HPLC同時(shí)測(cè)定不同品系桂郁金中吉馬酮和呋喃二烯含量

趙應(yīng)學(xué)，王 建，覃乾漢，梁春賢，莫 瑩，賀蘭芝，楊傳強(qiáng)，張 婷，劉喜華

（1.廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院，廣西 南寧 530021；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；3.廣西壯族自治區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局，廣西 南寧 530002；4.廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530021）

桂郁金是廣西道地藥材之一，為臨床常用中藥品種，其來(lái)源為姜黃屬植物廣西莪術(shù)（Curcuma kwang?siensisS.G.Lee et C.F.Liang）的塊根，收載于2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》一部，具有活血止痛、行氣解郁、清心涼血、利膽退黃功效［1］?，F(xiàn)代研究表明，桂郁金主要有效成分為姜黃素類及揮發(fā)油類［2］，其中揮發(fā)油的主要有效成分為吉馬酮、呋喃二烯等倍半萜類化合物［3］，藥理研究表明吉馬酮與呋喃二烯具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗炎等藥理作用［4-5］。近年來(lái)，關(guān)于桂郁金研究主要集中在化學(xué)成分分析、指紋圖譜研究、藥理作用、種質(zhì)資源、炮制工藝等方面［6-16］。廣西莪術(shù)植物可分為兩種藥材，根莖入藥為莪術(shù)，塊根入藥為郁金。目前文獻(xiàn)報(bào)道多為兩種藥材各自研究，尚未見(jiàn)從不同品系原植物同時(shí)篩選兩種藥材優(yōu)良品系的報(bào)道。本課題組選擇以根莖（莪術(shù)）為選育目標(biāo)，結(jié)合植物學(xué)性狀、藥材產(chǎn)量、揮發(fā)油含量篩選出8種廣西莪術(shù)優(yōu)良品系［17-22］，本研究以其塊根（桂郁金）作為研究藥材，通過(guò)測(cè)定桂郁金塊根中揮發(fā)油及吉馬酮、呋喃二烯的含量，對(duì)8種優(yōu)良廣西莪術(shù)品系的塊根（桂郁金）進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，以期從8種優(yōu)良品系中篩選出莪術(shù)（根莖）、桂郁金（塊根）雙優(yōu)的廣西莪術(shù)植物品系，為進(jìn)一步申報(bào)新品種提供技術(shù)支撐，為建立桂郁金質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥材 不同品系桂郁金是本課題組采用系統(tǒng)選育的方法，自2000年起分別在廣西欽州、興業(yè)、靈山、玉林、貴港、桂平、平南、青塘、橫縣、邕寧和金秀等地收集109份廣西莪術(shù)種質(zhì)材料，并建立廣西莪術(shù)種質(zhì)資源圃，統(tǒng)一種植在廣西南寧市仙葫羅村課題藥材基地，以植物學(xué)性狀、藥材性狀、單株產(chǎn)量、揮發(fā)油含量、吉馬酮含量等指標(biāo)選育，至2018年篩選得到廣西莪術(shù)（根莖）8個(gè)優(yōu)良品系：C84（興業(yè)）、C16（欽州）、B97（靈山）、玉8/81（玉林）、玉3/B3（玉林）、玉11/28（玉林）、B72（玉林）、C105（欽州）。本實(shí)驗(yàn)以篩選出的8個(gè)廣西莪術(shù)優(yōu)良品系的根莖（桂郁金）為實(shí)驗(yàn)材料，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)王建教授鑒定為廣西莪術(shù)（Curcuma.kwangsiensisS.G.Lee.et.C.F.Liang），試驗(yàn)藥材于2018年12月下旬采收后，洗凈去泥沙，自然陰干，粉碎成細(xì)粉，并過(guò)40目篩后備用。不同品系桂郁金藥材來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 不同品系桂郁金藥材來(lái)源

1.2 試藥 吉馬酮（純度為99.8%，批號(hào)：111665-201605）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定所；呋喃二烯（純度為99.4%，批號(hào)：111824-201102）購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲醇、乙腈為色譜純，水為純凈水。

1.3 儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀（Agilent Technologies Co.Ltd.）；Sartorius BP2215型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；5 ml輕油型揮發(fā)油測(cè)定器、回流提取裝置（廣西南寧融儀實(shí)驗(yàn)設(shè)備有責(zé)任公司）；TDL-4型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；HDM2000型電熱套（常州國(guó)華電器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油提取與測(cè)定［16］取不同品系桂郁金鮮品適量，切成約3 mm×5 mm大小，稱取100 g置于200 0 ml燒瓶中，加蒸餾水800 ml搖勻混合后，加入沸石，參照2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則揮發(fā)油測(cè)定法［23］，浸泡約20 min后回流提取并保持微沸約7 h，至測(cè)定器中油量不再增加，停止加熱，放置15 min，待靜置分層后讀取揮發(fā)油量體積（ml），記錄揮發(fā)油顏色，并計(jì)算供試品中揮發(fā)油的得油率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同品系桂郁金揮發(fā)油測(cè)定結(jié)果

2.2 色譜條件 色譜柱：20RBXSB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-水，梯度洗脫條件見(jiàn)表3；檢測(cè)波長(zhǎng)：216 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μl。

表3 梯度洗脫條件

2.3 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取吉馬酮、呋喃二烯對(duì)照品適量，置于10 ml容量瓶中，加甲醇制成吉馬酮濃度為889μg/ml、呋喃二烯濃度為933μg/ml的溶液，備用。

2.4 供試品溶液的制備 取本品粉末（過(guò)4號(hào)篩）約2 g，精密稱定，置50 ml錐形瓶中，精密加入甲醇10 ml，搖勻，密塞，超聲提取30 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足重量，作為供試品溶液。

精密吸取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各10μl，按“2.2項(xiàng)”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果供試品溶液中吉馬酮和呋喃二烯兩種有效成分分離良好，相鄰峰無(wú)干擾，見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 混合對(duì)照品溶液HPLC圖譜

圖2 C84桂郁金供試品溶液HPLC圖譜

2.5 線性關(guān)系考察 將“2.3項(xiàng)”下制備的混合對(duì)照品貯備液由高至低逐級(jí)稀釋，制備得系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液：吉馬酮濃度依次為34μg/ml、43.5μg/ml、68μg/ml、85μg/ml、127.5μg/ml、170μg/ml，呋喃二烯濃度依次為40μg/ml、50μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml。精密吸取混合對(duì)照品溶液10μl，注入液相色譜儀，按“2.2項(xiàng)”下色譜條件測(cè)定，分別記錄吉馬酮、呋喃二烯的峰面積，以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4。并計(jì)算出吉馬酮及呋喃二烯的回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表4。

圖3 吉馬酮標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 呋喃二烯標(biāo)準(zhǔn)曲線

表4 吉馬酮與呋喃二烯回歸方程及線性范圍

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10μl，按“2.2項(xiàng)”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以校正因子計(jì)算出吉馬酮RSD=0.92%（n=6），呋喃二烯RSD=1.15%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 定量限檢測(cè) 取吉馬酮對(duì)照品溶液（濃度為2.055μg/ml）10μl注入高效液相色譜儀，計(jì)算出信噪比為2.40；取呋喃二烯對(duì)照品溶液（濃度為0.993 7μg/ml）10μl注入高效液相色譜儀，計(jì)算出信噪比為8.20。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的C105樣品6份，每份各約2 g，置于50 ml塞錐形瓶中，分別加入混合對(duì)照品溶液（吉馬酮濃度為1.392 mg/ml、呋喃二烯濃度為1.571 mg/ml）0.75 ml、0.75 ml、0.50 ml、0.50 ml、0.25 ml、0.25 ml，精密加入甲醇使總體積為10 ml，余下操作同“2.4項(xiàng)”，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表5、表6。

表5 吉馬酮加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 （n=6）

表6 呋喃二烯加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 （n=6）

2.9 樣品測(cè)定 取8個(gè)樣品按“2.4項(xiàng)”方法制備成供試品溶液，分別精密吸取各供試品溶液10μl，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算吉馬酮、呋喃二烯的含量。結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 吉馬酮、呋喃二烯含量測(cè)定結(jié)果（n=8）

3 討論

3.1 不同品系桂郁金揮發(fā)油含量比較 不同品系桂郁金揮發(fā)油含量在0.07%~0.21%之間，揮發(fā)油含量平均值為（0.13±0.04）%，RSD為3.96%。其中提取得到揮發(fā)油含量較高的是玉8/81，達(dá)到0.21%；較低的為C84，揮發(fā)油含量?jī)H為0.07%，可見(jiàn)不同品系廣西莪術(shù)揮發(fā)油含量存在較大差異。

3.2 不同品系桂郁金吉馬酮、呋喃二烯含量比較 不同品系桂郁金中吉馬酮的含量在0.364 2～1.055 6 mg/g之間，其中吉馬酮含量最高為C84，達(dá)到1.055 6 mg/g；含量最低為C105，含量為0.364 2 mg/g；平均值為（0.634 2±0.220 8）mg/g，RSD為23.61%。呋喃二烯的含量在0.417 3～1.168 7 mg/g之間，其中呋喃二烯含量最高為C84，達(dá)到1.168 7 mg/g；含量最低是C105，含量為0.417 3 mg/g；平均值為（0.744 7±0.258 4）mg/g，RSD為27.63%。可見(jiàn)不同品系桂郁金吉馬酮、呋喃二烯含量差異較大。兩者含量由高到低排序均為C84>C16>B97>玉8/81>玉3/B3>玉11/28>B72>C105，表明同一品系吉馬酮含量較高者其呋喃二烯含量也較高，反之，吉馬酮含量較低者其呋喃二烯含量也較低。

3.3 小結(jié) 本研究通過(guò)測(cè)定揮發(fā)油及吉馬酮、呋喃二烯含量，以評(píng)價(jià)8種優(yōu)良廣西莪術(shù)品系塊根桂郁金的質(zhì)量，同時(shí)也建立桂郁金中呋喃二烯的含量測(cè)定方法，結(jié)果表明雙優(yōu)品系以C84和C16質(zhì)量為優(yōu)，該成果將進(jìn)一步申請(qǐng)新品種在道地產(chǎn)區(qū)進(jìn)行推廣，同時(shí)也為桂郁金新品選育及建立桂郁金質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。由于本研究所選的8個(gè)不同品系桂郁金是在種植管理?xiàng)l件一致情況下，經(jīng)過(guò)多年不斷種植選育形成的穩(wěn)定品系，因此實(shí)驗(yàn)藥材在揮發(fā)油、吉馬酮和呋喃二烯含量所表現(xiàn)出的差異，實(shí)則為桂郁金的種內(nèi)差異，此差異由基因決定，要揭示差異的真正原因，還應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步的分子標(biāo)記研究，如SSR（simple sequence re‐peat）或ISSR（inter-simple sequence repeat）。另外，吉馬酮與呋喃二烯均為廣西莪術(shù)植物在生長(zhǎng)過(guò)程中形成的次生代謝產(chǎn)物，二者均為倍半萜類化合物，可見(jiàn)同一品系桂郁金中吉馬酮與呋喃二烯存在一定相關(guān)性，這種相關(guān)性是否與基因組有關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。