,在迷走神經(jīng)和藍斑背側(cè)運動核檢測到少量的病理性α-syn,研究持續(xù)12個月后,腸神經(jīng)系統(tǒng)仍有穩(wěn)定病理性的α-syn,而腦組織中卻并未發(fā)現(xiàn)[37],這說明α-syn從外周傳遞到中樞可能只是偶然事件。

將PD患者腦中提取的LB接種到猴子黑質(zhì)或紋狀體內(nèi),也可以引起α-syn病理和神經(jīng)退行性病變[49]。最近,Arotcarena等[50]向狒狒的紋狀體或腸道注射PD患者來源的α-syn聚集體,然而迷走神經(jīng)中并未發(fā)現(xiàn)α-syn病理學(xué)的改變,該研究同樣不支持通過迷走神經(jīng)和背側(cè)運動核傳遞α-syn的假說。

5 討論

NHP的生命周期較長,這使得我們有機會來觀察造模過程中的病理變化。目前,MPTP模型是PD模型的金標(biāo)準(zhǔn)。神經(jīng)毒物模型方法簡單,易操作,病理變化一般與劑量呈正相關(guān)。由于人類對MPTP極其易感,所以使用MPTP對實驗室和操作人員要求較高,防止造成MPTP泄露。而6-OHDA不能通過血腦屏障,多采取一次腦立體定位注射,相對安全很多。而神經(jīng)毒物造成的傷害一般比較直接,一般沒有報道有路易小體的形成,且容易錯過PD前期的發(fā)病過程。因此,推薦低劑量、長時間給藥。轉(zhuǎn)基因模型通常有一定難度。合格的轉(zhuǎn)基因模型應(yīng)該具備以下特征:①基因能整合到宿主基因組中;②基因能表達且有生物活性;③種系傳遞[51]。因為,AAV并未整合在基因組中,所以,AAV載體遞送的基因在猴子傳代的過程中可能會發(fā)生丟失。另外,研究顯示小鼠腦中pα-syn水平與黑質(zhì)紋狀體變性程度有關(guān),而與小鼠不同的是,猴子的p-α-syn水平與神經(jīng)變性之間沒有相關(guān)性[52]。值得注意的是,猴子本身的α-syn就含有A53T突變,所以,猴子體內(nèi)過表達α-syn A53T突變的蛋白是否能代表人體內(nèi)的A53T突變表型有待考證。CRISPR技術(shù)與其他基因編輯技術(shù)相比,可以實現(xiàn)對特定的基因位點進行編輯,成本也降低,但操作難度大,仍存在脫靶的問題。然而,轉(zhuǎn)基因模型可以從基因水平來研究疾病機理,有神經(jīng)毒物模型不能替代的優(yōu)點。路易小體是PD患者腦中標(biāo)志性的病理,而α-syn作為其中主要的成分,被認為PFF形式是有毒的,現(xiàn)在也有人認為寡聚體毒性更強。重組α-syn PFF模型也重現(xiàn)了PD中多巴胺能神經(jīng)元丟失的特征,但其PFF制備的質(zhì)量通常不穩(wěn)定。PD患者腦中提取的LB產(chǎn)物成分更為復(fù)雜,達到70多種,不同人員,以及每一批次之間成分的差異可能會導(dǎo)致結(jié)果的變異。

6 小結(jié)

總之,即使NHP也有一定的缺陷,但仍然是與人類最接近的動物,在研究疾病機理、藥物臨床前安全性評價上仍然具有不可替代的作用,但由于倫理原因,要嚴(yán)守3R原則,只在必要的時候使用NHP。

續(xù)表1