人工老化和自然老化大豆種子的紅外光譜研究

劉杰，劉剛*,李姝潔，鄧子昂，歐全宏，時(shí)有明

(1.云南師范大學(xué)物理與電子信息學(xué)院，云南 昆明 650500;2.曲靖師范學(xué)院物理與電子工程學(xué)院，云南 曲靖 655011)

1 引言

種子老化是種子活力在生理成熟期達(dá)到最高后開(kāi)始出現(xiàn)不可逆的自然衰退，這是種子貯藏過(guò)程普遍存在的一種現(xiàn)象[1]。種子老化過(guò)程中會(huì)伴隨組織結(jié)構(gòu)松弛，生理代謝紊亂，酶活性降低，膜質(zhì)過(guò)氧化，蛋白質(zhì)降解，有毒物質(zhì)積累等生理生化的變化[2]。種子老化影響田間出苗率，糧食老化影響食用品質(zhì)，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和食品安全產(chǎn)生嚴(yán)重影響。自然老化往往歷時(shí)較長(zhǎng)，人工加速老化因縮短自然老化種子所需時(shí)間而被廣泛應(yīng)用[3]。

自然老化是指種子在自然儲(chǔ)藏或種質(zhì)庫(kù)保存的條件下，其發(fā)芽力會(huì)逐漸喪失的一種自然現(xiàn)象[3]。人工加速老化是指人工創(chuàng)造利于種子老化條件，加速種子劣變的處理過(guò)程，包括高溫高濕加速老化、熱水浴加速老化、50%甲醇老化法等[4]。隨著對(duì)人工老化和自然老化種子的深入研究，人工老化取代自然老化研究老化種子的趨勢(shì)越發(fā)明顯。董國(guó)軍等[3]研究水稻種子在人工老化和自然老化條件下的變化，表明人工老化可替代自然老化對(duì)水稻耐貯藏種植的篩選和育種改良。胡國(guó)玉等[5]比較人工老化和自然老化大豆種子的結(jié)果，表明在一定的人工老化條件下可以有效鑒定大豆種子抗老化性。Kamizake等[6]研究了人工老化和自然老化對(duì)大豆物理特性的影響，兩種老化結(jié)果趨于一致。高華偉等[7]以21份大豆種質(zhì)在人工老化和自然老化的結(jié)果進(jìn)行比較，表明大部分種質(zhì)在人工老化處理下能較好地反映自然老化的過(guò)程。Zaheer等[8]利用dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法和6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色法研究自然老化和人工老化小麥種子的盾片和糊粉層的形態(tài)和分子變化，對(duì)種子貯藏過(guò)程中的種子活力進(jìn)行檢測(cè)。Zhang等[9]采用自然老化和人工老化對(duì)246株系的大豆種子處理，篩選出12個(gè)具有良好耐貯性的品系，用于育種工作。高琴梅等[10]認(rèn)為大豆種子在人工老化和自然老化的老化機(jī)制是一致的，丙二醛(MDA)和4-羥基壬烯醛(4-HNE)的含量變化可能存在一定差異。

FT-IR是一種快速無(wú)損的技術(shù)[11]，二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜用來(lái)提高光譜的分辨率[12]，二維相關(guān)紅外光譜是利用溫度擾動(dòng)對(duì)基團(tuán)分子的振動(dòng)行為進(jìn)行分析[13]。紅外光譜技術(shù)可以定性和定量的對(duì)樣品進(jìn)行分析，具有成本低、高效、無(wú)損、適用樣品范圍廣的特點(diǎn)，已應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和食品安全等方面[14]。Zhao等[15]利用FTIR光譜的二階導(dǎo)數(shù)分析大豆蛋白中7S和11S球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，估算出不同結(jié)構(gòu)的7S和11S球蛋白的相對(duì)數(shù)量。Wang等[16]利用傅里葉變換紅外光譜法研究大豆分離蛋白中二級(jí)結(jié)構(gòu)與表面疏水性之間的關(guān)系，表明表面疏水性隨著α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲的變化而改變。楊衛(wèi)梅等[14]以自然老化豆類(lèi)種子為材料，利用紅外光譜三級(jí)鑒別法區(qū)分豆類(lèi)種子的老化程度。G?nül等[17]利用衰減全反射-中紅外光譜法結(jié)合多元數(shù)據(jù)分析對(duì)冷榨葡萄籽油與精致大豆油的混合物進(jìn)行定量分析和分類(lèi)。Yasar等[18]采用FTIR光譜化學(xué)計(jì)量方法首次用于監(jiān)測(cè)豆粕真菌發(fā)酵過(guò)程中的化學(xué)和分子結(jié)構(gòu)變化。

本文利用紅外光譜法對(duì)自然老化和人工老化的大豆種子進(jìn)行研究，對(duì)老化大豆種子進(jìn)行區(qū)分，探索老化過(guò)程大豆種子的光譜規(guī)律，分析兩種老化條件下大豆種子的老化機(jī)理，為大豆種子老化研究及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和食品安全提供參考依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 儀器和參數(shù)

紅外光譜儀為美國(guó)Perkins Elmer公司生產(chǎn)的Frontier型傅里葉變換換紅外光譜儀，配備DTGS探測(cè)器，測(cè)定范圍4000～400 cm-1，掃描次數(shù)16，分辨率為4 cm-1。EUROTHERM公司生產(chǎn)的SYD-TC-01型溫度控制儀，溫度范圍為50～120℃每隔10℃采集一次光譜。

2.2 樣品制備

人工老化大豆樣品來(lái)自遼寧開(kāi)源。將大豆樣品放入LH-150S種子老化箱(溫度41℃，相對(duì)濕度為95%)進(jìn)行人工加速老化處理。分別對(duì)大豆種子處理2d、6d、10d。未經(jīng)過(guò)老化處理的種子作為對(duì)照組。

自然老化大豆采自云南陸良縣，在收獲當(dāng)年在室溫下貯藏。分別在貯藏當(dāng)年、貯藏一年、貯藏三年、貯藏五年時(shí)對(duì)大豆樣品收集并進(jìn)行測(cè)量。

2.3 數(shù)據(jù)處理

將老化大豆樣品研磨為細(xì)粉，在瑪瑙研缽中將溴化鉀研磨成細(xì)粉，將大豆粉和溴化鉀粉末以一定的比例混合，研磨均勻后進(jìn)行壓片測(cè)量，扣除溴化鉀背景。光譜采集使用Spectum 10軟件，再使用Omnic 8.2紅外光譜處理軟件在原始IR光譜進(jìn)行13點(diǎn)平滑后獲得的SD-IR光譜。通過(guò)使用由清華大學(xué)化學(xué)系編程的2D-IR相關(guān)分析軟件，對(duì)在50～120℃每隔10℃采集得到的動(dòng)態(tài)光譜進(jìn)行處理，得到2D-IR光譜。

3 結(jié)果與討論

3.1 老化大豆種子的傅里葉變換紅外光譜

圖1是在自然老化和人工老化條件下大豆種子的傅里葉變換紅外光譜。圖中顯示人工老化大豆種子的原始光譜整體相似，自然老化大豆種子的原始光譜整體也相似；兩種老化大豆種子的原始光譜整體相似，但在吸收峰強(qiáng)度上表現(xiàn)出明顯差異。表1是人工老化和自然老化條件下大豆種子的典型特征峰。由表可知，人工老化條件下大豆種子光譜中吸收峰數(shù)目和位置相同，自然老化條件下大豆種子光譜中吸收峰的數(shù)目和位置整體相同，自然老化的大豆種子在1457 cm-1附近的吸收峰表現(xiàn)不明顯，貯藏三年的大豆種子在1745cm-1附近的吸收峰表現(xiàn)較弱。

圖1 人工老化和自然老化大豆種子的傅里葉變換紅外光譜Fig.1 Fourier transform infrared spectroscopy of artificial aging and natural aging soybean seeds

表1 人工老化和自然老化條件下大豆種子典型特征吸收峰Table 1 Typical characteristic absorption peaks of soybean seeds under artificial and natural aging conditions

3.2 老化大豆種子的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜

自然老化和人工老化大豆種子的原始光譜差異不明顯，吸收峰強(qiáng)度差異表現(xiàn)明顯。利用二階導(dǎo)數(shù)對(duì)老化大豆種子樣品進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)處理，進(jìn)一步分析兩種老化大豆種子光譜的變化。

圖2.1和圖2.2為自然老化條件下和人工老化大豆種子在1800～800 cm-1范圍內(nèi)的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜。在圖2.1中自然老化大豆種子在1747 cm-1附近的吸收峰強(qiáng)度隨貯藏時(shí)間呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢(shì)，在貯藏三年出現(xiàn)減弱現(xiàn)象；1693 cm-1在隨著貯藏時(shí)間呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)；在1660，1548，1237 cm-1附近的吸收峰強(qiáng)度隨貯藏時(shí)間的增加呈現(xiàn)減弱趨勢(shì)，在貯藏五年出現(xiàn)增強(qiáng)；1610～1550 cm-1附近的峰在隨著貯藏時(shí)間的呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，在貯藏三年出現(xiàn)一定的減弱；在1498 cm-1附近的吸收峰強(qiáng)度呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)；在1402，1053 cm-1附近的吸收峰強(qiáng)度呈現(xiàn)減弱的趨勢(shì)；在1150-1000 cm-1范圍內(nèi)吸收峰強(qiáng)度呈現(xiàn)減弱趨勢(shì)，但都出現(xiàn)一定增強(qiáng)現(xiàn)象。

圖2.1 自然老化大豆種子在1800～800 cm-1范圍內(nèi)的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜Fig.2.1 The SD-IR of natural aging soybean seeds in the range of 1800-800 cm-1

圖2.2中人工老化大豆種子在1747 cm-1附近的吸收峰強(qiáng)度隨著老化時(shí)間的增加而呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)；1691 cm-1附近的峰呈現(xiàn)先減弱再增強(qiáng)的趨勢(shì)；在1658，1543，1237 cm-1附近的吸收峰強(qiáng)度隨著時(shí)間的增加呈現(xiàn)減弱的趨勢(shì)；1610-1550 cm-1附近的峰強(qiáng)度隨老化時(shí)間呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，在老化2d出現(xiàn)一定減弱；在1415，946，889 cm-1附近的吸收峰強(qiáng)度隨著時(shí)間的增加呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢(shì)；在1516，1398，1382，918 cm-1附近的吸收峰強(qiáng)度隨著時(shí)間的增加呈現(xiàn)減弱趨勢(shì)；1200-1100 cm-1范圍內(nèi)吸收峰強(qiáng)度呈現(xiàn)減弱趨勢(shì)，但都出現(xiàn)一定增強(qiáng)。

圖2.2 人工老化大豆種子在1800～800 cm-1范圍內(nèi)的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜Fig.2.2 The SD-IR of artificial aging soybean seeds in the range of 1800-800 cm-1

綜上所述，1691 cm-1附近的峰為醛/酮類(lèi)物質(zhì)的典型吸收峰。1610～1550 cm-1附近的峰歸屬為氨基酸的典型吸收峰。兩種老化大豆種子在1747 cm-1附近的吸收峰強(qiáng)度隨著老化程度的增加而增強(qiáng)的趨勢(shì)，表明大豆種子中的脂類(lèi)物質(zhì)在隨著老化程度的增加而增加；在1693 cm-1附近的吸收峰呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，表明老化的大豆種子中酮/醛類(lèi)物質(zhì)在增加；與高琴梅[10]測(cè)量大豆種子老化中醛類(lèi)變化的結(jié)果相一致。兩種老化大豆種子在1150-1100 cm-1附近的吸收峰強(qiáng)度呈現(xiàn)減弱趨勢(shì)，但隨著老化程度的增加均出現(xiàn)一定的增強(qiáng)現(xiàn)象；表明大豆種子中的糖類(lèi)物質(zhì)在隨著老化程度呈現(xiàn)減少趨勢(shì)，但隨著老化的增加出現(xiàn)一定的增強(qiáng)。在1660，1549，1236 cm-1附近吸收峰強(qiáng)度整體表現(xiàn)出減弱的趨勢(shì)，表明大豆種子中蛋白質(zhì)的含量隨著老化程度的增加呈現(xiàn)減少趨勢(shì)；在1610-1550 cm-1附近的吸收峰在增加，表明氨基酸含量呈現(xiàn)增加趨勢(shì)；這與張自陽(yáng)等[20]測(cè)量老化種子中蛋白質(zhì)隨著老化程度的增加會(huì)發(fā)生水解產(chǎn)生游離的氨基酸，并導(dǎo)致可溶性糖的含量出現(xiàn)一定上升的結(jié)果相一致。由二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜對(duì)兩種老化大豆種子分析可知，兩種的老化過(guò)程中大豆種子的脂質(zhì)物質(zhì)、蛋白質(zhì)和糖類(lèi)物質(zhì)的變化趨勢(shì)基本一致。

3.3 大豆種子老化的二維相關(guān)紅外光譜

2D-IR可以提高光譜分辨率，提供更多的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)信息[12]。對(duì)兩種老化的大豆種子進(jìn)行二維相關(guān)紅外光譜處理，進(jìn)一步探索兩種老化大豆種子光譜的變化。

3.3.1老化大豆種子在850～1250 cm-1范圍內(nèi)的二維相關(guān)紅外光譜

圖3.1是自然老化條件下大豆種子在850～1250 cm-1范圍內(nèi)的二維相關(guān)紅外光譜。貯藏當(dāng)年大豆種子在977，1020，1080，1134，1219 cm-1附近為強(qiáng)自動(dòng)峰。貯藏一年的大豆種子與貯藏當(dāng)年相比，在890，970，1134，1220 cm-1附近仍為強(qiáng)自動(dòng)峰，在940，1010，1100，1200 cm-1附近的自動(dòng)峰強(qiáng)度增強(qiáng)，貯存當(dāng)年最強(qiáng)自動(dòng)峰出現(xiàn)在1219 cm-1附近，貯存一年出現(xiàn)在1200和1220 cm-1附近。貯存三年與貯存一年相比，在890，940，1200 cm-1附近的自動(dòng)峰強(qiáng)度逐漸減弱，貯存三年的最強(qiáng)峰出現(xiàn)在1147和1220 cm-1附近。貯藏五年與貯藏三年相比，在904 cm-1附近自動(dòng)峰強(qiáng)度增強(qiáng)，貯存五年最強(qiáng)峰出現(xiàn)在1219 cm-1附近。

圖3.1 自然老化大豆種子在850-1250 cm-1范圍內(nèi)的二維相關(guān)紅外光譜。a：貯藏當(dāng)年；b：貯藏一年；c：貯藏三年；d：貯藏五年Fig.3.1 2D-IR of natural aging soybean seeds in the range of 850-1250 cm-1.a:Harvest year;b:Storage for one year;c:Storage for three year;d:Storage for five year

圖3.2是人工老化條件下大豆種子在850～1250 cm-1范圍內(nèi)的二維相關(guān)紅外光譜。大豆種子老化過(guò)程中在898，960，1020，1068，1110，1129，1214 cm-1附近均出現(xiàn)了自動(dòng)峰；最強(qiáng)自動(dòng)峰均出現(xiàn)在1214 cm-1附近，自動(dòng)峰強(qiáng)度隨著老化時(shí)間的逐漸減弱。未老化大豆種子在898 cm-1附近的峰強(qiáng)高于960 cm-1附近，在老化10d處正相反，在老化2d和6d處自動(dòng)峰強(qiáng)度基本相同。未老化和老化2d大豆種子在1008 cm-1附近出現(xiàn)一個(gè)弱自動(dòng)峰。老化的大豆種子在1165 cm-1處均出現(xiàn)一個(gè)中強(qiáng)峰。未老化大豆種子在1088 cm-1處附近出現(xiàn)一個(gè)自動(dòng)峰。

圖3.2 人工老化大豆種子在850～1250 cm-1范圍內(nèi)的二維相關(guān)紅外光譜。a：未老化；b：人工老化2d；c：人工老化6d；d：人工老化10 dFig.3.2 2D-IR of artificial aging soybean seeds in the range of 850-1250 cm-1.a:Unaged soybean seeds;b:Aging for 2 days;c:Aging for 6 days;d:Aging for 10 days

3.3.2老化大豆種子在1450～1800 cm-1范圍內(nèi)的二維相關(guān)紅外光譜

圖3.3是自然老化條件下大豆種子在1450～1800 cm-1范圍內(nèi)的二維相關(guān)紅外光譜。大豆種子在貯藏過(guò)程中在1458，1556，1629，1752 cm-1附近均出現(xiàn)自動(dòng)峰。貯存當(dāng)年均為強(qiáng)自動(dòng)峰，貯存一年在1553，1649cm-1附近為強(qiáng)自峰，貯存三年在1553，1565，1631，1752 cm-1附近為強(qiáng)自峰，貯藏五年在1558和1631 cm-1附近為強(qiáng)自動(dòng)峰。

圖3.3 自然老化條件下大豆種子在1450-1800 cm-1范圍內(nèi)的二維相關(guān)紅外光譜。a：貯藏當(dāng)年；b：貯藏一年；c：貯藏三年；d：貯藏五年Fig.3.3 2D-IR of natural aging soybean seeds in the range of 1450-1800 cm-1.a:Harvest year;b:Storage for one year;c:Storage for three year;d:Storage for five year

圖3.4是人工老化條件下大豆種子在1450～1800 cm-1范圍內(nèi)的二維相關(guān)紅外光譜。大豆種子在人工老化過(guò)程中均在1491，1556，1621，1743，1759 cm-1附近出現(xiàn)強(qiáng)自動(dòng)峰。未老化大豆種子在1702 cm-1附近出現(xiàn)一個(gè)強(qiáng)自動(dòng)峰；老化后大豆種子均在1458，1686 cm-1附近表現(xiàn)為一個(gè)弱自動(dòng)峰，在1703 cm-1附近表現(xiàn)為弱自動(dòng)峰；老化6d大豆種子在1792 cm-1附近出現(xiàn)一個(gè)弱自動(dòng)峰。

圖3.4 人工老化大豆種子在1450-1800 cm-1范圍內(nèi)的二維相關(guān)紅外光譜。a：未老化；b：人工老化2d；c：人工老化6d；d：人工老化10dFig.3.4 2D-IR of artificial aging soybean seeds in the range of 1450-1800 cm-1.a:Unaged soybean seeds;b:Aging for 2 days;c:Aging for 6 days;d:Aging for 10 days

在二維相關(guān)紅外光譜中，老化大豆種子在850～1250 cm-1范圍內(nèi)，自然老化條件下貯藏當(dāng)年大豆種子和人工老化條件下未老化大豆種子的自動(dòng)峰數(shù)目和位置表現(xiàn)一致，兩種老化的大豆種子在1214 cm-1附近的自動(dòng)峰均為最強(qiáng)峰，均在899，971，1020，1068，1219 cm-1附近表現(xiàn)為強(qiáng)自動(dòng)峰。在1450～1800 cm-1范圍內(nèi)，自然老化條件下貯藏當(dāng)年大豆種子和人工老化條件下未老化大豆種子的自動(dòng)峰數(shù)目和位置表現(xiàn)一致。兩種老化大豆種子均在1458，1556，1621，1759 cm-1附近表現(xiàn)為強(qiáng)自動(dòng)峰。

二維相關(guān)紅外光譜可以簡(jiǎn)化復(fù)雜光譜的重疊峰，提供更多FTIR光譜及其二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜無(wú)法獲得的細(xì)節(jié)信息。由二維相關(guān)紅外光譜可知，在1165 cm-1附近的峰歸屬為脂質(zhì)，在1200 cm-1附近的峰歸屬于酚類(lèi)物質(zhì)，1610-1550 cm-1范圍內(nèi)的峰歸屬于氨基酸，1621 cm-1附近的峰為芳香環(huán)中C=O的彎曲振動(dòng)，1711cm-1附近的峰歸屬于脂肪酸，1100 cm-1附近的峰歸屬為醇類(lèi)物質(zhì)。表明大豆種子在老化過(guò)程中，伴隨著脂類(lèi)物質(zhì)、蛋白質(zhì)、糖類(lèi)物質(zhì)、醇類(lèi)物質(zhì)及酚類(lèi)物質(zhì)等的變化。

綜上所述，利用傅里葉變換紅外光譜、二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜結(jié)合二維相關(guān)紅外光譜對(duì)老化大豆種子進(jìn)行分析表明，在大豆種子老化過(guò)程中脂類(lèi)物質(zhì)在增加，酮/醛類(lèi)物質(zhì)在增加；脂肪水解產(chǎn)生大量的游離脂肪酸，同時(shí)脂肪氧化產(chǎn)生酮、醛、酸類(lèi)等物質(zhì)。老化大豆種子中蛋白質(zhì)含量下降，氨基酸含量升高，可能為蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生了游離氨基酸。大豆種子在老化過(guò)程中的細(xì)胞呼吸作用導(dǎo)致糖類(lèi)物質(zhì)減少，同時(shí)在老化過(guò)程中醇類(lèi)物質(zhì)、酚類(lèi)物質(zhì)發(fā)生變化。

3 結(jié)論

本文采用傅里葉變換紅外光譜、二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜和二維相關(guān)紅外光譜法研究自然老化條件和人工老化條件下的大豆種子。結(jié)果表明，在原始光譜中，人工老化大豆種子的原始光譜整體相似，自然老化大豆種子的原始光譜整體也相似；兩種老化大豆種子的原始光譜整體相似，但在吸收峰強(qiáng)度上表現(xiàn)出了差異。二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜分析顯示，兩種老化的大豆種子中物質(zhì)變化趨勢(shì)趨于一致；脂類(lèi)物質(zhì)增加，蛋白質(zhì)物質(zhì)呈現(xiàn)減少的趨勢(shì)，糖類(lèi)物質(zhì)呈現(xiàn)減少的趨勢(shì)，酮/醛類(lèi)物質(zhì)呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，氨基酸呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。人工老化對(duì)種子物質(zhì)代謝的影響程度比自然老化的小。在二維相關(guān)紅外光譜中，未老化大豆種子和貯藏當(dāng)年的大豆種子自動(dòng)峰數(shù)目和位置基本相同；自然老化后的大豆種子與貯存當(dāng)年的大豆種子相比，自動(dòng)峰強(qiáng)度、數(shù)目和位置發(fā)生明顯變換；人工老化的大豆種子與未老化的大豆種子相比，自動(dòng)峰數(shù)目和位置基本相同，自動(dòng)峰的強(qiáng)度發(fā)生改變。利用傅里葉變換紅外光譜、二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜結(jié)合二維相關(guān)紅外光譜法對(duì)自然老化條件下和人工老化大豆種子的分析結(jié)果表明，紅外光譜法可以實(shí)現(xiàn)快速、方便的對(duì)兩種老化大豆種子的光譜變化進(jìn)行研究。