基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的分子診斷技術(shù)原理及應(yīng)用研究進展

劉曉靜 原志偉 劉振波

（1.中華人民共和國榮成海關(guān) 山東榮成 264300；2.中華人民共和國威海海關(guān)）

1 前言

自2012年以來，科研人員常用CRISPR技術(shù)對生物的DNA序列進行敲除、突變、替換或添加，CRISPR技術(shù)用于基因編輯具有成本低廉、構(gòu)建簡單、操作方便、適用廣泛等特點，因此研究人員稱之為“基因魔剪”，該項技術(shù)也因此獲2020年度的諾貝爾化學(xué)獎，這一革命性的發(fā)現(xiàn)為整個生物技術(shù)領(lǐng)域提供了無限可能。自2017年以來，CRISPR技術(shù)在分子診斷領(lǐng)域迅速崛起，并具有快速、準確、經(jīng)濟、設(shè)備依賴性低的優(yōu)勢[1]。

目前基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的核酸分子診斷方法種類繁多，根據(jù)CRISPR診斷背后的Cas蛋白的不同，本文綜述了4種具有代表性的Cas蛋白核酸分子診斷技術(shù)原理及應(yīng)用研究進展。隨著CRISPR技術(shù)的不斷發(fā)展完善，該技術(shù)必將給病原體快速診斷帶來重大變革。

2 CRISPR/Cas系統(tǒng)簡介

2.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)

CRISPR/Cas系統(tǒng)廣泛存在于細菌和古細菌中，是抵抗外源遺傳物質(zhì)（如噬菌體和質(zhì)粒）侵入的獲得性免疫系統(tǒng)。成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（CRISPR，Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）和CRISPR關(guān)聯(lián)蛋白（CRISPR associated proteins）共同簡稱為CRISPR/Cas系統(tǒng)。圖1展示了完整的CRISPR/Cas系統(tǒng)基本結(jié)構(gòu)組成。其中，CRISPR序列由眾多短而保守的重復(fù)序列區(qū)（repeat）和間隔區(qū)（spacer）組成。而在上游的前導(dǎo)區(qū)（leader）被認為是CRISPR序列的啟動子。

圖1 CRISPR/Cas系統(tǒng)基本結(jié)構(gòu)組成

另外，在上游還有一個多態(tài)性的家族基因，該基因編碼的蛋白均可與CRISPR序列區(qū)域共同發(fā)生作用，因此該基因被命名為Cas基因。tracrRNA的全稱是trans—activating crRNA（反式激活crRNA），位于Cas基因以及前導(dǎo)序列-重復(fù)-間隔序列的反方向，介導(dǎo)非編碼前體crRNA（pre-crRNA）的成熟以獲得crRNA（CRISPR RNA），也被稱為向?qū)NA（guide RNA，gRNA）[2]。

2.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的作用機理

在不同的細菌或古細菌中，CRISPR/Cas系統(tǒng)擁有眾多類別，其中對CRISPR/Cas9系統(tǒng)是目前研究最為深入、透徹的，本節(jié)以從化膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）中分離出的CRISPR/Cas9系統(tǒng)為例介紹其分子作用機制。當病毒首次入侵時，細菌將病毒入侵的小片段DNA序列整合到自身的CRISPR間隔區(qū)；病毒再次入侵時，在前導(dǎo)區(qū)的調(diào)控下，CRISPR序列被轉(zhuǎn)錄為由多個crRNA組成的長pre-crRNA，然后pre-crRNA將與多個tracrRNA配對，緊接著被RNaseIII等酶加工成含有與病毒靶標序列匹配的單獨的crRNA-tracrRNA結(jié)構(gòu)即gRNA，Cas9蛋白再與gRNA形成核糖核蛋白復(fù)合物（Cas9-gRNA），最終Cas9蛋白在gRNA引導(dǎo)下發(fā)揮核酸內(nèi)切酶活性對靶標序列進行識別和降解。其中Cas9蛋白對靶標序列的識別必須依賴于原間隔序列毗鄰基序PAM（Protospacer adjacent motif），PAM位點位于靶dsDNA的非互補鏈下游短的保守序列，通常由NGG 3個堿基構(gòu)成（N為任意堿基），但從不同物種發(fā)現(xiàn)的各種Cas9系統(tǒng)識別不同的PAM序列[3]。

2.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)的分類

根據(jù)效應(yīng)蛋白數(shù)量的不同，CRISPR/Cas系統(tǒng)可分為2類，第1類系統(tǒng)需要利用多個效應(yīng)蛋白復(fù)合物，而第2類系統(tǒng)只需單個效應(yīng)蛋白就可以發(fā)揮作用[4]。而根據(jù)最新的分類標準，CRISPR/Cas系統(tǒng)分為2類、6種型和33種亞型，其中第1類系統(tǒng)主要包括I、III、IV型，共16種亞型；第2類系統(tǒng)主要包括II、V、VI型，共17種亞型[5]。

由于第2類系統(tǒng)只需要單一效應(yīng)蛋白，這一系統(tǒng)的效應(yīng)蛋白在核酸分子診斷領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛。其中，II型CRISPR/Cas系統(tǒng)的標簽基因為Cas9；V型CRISPR/Cas系統(tǒng)標簽基因為Cas12，其種類最為豐富，目前已有多達11種亞型（Cas12a-k）被鑒定，而最近發(fā)現(xiàn)的CasX歸類為Cas12e、CasY歸類為Cas12d、Cas14歸類為Cas12f、Casφ歸類為Cas12j；VI型CRISPR/Cas系統(tǒng)的標簽基因為Cas13，目前已有4種亞型（Cas13a-d）被鑒定[6]。大部分第2類系統(tǒng)是從細菌基因組中發(fā)現(xiàn)的，但CRISPR/Cas14是從古細菌基因組中發(fā)現(xiàn)的，而CRISPR/Casφ是從巨型噬菌體基因組中發(fā)現(xiàn)的[7]。

2.4 CRISPR/Cas系統(tǒng)分子診斷技術(shù)原理

與Cas9最大不同是，Cas12和Cas13中的某些亞型在向?qū)NA的引導(dǎo)下，除了識別目標序列啟動靶向切割活性后，還表現(xiàn)出間接的非特異性切割活性，對于碰到的任何ssDNA或ssRNA都可將其剪切、降解，這種特性也稱“附帶切割”或“反式切割”活性，如果在反應(yīng)體系中加入帶有熒光基團的報告核酸分子，使其釋放出熒光信號，就可以指示目標核酸分子的存在，這就是CRISPR/Cas系統(tǒng)的分子診斷基礎(chǔ)[8]。常用的一種報告核酸分子是一段寡核苷酸：一端附有一個熒光素（F），另一端有一個暗淬滅劑（Q），由于猝滅作用，一個完整的報告核酸分子不會發(fā)出熒光，上述Cas蛋白與目標序列結(jié)合后，非特異性切割活性就被激活，剪切報告核酸分子，其熒光素擺脫了Q的淬滅，釋放出熒光。該診斷系統(tǒng)的高度特異性取決于gRNA對靶序列的識別，而高靈敏度則來自激活后Cas蛋白的非特異性切割活性。

3 CRISPR/Cas系統(tǒng)的常用分子診斷平臺

3.1 CRISPR/Cas9分子診斷平臺

Cas9蛋白酶雖然不具有非特異性切割活性，但在可以把Cas9和PCR結(jié)合起來做輔助的特異性診斷。2016年，Collins首次將CRISPR/Cas9系統(tǒng)引入核酸分子診斷，開發(fā)了一種鑒別寨卡病毒譜系的新技術(shù)[9]。在該方法中PAM位點僅存在于美洲譜系寨卡序列中，只有美洲型序列能被Cas9切割，這導(dǎo)致截短的RNA的擴增，而非全長的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不激活傳感器開關(guān)。相反，非洲型序列不含有PAM位點，從而免受Cas9切割，這導(dǎo)致全長RNA的擴增，擴增產(chǎn)物激活RNA傳感器開關(guān)，該方法可以在數(shù)小時內(nèi)提供精確的基因型信息。基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)也被應(yīng)用于HPV病毒分型檢測[10]。HPV16和HPV18型是引起宮頸癌病變的2種主要病毒亞型，通過設(shè)計可以特異性識別HPV16和HPV18型的單一向?qū)NA（single guide RNA，sgRNA，是一個由crRNA和tracrRNA連接構(gòu)成的融合體），并對HPV DNA進行切割，切割后的DNA鏈將不能進行擴增，然后采用定量PCR方法來評價切割底物的濃度從而可以判別病毒序列。

2019年，一種名為FLASH技術(shù)被用于富集低豐度的病原體抗菌素耐藥性序列[11]。FLASH技術(shù)使用一組Cas9的sgRNA，并設(shè)計用于將感興趣的序列切割成適合Illumina測序的大小片段。輸入基因組DNA或cDNA首先被磷酸酶處理阻斷，然后用于這組sgRNA混合的Cas9酶切消化，因此所得的切割產(chǎn)物能夠連接通用測序銜接子。通過擴增，靶向序列得到富集并用于流式池測序，這種方法超越了其他基于CRISPR的診斷工具，因為它可實現(xiàn)高水平的多重應(yīng)用（高達數(shù)千個目標）。另外，通過生物工程改造的Cas9酶結(jié)構(gòu)域可以被突變而失去剪切活性。如果僅一個核酸酶結(jié)構(gòu)域被突變，將得到Cas9切口酶（Cas9 nickase，Cas9n）；如果2個核酸酶結(jié)構(gòu)域都被突變，將得到失去剪切能力的dCas9（nuclease deactivated Cas9，dCas9）。Koo等[12]發(fā)展了一種結(jié)合dCas9和單微環(huán)諧振體生物傳感器的分子診斷技術(shù)，實現(xiàn)無標記和實時檢測致病性DNA和RNA。Wang等[13]發(fā)展了另一種稱為基于Cas9n的擴增反應(yīng)（Cas9nAR），該方法可以在37℃的恒定溫度下從基因組DNA中擴增靶片段。

3.2 CRISPR/Cas13a分子診斷平臺

2016年，張峰團隊首次闡述了CRISPR/Cas13a系統(tǒng)的功能和機理，同年Doudna團隊驗證了張峰團隊的結(jié)論：Cas13a具有特異性地剪切靶RNA和激活后非特異性降解其他RNA的功能[14]。在Cas13a系統(tǒng)基礎(chǔ)上，2017年，張峰團隊又引入了重組酶聚合酶等溫擴增技術(shù)（RPA），組成新的檢測系統(tǒng)，命名為SHERLOCK（specific high-sensitivityenzymatic reporter unlocking）技術(shù)[15]。待檢驗的核酸分子，如果是DNA，就先通過RPA擴增，如果是RNA，則通過RTRPA擴增。擴增后的DNA產(chǎn)物再通過轉(zhuǎn)錄變成RNA分子。靶RNA的檢測最后通過Cas13a-crRNA和報告RNA來完成。SHERLOCK展現(xiàn)出aM靈敏度及單堿基的特異性，遠遠超出了臨床檢測要求，但缺點是一次只能檢測一種核酸序列，且需要額外的設(shè)備收集熒光數(shù)據(jù)。為解決這些不足，2018年張鋒團隊再次升級了SHERLOCK技術(shù)，推出SHERLOCK v2。具體包括：在檢測體系中引入輔助性CRISPR酶Csm6，進一步提高其檢測靈敏度；加入多種Cas蛋白，根據(jù)蛋白酶不同的切割偏好，選取不同的特異性熒光報告基團，實現(xiàn)一次性檢測多種類型病毒核酸的目的；將紙基傳感器引入檢測系統(tǒng)，使操作簡單方便，可直接用肉眼觀察試驗結(jié)果。

此項技術(shù)已經(jīng)在肺癌患者血液樣本中檢測到游離的腫瘤DNA，90 min以內(nèi)就可以檢測到濃度為2amol/L以上的ZIKA和DENV的單鏈RNA[16]。這種不需要儀器的可視化檢測為現(xiàn)場檢測提供了快捷、簡便的途徑。自然界中核糖核酸酶（RNase）廣泛存在且十分穩(wěn)定，而SHERLOCK系統(tǒng)的關(guān)鍵組分均為RNA，因此該系統(tǒng)對操作環(huán)境要求較為苛刻。為了直接從臨床樣品中提取病毒核酸并且防止其降解，2018年，Myhrvold等將HUDSON技 術(shù)（heating unextracteddiagnostic samples to obliterate nucleases）和SHERLOCK技術(shù)結(jié)合，實現(xiàn)了登革和寨卡病毒的即時檢測（point-of-care testing，POCT）。HUDSON技術(shù)通過對臨床樣本的兩步快速熱處理和化學(xué)處理，實現(xiàn)滅活核酸酶和病毒的同時釋放病毒核酸。2種技術(shù)的聯(lián)合使靈敏度增至1個拷貝/mL，不需要復(fù)雜的核酸提取技術(shù)，2 h內(nèi)便可完成臨床多種樣本中的登革病毒檢測[17]。

3.3 CRISPR/Cas12a分子診斷平臺

2018年4月，Doudna團隊找到了Cas12a，Cas12a不是一個新蛋白，而是張鋒團隊于2015年9月發(fā)現(xiàn)并命名的Cpf1，Cas12a-crRNA識別單鏈或雙鏈DNA。一旦被激活后，Cas12a非特異性地剪切、降解單鏈DNA。他們借鑒了SHERLOCK技術(shù)，也引進了RPA步驟。RPA＋Cas12a成為新的核酸分子檢驗技術(shù)，被命名為DETECTR，與SHERLOCK相比，DETECTR省掉了從擴增后的DNA產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄到RNA這一步。該方法能夠從臨床樣本中快速而準確地檢測出與宮頸癌相關(guān)的16和18型的HPV，為準確檢測并區(qū)分HPV病毒亞型提供了高效平臺。在DETECTR方法的基礎(chǔ)之上發(fā)展起來了諸多檢測方法，它們利用了不同的等溫核酸擴增方法，如環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（Loop-mediated isothermalamplification，LAMP）和不同的信號輸出方式[18]。

3.4 CRISPR/Cas14分子診斷平臺

2018年10月，Doudna團隊通過對環(huán)境樣本進行宏基因組測序，構(gòu)建了微生物的宏基因組數(shù)據(jù)庫，他們在一種名為DPANN的古生菌基因組中發(fā)現(xiàn)了僅有已知Cas酶1/2大小的迷你酶—Cas14。Cas14可以在不需要PAM序列的情況下靶向切割單鏈DNA，與Cas12a和Cas13a一樣，也具有附帶切割的特點，即一旦與目標模板結(jié)合，便可以瘋狂切割體系內(nèi)單鏈底物DNA。不同點在于，Cas14需要2個更長的小分子RNA的協(xié)助。與Cas12a-DETECRTR開發(fā)原理相似，Doudna團隊研發(fā)了Cas14-DETECRTR技術(shù)，由于Cas14-sgRNA只識別單鏈DNA不需要PAM序列，為使可選的病原體目標序列更加廣泛，RPA擴增產(chǎn)物需要被轉(zhuǎn)變?yōu)閟sDNA。

他們采用一種巧妙的方法：在擴增DNA時，一對引物中只有一個含有phosphorothioate（PT）。擴增后，沒有被PT保護的DNA鏈會被T7外切酶降解，而有PT保護的單鏈則幸存下來，繼續(xù)被Cas14-sgRNA甄選。相比于Cas12a，Cas14對目標序列的識別可以更加精確，可以檢測到單個核苷酸多態(tài)性（SNP）。根據(jù)這一特點，Doudna團隊用Cas14-DETECTR建立了高保真的SNP基因型分析方法。文中的示例是區(qū)分藍色眼睛和棕色眼睛的基因型。通過調(diào)控下游的OCA2基因，人的HERC2基因中第86個內(nèi)顯子的一個堿基的差別決定了眼睛顏色的差異：G是藍色，A是棕色。通過對志愿者的唾液分析，可以迅速、準確地查出決定眼睛顏色的SNP基因分型[19]。

4 結(jié)論

開發(fā)有效的診斷工具對于正確地診斷和治療疾病至關(guān)重要，在過去十多年間，基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的診斷方法的發(fā)展以及對這些系統(tǒng)進行的設(shè)計和改造，使針對各種病原體的快速檢測成為可能?；贑RISPR/Cas系統(tǒng)的核酸分子診斷方法，它以顯著的方便性、敏感性和特異性為臨床實驗室開辟了一個新的窗口，不僅有可能在日常實踐或大流行期間檢測病原體，如2019年爆發(fā)的新型冠狀病毒疫情，而且有可能檢測癌癥和遺傳性疾病。

本文對CRISPR/Cas系統(tǒng)核酸分子診斷平臺及其生物學(xué)機制作一綜述，旨在指導(dǎo)核酸分子診斷技術(shù)的進步。盡管已經(jīng)報道了基于核酸分子診斷平臺的CRISPR/Cas系統(tǒng)取得了許多成功的進展，但是要將這種技術(shù)從實驗室引入臨床，并提供有效的診斷能力，還有很長的路要走，因為這些檢測系統(tǒng)是在實驗室條件下開發(fā)出來的，若今后應(yīng)用于與實驗室相比差異較大的環(huán)境時，其效果有待觀察。因此，基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的分子診斷技術(shù)仍然有較大的提升空間。龐大的微生物資源就像一個百寶箱，隨著宏基因組學(xué)和生物信息學(xué)工具的結(jié)合運用，未來將有更多的型或亞型被發(fā)現(xiàn)，這大大擴展了CRISPR工具箱，而各種等溫擴增技術(shù)的不斷改進，也為基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的核酸分子診斷技術(shù)的發(fā)展提供了另一個思路。