多花指甲蘭花粉活力及柱頭可授性研究

王清蕓 侯天澤 徐詩(shī)濤 余文剛 邢孔惠 王健

摘 ?要：花粉和柱頭特性的研究是蘭花雜交育種的重要基礎(chǔ)。本研究以多花指甲蘭（Aerides rosea）為實(shí)驗(yàn)材料，利用掃描電子顯微鏡觀察多花指甲不同開(kāi)花時(shí)期的花粉微觀形態(tài)用TTC（氯化三苯基四氮唑）、I2-KI和醋酸洋紅染液并結(jié)合花粉離體培養(yǎng)檢測(cè)不同開(kāi)花時(shí)期的花粉活力，利用聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫法測(cè)定柱頭的可授性。結(jié)果表明， 多花指甲蘭花粉隨著開(kāi)花時(shí)間的延長(zhǎng)，花粉表面顏色變深，質(zhì)地更硬，花粉粒結(jié)合更加緊密，花粉團(tuán)體積變小，表面變得更加平滑致密。 多花指甲蘭花蕾期花粉染色為粉紅色，盛花期的花粉染色最明顯，染色率最高，而衰敗期的花粉幾乎無(wú)法被染色，在整個(gè)開(kāi)花過(guò)程中，花粉活力呈先上升后下降的趨勢(shì)。柱頭可授性的結(jié)果顯示，盛花期柱頭氣泡最多最迅速，可授性最強(qiáng)。該研究結(jié)果為多花指甲蘭的引種栽培、遷地保護(hù)提供理論基礎(chǔ)，在花卉資源利用和產(chǎn)業(yè)發(fā)展上具有重要指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞：多花指甲蘭（Aerides rosea ）;花粉形態(tài);花粉活力;柱頭可授性

Abstract： The study on the characteri stics of pollen and stigma is an important basis for orchid cross breeding. In this study， Aerides rosea was used as the experimental materi al to observe the micro-morphol ogy of pollen at different flowering stages by scanning electron microscope. The pollen viabil ity at different flowering stages was detected by TTC （triphenyltetrazolium chloride）， I2-KI and magenta acetate staining solution combined with pollen culture in vitro， and benzidine-hydrogen peroxide method was used to determine the receptivity of stigma. The resul ts showed that with the extension of flowering time， the surface col or of A. rosea pollen became darker， the texture became harder， the pollen grains combined more closely， the pollen mass became smaller， and the surface became smoother and denser. A.s rosea pollen staining was pink in the bud stage， the pollen staining in the full flowering stage was the most obvious， and the staining rate was the highest， while the pollen in the decline stage could hardly be stained. In the whole flowering process， the pollen viabili ty increased at first and then decreased. The resul ts of stigma receptivity showed that the stigma bubbles were the most rapid and the receptivity was the strongest at flowering stage. The results of ?this study would provide a theoretical basis for the introduction， cultivation and ex-situ protecti on of A. rosea， and have important guiding signi ficance in the util ization of flower resources and industrial development.

Keywords： Aerides rosea; pollen morphology; pollen vitality; stigma receptivity

多花指甲蘭（Aerides rosea）為蘭科（Orchidaceae）指甲蘭屬附生草本植物，花型奇特，狀似“狐尾”，花序密集，花大部白色，稍有紫色點(diǎn)綴其間，觀賞價(jià)值高[1]。更重要的是，多花指甲蘭極具芳香，獨(dú)特的芳香性狀也是多花指甲蘭的重要價(jià)值之一。其含有醛類、芳香族類、酯類、酮類以及萜類化合物等多種揮發(fā)性物質(zhì)，可廣泛應(yīng)用于化妝品、美容等行業(yè)[2]，近年，一家日本公司公布了其香水專利，構(gòu)成其產(chǎn)品成分的一種主要香味物質(zhì)便來(lái)自于此[3]。同時(shí)，多花指甲蘭也是重要的藥用蘭花，在印度東北部當(dāng)?shù)夭柯渚用裼惺褂弥讣滋m屬植物治療常見(jiàn)疾病的習(xí)俗，孟加拉國(guó)和泰國(guó)也有相關(guān)報(bào)道[4]，國(guó)內(nèi)研究人員也發(fā)現(xiàn)指甲蘭屬植物有作為抗癌藥物潛能[5]。多花指甲蘭不僅擁有花型、花色和香味等眾多優(yōu)良性狀，是不可多得的優(yōu)秀親本資源[6]，而且在醫(yī)藥業(yè)、化工業(yè)也廣泛運(yùn)用，具有重大開(kāi)發(fā)潛能。多花指甲蘭常附生于喬木上，由于過(guò)度的資源開(kāi)采、旅游開(kāi)發(fā)等生態(tài)破壞行為，以及對(duì)其附生樹(shù)種的亂砍濫伐、野生植物非法貿(mào)易，導(dǎo)致多花指甲蘭野生種群的生存面臨極大威脅。CITES（《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》）將指甲蘭屬的所有種列入其附錄Ⅱ的保護(hù)對(duì)象。我國(guó)也將其列入國(guó)家重點(diǎn)野生植物保護(hù)名錄（第二批次）。我們應(yīng)積極對(duì)其采取相關(guān)保護(hù)措施[6]。但由于種質(zhì)資源匱乏等原因，國(guó)內(nèi)目前較少見(jiàn)到多花指甲蘭的相關(guān)報(bào)道，花粉形態(tài)觀察和花粉活力測(cè)定以及柱頭可授性更是鮮有報(bào)道，還有極大的挖掘空間。

花粉和柱頭具有較高的活性是雜交育種成功的關(guān)鍵，目前，國(guó)內(nèi)外主要使用花粉染色法和花粉離體培養(yǎng)測(cè)定花粉活力。常見(jiàn)染色方法有醋酸洋紅染色法、I2-IK染色法和TTC染色法。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，最符合真實(shí)值的方法為TTC染色法[7-9];而花粉離體培養(yǎng)是最能反映真實(shí)值的方法[10]。柱頭可授性均利用聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫法測(cè)定[11]。當(dāng)前，僅有少數(shù)研究人員以市場(chǎng)上常見(jiàn)的幾種蘭花為材料進(jìn)行了花粉形態(tài)、花粉活性以及柱頭可授性的研究。褚怡等[11]研究了大花蕙蘭和幾種國(guó)蘭的花粉活力和柱頭可授性，喻蘭等[12]對(duì)蝴蝶蘭的花粉活力和柱頭可授性進(jìn)行了測(cè)定。羅遠(yuǎn)華等[13]以20個(gè)文心蘭種質(zhì)為材料，對(duì)花粉活力進(jìn)行測(cè)定。這些研究明確了各材料最佳的授粉時(shí)機(jī)，為蘭花的雜交育種、引種栽培提供了理論指導(dǎo)。本文在前人的基礎(chǔ)上對(duì)多花指甲蘭的花粉形態(tài)、花粉活力以及柱頭可授性開(kāi)展研究，以期為多花指甲蘭的雜交引入、遷地保護(hù)以及后續(xù)的應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供理論指導(dǎo)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

材料來(lái)源于云南省瀾滄縣（99°29′?E～ 100°35′?E、22°01′?N～23°16′?N之間），為野生種，目前種植于海南大學(xué)育苗基地（20°03′?N，110°19′?E）。使用試劑為氯化三苯基四氮唑（TTC）、I2-KI以及醋酸洋紅染液。試驗(yàn)器材為鑷子、解剖針、解剖刀、蓋玻片、載玻片、10?mL離心管、恒溫培養(yǎng)箱、光學(xué)顯微鏡（BA210-T）等。

1.2 ?方法

1.2.1 ?多花指甲蘭花粉電鏡掃描 ?采集花蕾期、盛花期、衰敗期的多花指甲蘭花粉（圖1），經(jīng)離子濺射儀噴金后，置于場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡下觀察（S-4800）。選取各時(shí)期花粉在30×、100×、500×的視野下觀察并對(duì)各開(kāi)花時(shí)期花粉塊的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行拍照記錄。

1.2.2 ?花粉活力染色測(cè)定 ?結(jié)合胡適宜[14]與羅遠(yuǎn)華等[13]的方法，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，具體為用pH為7.2～7.4的10 × 0. 01?mol/L磷酸緩沖液配成0.5%的TTC溶液、I2-KI以及醋酸洋紅染液取不同開(kāi)花時(shí)期新鮮花粉團(tuán)，將花粉搗碎于載玻片上，用鑷子與解剖針使之充分分散，然后滴加適量新鮮配制的TTC染色液、I2-KI以及醋酸洋紅染液，蓋上蓋玻片，用錫箔紙包裹黑暗處理置于35?℃恒溫箱中。24?h后在光學(xué)顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)花粉活力，每張片子隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野的染色率，染成紅色的為活力強(qiáng)的花粉，淡紅色為活力弱的花粉，無(wú)活力或不育的花粉無(wú)法被染色。

1.2.3 ?花粉離體萌發(fā) ?以錢鑫等[15]、郭麗霞等[16]的研究為基礎(chǔ)對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，最適培養(yǎng)基為：20%蔗糖+20?mg/L硼酸+ 10?mg/L?CaCl2，在25?℃恒溫中暗培養(yǎng)48?h之后于光學(xué)顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)情況，以花粉管長(zhǎng)度超過(guò)花粉粒直徑的2倍為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，并選擇3個(gè)視 野進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.4 ?柱頭可授性檢測(cè) ?用聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫法測(cè)定多花指甲蘭柱頭活性。聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫反應(yīng)液用1%聯(lián)苯胺∶3%過(guò)氧化氫∶水=4∶11∶22配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。取不同開(kāi)花時(shí)期的新鮮雌蕊柱頭，放入培養(yǎng)皿中，加入檢測(cè)液使之沒(méi)過(guò)柱頭，反應(yīng)10 min。在體視顯微鏡下觀察氣泡產(chǎn)生情況以及柱頭變色情況。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Microsoft office 2010及GraphPad Prism 8分析軟件進(jìn)行分析作圖。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?多花指甲蘭花粉電鏡掃描結(jié)果

與其他形態(tài)和生理特征相比，花粉形態(tài)保持相對(duì)穩(wěn)定，因此花粉形態(tài)可以作為更好的分類和系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記[14-15]。多花指甲蘭花粉團(tuán)附著于有柄的粘盤(pán)上，花粉呈黃色，蠟質(zhì)，2個(gè)。在掃描電鏡下可以清晰的觀察到每個(gè)具半裂的裂隙，表面稍有凹陷，無(wú)紋飾，近球形（圖2A），粘盤(pán)柄狹長(zhǎng)，粘盤(pán)較寬（圖3A）。每個(gè)花粉團(tuán)均由大量形狀不規(guī)則花粉粒通過(guò)類脂質(zhì)粘合而成。由圖2～圖4和表1可知，隨著開(kāi)花時(shí)間延長(zhǎng)，花粉粒皺縮，體積變小，整個(gè)花粉團(tuán)體積也相應(yīng)變小，花粉團(tuán)表面變得更加緊密平滑。尤其是開(kāi)花10?d后時(shí)，即衰敗期，花粉粒表面致密平滑。

2.2 ?不同開(kāi)花時(shí)期花粉的活力測(cè)定

研究發(fā)現(xiàn)，多花指甲蘭最佳染色時(shí)長(zhǎng)為12?h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TTC染色液和醋酸洋紅染色效果最接近離體萌發(fā)結(jié)果，而I2-KI染液會(huì)使整個(gè)視野變紅，不利于觀測(cè);開(kāi)花4～6?d的花粉染色效果最好，顏色最深，染色率最高（圖5），花蕾期染色較淺，呈粉紅色，且染色數(shù)目較少，開(kāi)花10?d的花粉幾乎無(wú)法染色，染色極淺。整個(gè)花期花粉活力先上升到達(dá)最高值，之后下降，呈先升后降趨勢(shì)。

2.3 ?不同開(kāi)花時(shí)期柱頭可授性研究結(jié)果

利用聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫法測(cè)定多花指甲蘭柱頭可授性（表2），結(jié)果顯示3個(gè)時(shí)期的柱頭在檢測(cè)液中均冒出氣泡，其中盛花期過(guò)氧化氫酶含量最高，氣泡量最大，冒出最迅速，可授性最強(qiáng)?；ɡ倨诖沃?衰敗期最少最緩慢，可授性最弱;但3個(gè)時(shí)期的柱頭均未變色。

3 ?討論

花粉為植物的生殖細(xì)胞，它能反映物種演化的一般規(guī)律，花粉的性狀相對(duì)穩(wěn)定，其微觀態(tài)結(jié)構(gòu)具有種間特異性，是植物分類的重要依據(jù)之一[17-20]。

蘭科植物花粉不同于其他植物，蘭科植物花粉由成千上萬(wàn)的花粉粒通過(guò)類脂質(zhì)集合而成?；ǚ哿Ｓ伤姆煮w組成的，四分體是構(gòu)成花粉的基本單位。不同種屬蘭花花粉形態(tài)、表面紋飾不一。如蝴蝶蘭花粉塊為梨形，中間有大縫隙，花粉塊可分為兩半[12];杓蘭屬花粉表面都有圓形凹陷，外壁結(jié)構(gòu)呈光滑或褶皺狀[21]。多花指甲蘭花粉近球形，表面具裂隙，無(wú)紋飾，類似蜂巢，未見(jiàn)萌發(fā)孔。由于花粉粒結(jié)合緊密，相互擠壓，花粉粒呈不規(guī)則狀。隨著開(kāi)花時(shí)間的延長(zhǎng)，花粉粒粘合得更加緊密，花粉團(tuán)體積也相應(yīng)變小?；ǚ刍钚耘c柱頭可授性是影響雜交結(jié)實(shí)率的關(guān)鍵因素，本研究發(fā)現(xiàn)，花粉染色在開(kāi)花4～6?d效果最好，花蕾期次之，衰敗期幾乎無(wú)法染色?；ǚ刍钚耘c自身遺傳特性有關(guān)，羅遠(yuǎn)華等[13]研究發(fā)現(xiàn)不同的文心蘭種質(zhì)花粉活力不同。同時(shí)還與環(huán)境溫度、花期長(zhǎng)短等多種因素有關(guān)，且蘭花花粉團(tuán)是由花粉粒依靠類脂質(zhì)聚合而成的，分離困難，一定程度上增加了實(shí)驗(yàn)難度。結(jié)果表明，最接近真實(shí)值的花粉染色方法為TTC染色法和醋酸洋紅染色法，I2-KI的測(cè)量值遠(yuǎn)大于其他3種方法。這是由于I2-KI是根據(jù)花粉粒積累淀粉的量來(lái)判斷花粉活力，而三核期退化的花粉已有淀粉積累，遇碘呈藍(lán)色反應(yīng)另外，含有淀粉而被殺死的花粉粒遇I2-KI也呈藍(lán)色，因此，此法不能準(zhǔn)確表示花粉的活力。

開(kāi)花10?d以后TTC染液和醋酸洋紅染液幾乎無(wú)法將花粉染色，而花粉萌發(fā)率依然較高，這很可能是因?yàn)殚_(kāi)花后期花粉粒結(jié)合過(guò)于緊密，類脂質(zhì)阻礙了染色液的進(jìn)入，導(dǎo)致染色困難。蘭花花粉屬于二核型花粉，有厚實(shí)的外壁，壽命很長(zhǎng)，易于保存[17]，不會(huì)輕易失活。兜蘭、蝴蝶蘭等花粉活力均表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢(shì)[4，12]，這與我們的研究結(jié)果一致。柱頭可授性的結(jié)果顯示多花指甲蘭開(kāi)花5?d可授性最好，但3個(gè)時(shí)期的柱頭在檢測(cè)液中均未變色，該現(xiàn)象在其他植物中也有出現(xiàn)，如蘇蕓蕓[22]用同種方法研究了藿香的柱頭可授性，亦只見(jiàn)氣泡，未見(jiàn)柱頭變色。多花指甲蘭花粉活力最高時(shí)期與柱頭可授性時(shí)期一致，可選擇開(kāi)花4～6?d時(shí)對(duì)多花指甲蘭進(jìn)行人工授粉。

洋蘭的野生種大都艷而無(wú)香，因而培育有香味的洋蘭品種是今后洋蘭育種的主要目標(biāo)之一[23-24]。黃金小神童是花香引入的典范，為大花蕙蘭與四季蘭素心的雜交種[25]，氣味幽香。多花指甲蘭花香清幽、花型美麗，后期可大力開(kāi)展該種與其近緣種屬之間的雜交育種研究。

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