春蘭根狀莖緩慢生長保存和包埋保存

付雙彬 楊燕萍 應(yīng)震 周莊

摘 ?要：以春蘭根狀莖為材料，研究培養(yǎng)基中不同MS鹽含量、蔗糖濃度、甘露醇濃度及矮壯素（chlormequat chloride， CCC）濃度對根狀莖緩慢生長保存的影響;研究不同濃度海藻酸鈉（sodium alginate， SA）和氯化鈣（calcium chloride， CC）對于根狀莖包埋珠合格率和萌發(fā)率的影響，并以此為基礎(chǔ)研究春蘭根狀莖的包埋保存。結(jié)果表明：根狀莖在MS+10.0 g/L蔗糖+10.0 g/L甘露醇+7.5 g/L瓊脂+1.0 g/L活性炭和MS+20.0 g/L蔗糖+7.5 g/L瓊脂+1.0 g/L活性炭的培養(yǎng)基上保存，12個月后存活率達(dá)84.00%。利用3.5%（W/V）的SA，75.0 mmol/L CC制成的根狀莖包埋珠合格率和萌發(fā)率達(dá)97.60%和92.00%。合格的包埋珠在4?℃下保存180?d，萌發(fā)率和再生率最高，分別為68.00%和64.00%。本研究的結(jié)果可為春蘭等國蘭的種質(zhì)資源保存和種苗生產(chǎn)提供理論和技術(shù)指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：春蘭;根狀莖;緩慢生長保存;包埋保存

Abstract： Rhizomes of Cymbidium goeringii were used as the materials， the effects of different MS salt content， and the concentration of sucrose， mannitol and chlormequat chloride added in the medium were studied. The effects of different concentration of sodium alginate and calcium chloride on the qualification rate and germination rate of encapsulated rhizomes were studied. The results showed that the survival rates of rhizomes stored on MS medium containing 10.0 g/L sucrose + 10.0 g/L mannitol + 7.5 g/L agar + 1.0 g/L activated charcoal and MS medium containing 20.0 g/L sucrose + 7.5 g/L agar + 1.0 g/L activated charcoal was 84.00% after 12 months. The qualification rate and germination rate of rhizome capsules produced by using 3.5% （W/V） sodium alginate， 75.00 mmol/L calcium chloride was 97.60% and 92.00%， respectively. The qualified capsules were stored at 4?℃ for 180 d， the germination and conversion rate were the highest， 68.00% and 64.00%， respectively. The results could provide a theoretical and technical guidance for the conservation of germplasm resources and seedlings production of Cymbidium goeringii and other Chinese orchids.

Keywords： Cymbidium goeringii; rhizomes; slow growth storage; encapsulation storage

春蘭（Cymbidium goeringii）為蘭科（Orchidaceae）蘭屬（Cymbidium）地生蘭，是國蘭家族中的主要類群之一，由于其俊美的外形和幽雅的香氣深得亞洲人民的喜愛[1]。近年來，由于蘭花的商業(yè)價值不斷升高，導(dǎo)致野生資源盜采盜挖不斷猖獗，重要的資源不斷流失;加之蘭科植物資源龐大，實地保護(hù)存在困難等，尋找有效的離體保存方法便變得十分迫切[2]。然而，參考其他蘭科植物的離體保存，春蘭的離體保存面臨2個問題：（1）與其他蘭科植物如洋蘭等相比，春蘭原球莖較小，并在培養(yǎng)基中很快發(fā)育成特定的器官，稱為根狀莖，并會在此階段保持?jǐn)?shù)年[3]，這就使得國蘭的離體保存不能單純地參考應(yīng)用現(xiàn)今大多數(shù)蘭利用原球莖保存的方法;（2）對于種質(zhì)資源的離體保存，超低溫保存是目前最優(yōu)的選擇，但該方法開發(fā)有一定難度，距離廣泛使用還存在一定差距[4]。因此，需要另行尋找合適的方法。

近年來，蝴蝶蘭[5]、大花蕙蘭[6]等蘭科植物利用原球莖或試管苗進(jìn)行了緩慢生長保存研究并取得成功;而包埋保存的方法在萬珠蘭和萬代蘭雜交種[7]、石斛蘭[8]等中已得到有效應(yīng)用。雖然緩慢生長保存和包埋保存在保存時間上較超低溫保存要短，但由于操作簡便，材料易恢復(fù)生長等仍有應(yīng)用空間[4， 7]。因此，本試驗以春蘭根狀莖為材料，通過調(diào)整MS培養(yǎng)基無機(jī)鹽含量、調(diào)整蔗糖含量、添加甘露醇、添加生長抑制物矮壯素的方法對其緩慢生長保存進(jìn)行研究;通過調(diào)整海藻酸鈉濃度和氯化鈣濃度對其進(jìn)行根狀莖包埋研究及后續(xù)的保存研究，以期通過研究這2種方法為春蘭等國蘭的種質(zhì)保存提供借鑒。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

選用春蘭種子無菌播種產(chǎn)生的根狀莖作為材料，實驗室現(xiàn)存，已增殖繼代3年。

1.2 ?方法

1.2.1 ?調(diào)整添加培養(yǎng)基不同組分對春蘭根狀莖緩慢生長保存的影響 ?選用MS[9]為基本培養(yǎng)基，添加20.0 g/L蔗糖、7.5 g/L瓊脂和1.0 g/L活性炭，而不添加植物激素，并選用此組合作為對照。在此培養(yǎng)基基礎(chǔ)上調(diào)整蔗糖含量為0、10.0、40.0、60.0、80.0 g/L;調(diào)整MS鹽為1/2、1/4、1/6、1/8、1/10、0 MS;以逐步替換蔗糖的方式添加甘露醇，為蔗糖/甘露醇15.0/5.0、10.0/10.0、5.0/15.0、0.0/20.0 g/L;添加10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 mg/L CCC。調(diào)整單個成分時其他組分不變，4組做單因素試驗。各培養(yǎng)基在調(diào)pH至5.8后滅菌。接種時取大小、狀態(tài)一致的根狀莖，每段切成約1.0 cm，每處理接種10瓶，每瓶5段，共50段接入培養(yǎng)基內(nèi)，重復(fù)5次。在溫度25?℃，光照時間12 h/d條件下培養(yǎng)，保存12個月，每3個月觀察根狀莖存活狀況，統(tǒng)計根狀莖存活率。

保存12個月恢復(fù)生長時轉(zhuǎn)入MS+4.0 mg/L NAA+20.0 g/L蔗糖+7.5 g/L瓊脂+1.0 g/L活性炭的恢復(fù)培養(yǎng)基中，再生培養(yǎng)基為MS+3.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+30.0 g/L蔗糖+7.5 g/L瓊脂+ 10.0%（V/V）椰汁。

存活率=存活的根狀莖數(shù)/根狀莖接種數(shù)× 100%

再生率=能分化再生根狀莖數(shù)/根狀莖接種數(shù)× 100%

1.2.2 ?春蘭根狀莖包埋及保存 ?制備3.0、3.5或4.0 %（W/V）的SA，用添加20.0 g/L蔗糖的液體MS（不含CaCl2·2H2O）培養(yǎng)基溶解，制備50.0、75.0、100.0 mmol/L CC（用CaCl2·2H2O試劑配制）溶液，SA濃度、CC濃度二者做3×3的完全隨機(jī)試驗設(shè)計。上述溶液配制好后，調(diào)pH至5.8后滅菌。包埋時先將春蘭根狀莖切成0.3 cm左右，而后混合在SA溶液中并使用鑷子將混合物輕輕滴入CC溶液中來完成包埋，每個包埋珠內(nèi)含有一個根狀莖，反應(yīng)20 min后，將含根狀莖的包埋珠在無菌蒸餾水中沖洗2～3次，以去除多余的CC，然后放在無菌濾紙上干燥，之后隨機(jī)取出50粒，統(tǒng)計合格率，試驗重復(fù)5次。而后取各處理合格包埋珠50粒（每瓶10粒）轉(zhuǎn)入上述恢復(fù)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，試驗重復(fù)5次，1個月后統(tǒng)計萌發(fā)率。

對于包埋后保存，設(shè)置以下4組試驗：（1）未包埋的根狀莖放入1.8?mL冷凍管，室溫25?℃條件下黑暗保存;（2）包埋的根狀莖放入冷凍管，室溫25?℃條件下黑暗保存;（3）未包埋的根狀莖放入冷凍管，放入4?℃冰箱內(nèi)黑暗保存;（4）包埋的根狀莖放入冷凍管，4?℃下黑暗保存。每個冷凍管中各放置5個供試材料，在30、60、90、120、150、180 d時每處理取出冷凍管2管，將供試材料取出轉(zhuǎn)入上述恢復(fù)培養(yǎng)基中進(jìn)行恢復(fù)生長并統(tǒng)計萌發(fā)率和萌發(fā)所需時間，試驗重復(fù)5次。待萌發(fā)率統(tǒng)計過后，將萌發(fā)出的根狀莖切下轉(zhuǎn)入上述再生培養(yǎng)基中進(jìn)行再生培養(yǎng)，并統(tǒng)計再生率。

合格率=合格的包埋珠數(shù)/總的50粒包埋珠×100%（合格與否主要取決于根狀莖是否被覆蓋，包埋珠是否堅固，透明，等徑）

萌發(fā)率=包埋珠萌發(fā)數(shù)/總的50粒（合格）包埋珠×100%（萌發(fā)指未包埋根狀莖長出新根狀莖或包埋珠內(nèi)根狀莖伸出包埋珠約1.0 cm）

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用Origin Pro 2020b（Learning Edition， Origin Lab， USA）軟件繪圖，數(shù)據(jù)用平均值加標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 22.0軟件進(jìn)行方差分析和Duncuns法作多重比較。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?調(diào)整培養(yǎng)基不同組分對春蘭根狀莖緩慢生長保存的影響

如圖1A所示，0～3月，在含0、80 g/L蔗糖的培養(yǎng)基中保存的根狀莖存活率下降趨勢較明顯，而在6～9月，則以在含10、20 g/L蔗糖的培養(yǎng)基中下降明顯，在其他許多處理中也有同樣的現(xiàn)象（圖1C、圖1D）;9個月后，所有處理根狀莖存活率開始保持較穩(wěn)定的水平，12個月后存活率最高的為對照組，為84.00%，但與其他5組差異不顯著。從圖1B可以看出，在含1/2、1/4、1/6、1/8 MS的培養(yǎng)基中保存的根狀莖存活率下降趨勢較平穩(wěn)，而在1/10、0 MS中下降較為迅速，12個月后，0?MS培養(yǎng)基中根狀莖存活率已下降到12.40%，而存活率最高為1/8?MS，為82.40%，與1/2、1/4、1/6?MS差異不顯著。從圖1C可以看出，在蔗糖/甘露醇0/20 g/L培養(yǎng)基中保存的根狀莖呈現(xiàn)獨(dú)立的下降趨勢，而其他處理呈現(xiàn)相同下降趨勢，12個月后，以在蔗糖/甘露醇10/10 g/L培養(yǎng)基中保存的根狀莖存活率最高，為84.00%，與蔗糖/甘露醇15/5、5/15?g/L差異不顯著。從圖1D可以看出，5組處理均呈相同下降趨勢，最終以含CCC10、20?mg/L的培養(yǎng)基中存活率最高，為83.60%，但5個處理間差異不顯著。綜合來看，多數(shù)處理在6個月后有較大幅度下降，此后趨于穩(wěn)定，保存12個月后，以在對照組、蔗糖/甘露醇10/10 g/L培養(yǎng)基中保存的根狀莖存活率均值最大，為84.00%，并且存活的根狀莖均能再生（圖1A）。

2.2 ?春蘭根狀莖包埋

如表1中所示，隨著SA濃度和CC濃度的增加，合格率呈逐漸增加的態(tài)勢，其中3.5～4.0%的SA和50.0～100.0 mmol/L的CC均可產(chǎn)生大量合格包埋珠（圖2B），而3.0%的SA和50.0～ 75.0?mmol/L的CC反應(yīng)，大多數(shù)包埋珠形成不規(guī)則的形狀（圖2C、D、E、F）。其中以3.5%的SA和75.0 mmol/L CC、4.0%的SA和75.0～100.0?mmol/L CC組合的合格率最高，為97.60%，而與3.5%的SA和100.0 mmol/L CC的組合差異不顯著。相比于合格率，萌發(fā)率則成相反的趨勢，SA濃度和CC濃度高，萌發(fā)率則偏低。SA（4.0%）和CC（75.00～100.00 mmol/L）濃度過高，大多數(shù)包埋珠變的過于堅硬，導(dǎo)致萌發(fā)率下降到90%以下。

A：再生培養(yǎng)基中的再生植株;B：經(jīng)過清洗的大量合格包埋珠;C、D、E、F：一些不合格的包埋珠;G：60 d后從包埋珠中萌發(fā)的新生根狀莖;H：在不含MS鹽的培養(yǎng)基上褪色變黃的根狀莖;I：在不含蔗糖的培養(yǎng)基上幾乎無生長的根狀莖;J：未保存前的根狀莖;K、L、M：在含有10、20、30 mg/L CCC的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的根狀莖;N：在4?℃和25?℃下保存的包埋珠，白色的根狀莖用紅色箭頭標(biāo)記。

以合格率優(yōu)先，綜合萌發(fā)率來看，以3.5%的SA和75.0 mmol/L CC的組合春蘭根狀莖包埋珠合格率和萌發(fā)率均值最大，分別為97.60%和92.00%（圖2G），與3.5%的SA和100.0 mmol/L CC的組合差異不顯著。

2.3 ?春蘭根狀莖包埋后保存

在180?d的保存時間里，隨著保存時間的增加，所有處理萌發(fā)天數(shù)也隨之延長，萌發(fā)率和再生率則逐漸下降，但4組之間的差異顯著（圖3）。25?℃未包埋根狀莖隨著保存時間的延長，一些根狀莖逐漸死亡，導(dǎo)致萌發(fā)率和再生率逐漸降低，直到120 d全部死亡（圖3B）。而包埋根狀莖在25?℃保存，180 d后仍有存活，最終萌發(fā)率為56.00%，再生率稍有下降，為44.00%（圖3B、C）。根狀莖直接暴露于4?℃，根狀莖在低溫下比在室溫下可以保存稍長的時間，但150?d后仍全部死亡（圖3B）。包埋根狀莖在4?℃下保存，180 d后仍有存活，但萌發(fā)時間也最長。然而，在此溫度下保存的包埋根狀莖180?d后萌發(fā)率和再生率最高，分別為68.00%和64.00%。

3 ?討論

離體保存的植物材料在保存過程中生長、存活所需的營養(yǎng)主要依賴于培養(yǎng)基的供給，因此，通過降低培養(yǎng)基內(nèi)的養(yǎng)分和水平，可以抑制組織的生長，從而達(dá)到中長期保存植物材料的效果[4]。如菠蘿試管苗在MS、1/4 MS、無菌水3種培養(yǎng)基中保存1 a后，以1/4 MS培養(yǎng)基中保存效果最好，所用材料均能存活和再生[10];香青蘭試管苗在1/4 MS培養(yǎng)基中前期存活率較低，但保存時間卻延長了4個月以上[11]。春蘭根狀莖在1/2～1/8 MS鹽的培養(yǎng)基中保存都能保持較穩(wěn)定的存活率，但不同小寫字母表示0.05水平差異顯著;NA表示不存在。

在不含MS鹽的培養(yǎng)基上，根狀莖綠色逐漸褪去，呈枯黃色狀態(tài)（圖2H），存活率和再生率也有顯著的下降，這表明MS鹽對于其存活是必須的。文心蘭試管苗保存時，向培養(yǎng)中添加30.0 g/L甘露醇能夠有效延長文心蘭試管苗繼代間隔時間，保存12個月的存活率達(dá)80.00%[12]。紅根草試管苗在無糖的培養(yǎng)基上植株形態(tài)和色澤差較差，但保存時間更長，繼代后恢復(fù)正常[13]。前者主要是由于添加甘露醇或高濃度蔗糖增加了細(xì)胞的滲透勢，使水分和養(yǎng)分吸收受阻，減少了營養(yǎng)消耗，從而提高了存活率[14];而后者是除去蔗糖這一重要的碳源，達(dá)到降低營養(yǎng)供給的效果。將春蘭根狀莖接種在不含蔗糖的培養(yǎng)基中，根狀莖生長受到明顯抑制，新生根狀莖少且短（圖2I），但存活率和再生率與其他處理無顯著差異，是可行的方法。采用添加甘露醇的方法，當(dāng)培養(yǎng)基中的蔗糖全部替換為甘露醇時，與其他三者相比存活率和再生率有顯著下降，這表明此時的滲透壓已對根狀莖生長和存活造成不利影響，對比不含蔗糖培養(yǎng)基中根狀莖的生長狀況，在不添加蔗糖的同時減少甘露醇的含量或許能起到更好的效果。

在配制的緩慢生長保存培養(yǎng)基中，除1/10～ 0?MS和添加20?g/L甘露醇的培養(yǎng)基外，其他培養(yǎng)基都能起到很好的保存效果，這其中也包括對照培養(yǎng)基，這與培養(yǎng)基中不添加植物激素，減少其生長有一定的關(guān)系，同理，向培養(yǎng)基中添加生長抑制物，利用激素來延緩和抑制生長。CCC是一種廣譜高效低毒的植物生長延緩劑，可抑制作物細(xì)胞伸長，但不抑制細(xì)胞分裂，能使植株變矮，桿莖變粗，抗逆性增強(qiáng)，被作為延緩劑廣泛應(yīng)用于種質(zhì)保存中[12， 15]。如馬鈴薯離體試管苗的保存時，相較于脫落酸（ABA）和丁酰肼（B9）等，CCC抑制作用最明顯，且合理濃度的矮壯素兼具增加馬鈴薯試管苗的葉片數(shù)，加粗莖段以及增多根系的作用[16]。根狀莖在添加有CCC的培養(yǎng)基中，一個顯著的特點(diǎn)是根毛的增多（圖2J、K、L、M），這也一定程度上印證了CCC的作用特點(diǎn)。

在許多研究中發(fā)現(xiàn)，3.0%的SA溶液最適合包埋珠的制作以及后續(xù)供試材料的萌發(fā)，而高于此濃度的SA往往使得包埋珠過于堅硬，導(dǎo)致萌發(fā)率的顯著下降[17-18]。然而，在本研究中，較高濃度的SA（3.5%）是可行的，除了能保證萌發(fā)率外，較高濃度的SA也有助于包埋珠的制作，這是因為大多數(shù)包埋珠的制作過程通常是通過將外植體混合到SA溶液中，然后用移液管等儀器將混合物滴入CC溶液來實現(xiàn)[19-22]，而高濃度的SA使得溶液具有更高粘性，根狀莖很容易被覆蓋，從而使用鑷子就可完成包埋過程，簡化了步驟。

與SA一樣，CC濃度對于合格包埋珠的形成和萌發(fā)也十分重要（經(jīng)方差分析，二者對于春蘭根狀莖包埋珠合格率和萌發(fā)率影響均顯著，數(shù)據(jù)未列出）。然而，不同于3%濃度的SA被廣泛使用，CC的濃度（多為50.0～100.0 mmol/L）與不同的外植體類型相關(guān)[23]。如在石斛蘭中，3.0%的SA和75.0 mmol/L的CC制成的類原球莖包埋珠萌發(fā)率為100%[8]，在萬珠蘭和萬代蘭雜種類原球莖包埋中同樣以此濃度為最優(yōu)[7];但在印度娃兒藤中，其體胚的包埋則以50.0 mmol/L的CC為最優(yōu)[24]。

與保存在4?℃的包埋珠相比，保存在25?℃的包埋珠大多存在根狀莖自然萌發(fā)的現(xiàn)象，露出的根狀莖在1～2個月后褪色（圖2N），導(dǎo)致其完整性受損。而在低溫下，外植體代謝活動受到抑制，以一種近乎靜止的狀態(tài)進(jìn)行，可能更適合于外植體的保存[4， 25]。在貝母蘭中，在4?℃下保存60 d，包埋的類原球莖沒有顯示出萌發(fā)率的快速下降，25?℃室溫下稍差;而未包埋的類原球莖15 d即全部死亡，在室溫下也同樣如此[25]。然而，并非所有包埋保存的材料都適宜在4?℃下保存，包埋保存的溫度主要取決于物種，如萬珠蘭和萬代蘭雜種類原球莖包埋珠、羅勒莖尖包埋珠等則在25?℃室溫下保存更好[7， 26]。

4 ?結(jié)論

本研究以春蘭根狀莖為材料，利用緩慢生長保存和包埋保存的方法，對其進(jìn)行了保存研究。結(jié)果表明，春蘭根狀莖在MS+10.0 g/L蔗糖+10.0?g/L甘露醇+7.5 g/L瓊脂+1.0 g/L活性炭和MS+20.0 g/L蔗糖+7.5 g/L瓊脂+1.0 g/L活性炭的培養(yǎng)基上保存12個月后，根狀莖存活率最高，達(dá)84.00%，并且存活的根狀莖均能再生。從經(jīng)濟(jì)層面考慮，在實際生產(chǎn)中建議將原培養(yǎng)基減少或去除激素，以達(dá)到減少繼代次數(shù)降低成本的目的。利用3.5%（w/v）的SA，75.0 mmol/L CC制成的根狀莖包埋珠合格率和萌發(fā)率達(dá)97.60%和92.00%。合格的包埋珠在4?℃下保存180 d，萌發(fā)率和再生率最高，分別為68.00%和64.00%。此方法不需要過多復(fù)雜的操作、添置昂貴的設(shè)備及材料，并且便于處理和運(yùn)輸，在所述2種方法中可作為春蘭根狀莖保存的首選方法。

由于隨保存時間延長瓶內(nèi)培養(yǎng)基干涸的問題，緩慢生長保存中根狀莖存活情況并未統(tǒng)計更長的時間，這個問題可能需要更多數(shù)量的處理和重復(fù)試驗來解決。此外，保存后的遺傳穩(wěn)定性也需要分子試驗來進(jìn)一步驗證。

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