以次生代謝物產(chǎn)量為目標(biāo)的西蘭花毛狀根培養(yǎng)技術(shù)體系優(yōu)化

張秀民 馬紹英 楊潔 包金玉 張曉玲 田鵬 路亞琦 李勝

（1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070；2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，蘭州 730070）

西 蘭 花（Brassica oleracea L var. italica Planch）屬十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種，以無數(shù)花梗和花蕾組成的花球?yàn)橹鳎?］，因含有硫代葡萄糖苷（glucosinolate，GLS）、類胡蘿卜素和酚類等豐富的生物活性化合物而備受關(guān)注［2］。蘿卜硫苷（glucoraphanin，GRA）是屬于脂肪族GLS的一種［3］，GRA其本身并不具有生物活性，但當(dāng)植物細(xì)胞受到損傷或破壞時(shí)，與存在于特殊的成纖維細(xì)胞-芥子細(xì)胞中的黑芥子酶（myrosinase，MYR）發(fā)生酶解［4］，進(jìn)而形成多種化合物，如異硫氰酸鹽、腈和硫氰酸鹽等物質(zhì)［5］。蘿卜硫素（sulforaphane，SF）是異硫氰酸鹽的一種，是迄今為止在蔬菜中發(fā)現(xiàn)具有強(qiáng)抗癌、防癌作用的次生代謝產(chǎn)物［6-7］。

茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）是一種帶有特殊香氣的物質(zhì)，分離自茉莉花精油［8］。作為誘導(dǎo)子，MeJA不僅可以在細(xì)胞膜間內(nèi)源信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起作用，而且能夠提高植物次生代謝產(chǎn)物含量［9］。已有研究表明，外源添加MeJA可以增加西蘭花和其他蕓苔屬作物GLS含量，增強(qiáng)癌癥化學(xué)預(yù)防和抗氧化活性［10］。目前，SF及GRA主要從西蘭花種子和幼苗中獲得，成本高且產(chǎn)量低。前期本課題組已成功建立西蘭花毛狀根培養(yǎng)體系，研究發(fā)現(xiàn)西蘭花毛狀根中SF含量顯著高于西蘭花無菌苗，分別是西蘭花無菌苗葉片、幼根的13、31.28倍［11］。然而，由植物細(xì)胞生物合成的具有高效利用價(jià)值的大多數(shù)代謝物都儲(chǔ)存在細(xì)胞內(nèi)，從復(fù)雜的植物細(xì)胞或組織中提取純化代謝物質(zhì)成本高昂，嚴(yán)重障礙大規(guī)模生產(chǎn)。主動(dòng)性釋放可以在植株整個(gè)生命周期內(nèi)產(chǎn)生高產(chǎn)量的植物次生代謝物質(zhì)，可解決由次生代謝物在細(xì)胞或組織中大量積累帶來的反饋抑制，并促進(jìn)其下游產(chǎn)物的提純；與植物組織的提取溶劑相比，自主性釋放的分泌物是相對簡單的混合物，這使得化學(xué)物質(zhì)的分離變得更容易［12］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，西蘭花毛狀根經(jīng)MeJA處理使得毛狀根中SF大量釋放到MS液體培養(yǎng)基中，且液體培養(yǎng)基中SF的釋放量是毛狀根中SF含量的12.3倍［13］。已有研究表明，MeJA處理水飛薊細(xì)胞懸浮液可提高水飛薊素的含量并使其釋放到液體培養(yǎng)基中［14］，María Perassolo等［15］研究表明，100 μmol/L的MeJA能夠提高茜草毛狀根中的蒽醌類化合物含量并使其釋放至液體培養(yǎng)基中，但MeJA誘導(dǎo)西蘭花毛狀根中GRA和SF釋放研究未見報(bào)道。

本研究通過外源添加MeJA誘導(dǎo)西蘭花毛狀根，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以接種量、pH、培養(yǎng)溫度為自變量，以西蘭花毛狀根培養(yǎng)體系中GRA和SF總產(chǎn)量為響應(yīng)值，利用Design-expert8.0.6軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，為揭示西蘭花毛狀根次生代謝物GRA和SF釋放機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室“中青9號”西蘭花無菌苗葉片經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌“ATCC15834”誘導(dǎo)獲得的毛狀根及其液體培養(yǎng)基為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 MeJA處理西蘭花毛狀根 將西蘭花毛狀根統(tǒng)一轉(zhuǎn)接于新配置MS液體培養(yǎng)基，西蘭花毛狀根在靜止期（18-21 d）產(chǎn)生SF并少量釋放，21 d為最佳收獲時(shí)間，且在添加10 mmol/L MeJA時(shí)顯著增加培養(yǎng)基中SF含量，因此選擇西蘭花毛狀根生長至第18 天添加MeJA［13］。在各個(gè)處理?xiàng)l件下，采集MeJA處理的樣本，用蒸餾水沖洗干凈，濾紙吸取多余水分，于-20℃冰箱保存，作為后續(xù)GRA和SF活性成分提取的實(shí)驗(yàn)材料。設(shè)置3次重復(fù)試驗(yàn)。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Single factor experimental design

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法中的Box-Behnken Design建立數(shù)學(xué)模型，選取培養(yǎng)溫度（℃）、毛狀根接種量（g）以及pH為自變量，以西蘭花毛狀根中GRA及SF總產(chǎn)量為指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)（表2）。

表2 Box-behnken試驗(yàn)因素水平表Table 2 Box-behnken test factor levels

1.2.4 西蘭花毛狀根培養(yǎng)體系GRA和SF的提取與檢測 西蘭花毛狀根培養(yǎng)體系GRA的提取及檢測參考包金玉［13］的方法，SF的提取及檢測參考包金玉［13］的方法。

1.2.5 黑芥子酶活性的測定 參照Burow的方法略作改進(jìn)［16］，取0.5 g各處理的西蘭花毛狀根，用3 mL 0.1mol/L pH6.5磷酸鹽緩沖液在冰浴下研磨，超聲波浸提20 min，4℃下10 000×g離心15 min，上清液即為粗酶液。粗酶液中蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)試劑盒測定（中國南京建成生物有限公司）。取200 μL粗 酶 液 與200 μL 2 mmol/L sinigrin（Sigma，CAS：3952-98-5）混合，于37℃水浴反應(yīng)15 min，然后轉(zhuǎn)移至沸水浴中5 min停止反應(yīng)，用葡萄糖試劑盒（中國南京建成生物有限公司）測定葡萄糖含量。以每分鐘被MYR轉(zhuǎn)化生成1 nmol葡萄糖為1個(gè)酶活力單位（U/mg protein）。

2 結(jié)果

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 接種量對西蘭花毛狀根培養(yǎng)體系中GRA和SF釋放的影響 接種量影響西蘭花毛狀根的增殖，而增殖又會(huì)影響GRA和SF的合成。隨著接種量增加，毛狀根中GRA產(chǎn)量、培養(yǎng)基中SF產(chǎn)量和毛狀根中SF產(chǎn)量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢；MYR的活性也隨接種量的增大而升高（圖1）。毛狀根接種量為0.15 g時(shí)，毛狀根中GRA產(chǎn)量顯著高于其他處理，達(dá)1 105.13 μg/flask，是培養(yǎng)基中GRA產(chǎn)量的34.07倍；此時(shí)培養(yǎng)基中SF產(chǎn)量顯著高于其他處理，可達(dá)840.57 μg/flask，是毛狀根中SF產(chǎn)量的29.95倍。培養(yǎng)基中SF的產(chǎn)量遠(yuǎn)高于毛狀根中，而GRA在毛狀根中的產(chǎn)量比在培養(yǎng)基中的高。因此，可以初步得出，當(dāng)接種量為0.15 g時(shí)，毛狀根中的GRA在MYR的作用下大部分轉(zhuǎn)化為SF，使其釋放到培養(yǎng)基中，從而使得培養(yǎng)基中的GRA釋放量減少，此時(shí)毛狀根中77.31%的SF釋放到培養(yǎng)基中。因此控制毛狀根的接種量為0.15 g時(shí)，有助于SF向培養(yǎng)基中釋放。

圖1 接種量對西蘭花毛狀根培養(yǎng)體系中GRA和SF釋放的影響Fig. 1 Effects of inoculation amount on the GRA and SF release in broccoli hairy root culture system

2.1.2 轉(zhuǎn)速對西蘭花毛狀根培養(yǎng)體系中SF和GRA釋放的影響 轉(zhuǎn)速在液體懸浮系統(tǒng)中既影響著培養(yǎng)物的物理狀態(tài)也影響著生理狀態(tài)。在西蘭花毛狀根細(xì)胞培養(yǎng)懸浮體系中，不同的剪切力會(huì)影響西蘭花毛狀根的增殖，進(jìn)而影響次生代謝物的合成。如圖2所示，轉(zhuǎn)速為110 r/min時(shí)，毛狀根中GRA產(chǎn)量顯著高于其他處理，達(dá)879.62 μg/flask；培養(yǎng)基中GRA和SF產(chǎn)量均顯著高于其他處理，分別為37.07 μg/flask和958.54 μg/flask，此時(shí)培養(yǎng)基中SF產(chǎn)量是毛狀根中SF產(chǎn)量的53.69倍。伴隨轉(zhuǎn)速增大，毛狀根受到的剪切力也同步增大，使得GRA和MYR發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生大量SF，導(dǎo)致SF和GRA向培養(yǎng)基中釋放，同時(shí)，培養(yǎng)基中的溶氧量也影響毛狀根的生長。因此可以初步得出，毛狀根中GRA和SF的釋放和剪切力相關(guān)，并且轉(zhuǎn)速為110 r/min時(shí)，GRA和SF的釋放量最大。

圖2 轉(zhuǎn)速對西蘭花毛狀根培養(yǎng)體系中GRA和SF釋放的影響Fig. 2 Effects of rotating speed on the GRA and SF release in broccoli hairy root culture system

2.1.3 pH對西蘭花毛狀根培養(yǎng)體系中SF和GRA釋放的影響 pH值的變化主要影響到細(xì)胞質(zhì)膜電位，從而影響細(xì)胞質(zhì)膜透性，使細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的交流發(fā)生變化，特別是在pH 4-6之間時(shí)更加明顯。如圖3所示，隨著pH的增加，西蘭花毛狀根培養(yǎng)體系中GRA和SF產(chǎn)量整體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且隨著pH的增大，SF的總產(chǎn)量逐漸減小。pH為6.0時(shí)，此時(shí)毛狀根中GRA產(chǎn)量為830.50 μg/flask，是培養(yǎng)基中GRA的23.43倍；pH為5.5時(shí)，培養(yǎng)基中SF產(chǎn)量顯著高于其他處理，達(dá)到930.51 μg/flask，是毛狀根中SF的13.31倍。由于酸堿度影響毛狀根的生長發(fā)育以及次生代謝物的合成，此時(shí)毛狀根中的GRA大部分經(jīng)由MYR水解轉(zhuǎn)變?yōu)镾F并釋放到培養(yǎng)基中，少部分繼續(xù)留在毛狀根中。因此可以初步得出，酸堿度可以在一定程度上影響GRA和SF向培養(yǎng)基中的釋放，且當(dāng)pH為5.5時(shí)，SF向培養(yǎng)基中釋放量達(dá)到最大。

圖3 pH對西蘭花毛狀根培養(yǎng)體系中GRA和SF釋放的影響Fig. 3 Effects of pH on the GRA and SF release in broccoli hairy root culture system

2.1.4 培養(yǎng)溫度對西蘭花毛狀根培養(yǎng)體系中SF和GRA釋放的影響 如圖4所示，隨著培養(yǎng)溫度的升高，西蘭花毛狀根培養(yǎng)體系中GRA和SF的產(chǎn)量隨著溫度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，而MYR的活性隨著溫度的升高隨之增大。當(dāng)溫度為25℃時(shí)，毛狀根中GRA的產(chǎn)量顯著高于其他處理，達(dá)1 032.78 μg/flask，此時(shí)培養(yǎng)基中SF產(chǎn)量也達(dá)到最高為752.06 μg/flask，是毛狀根中SF產(chǎn)量的6.7倍。培養(yǎng)溫度過低不利于毛狀根的生長增殖，進(jìn)而影響次生代謝物的生物合成，由此可得出，毛狀根在不同生長溫度下其增殖狀況及次生代謝物的合成也隨之不同。因此控制培養(yǎng)溫度為25℃時(shí)，有利于毛狀根中GRA的合成積累，有助于毛狀根中SF向培養(yǎng)基中釋放。

圖4 培養(yǎng)溫度對西蘭花毛狀根培養(yǎng)體系中GRA和SF釋放的影響Fig. 4 Effects of culture temperature on the GRA and SF release in broccoli hairy root culture system

2.1.5 培養(yǎng)基體積對西蘭花毛狀根培養(yǎng)體系中SF和GRA釋放的影響 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期研究，培養(yǎng)基體積會(huì)影響GRA和SF的合成，可能是培養(yǎng)基中營養(yǎng)需求差異所導(dǎo)致的。如圖5所示，西蘭花毛狀根培養(yǎng)體系中GRA和SF產(chǎn)量由于培養(yǎng)基的體積增大整體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。培養(yǎng)基體積為100 mL時(shí)，毛狀根中及培養(yǎng)基中GRA產(chǎn)量均顯著高于其他處理，分別為713.33 μg/flask和158.68 μg/flask。培養(yǎng)基體積為110 mL時(shí)，MYR的活性達(dá)到最大，MYR與GRA水解生成SF，使SF釋放至培養(yǎng)基中，此時(shí)培養(yǎng)基中SF的產(chǎn)量也顯著高于其他處理，達(dá)911.95 μg/flask。培養(yǎng)基體積增大，錐形瓶中的含氧量減少，影響毛狀根生長發(fā)育。因此可以初步得出，由于培養(yǎng)基體積增加導(dǎo)致培養(yǎng)基中含氧量減少，毛狀根受到低氧脅迫導(dǎo)致SF含量增大并向培養(yǎng)基中釋放。因此控制培養(yǎng)基體積為100 mL時(shí)，有助于毛狀根中GRA和SF的生物合成，而培養(yǎng)基體積為110 mL時(shí)，有助于SF向培養(yǎng)基中釋放。

圖5 培養(yǎng)基體積對西蘭花毛狀根培養(yǎng)體系中GRA和SF釋放的影響Fig. 5 Effects of medium volume on the GRA and SF release in broccoli hairy root culture system

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析 由以上單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得出，各個(gè)因素對西蘭花毛狀根中GRA總產(chǎn)量的影響順序?yàn)椋号囵B(yǎng)溫度＞接種量＞pH＞培養(yǎng)基體積＞轉(zhuǎn)速；對西蘭花毛狀根中SF總產(chǎn)量的影響順序?yàn)椋簆H＞接種量＞培養(yǎng)溫度＞培養(yǎng)基體積＞轉(zhuǎn)速，綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取對毛狀根中GRA和SF總產(chǎn)量有顯著影響的培養(yǎng)溫度（℃）、pH以及毛狀根接種量（g）3個(gè)因素為自變量，采用響應(yīng)面分析方法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以-1、0、1分別代表變量的水平，響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Response surface design and experimental results

2.2.2 二次回歸方程模擬及方差分析 用DX8.0.6響應(yīng)面軟件對表2中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到二次回歸模型方程：Y=+2.43+0.030A+0.15B+0.059C-0.13AB+0.075AC+0.12BC-0.48A2-0.37B2-0.36C2

對回歸方程進(jìn)行方差分析，由表4可知，模型顯著性檢驗(yàn)P＜0.05，表明模型顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。失擬項(xiàng)P值為0.3701＞0.05，失擬不顯著。模型的校正決定系數(shù)R2Adj為0.8629，能解釋約86.29%的響應(yīng)值變化，決定系數(shù)R2為0.9091，擬合程度良好，實(shí)驗(yàn)誤差小。從單因素水平觀察，其影響順序?yàn)椋航臃N量＞pH＞培養(yǎng)溫度。在有交互作用存在的條件下，對西蘭花毛狀根GRA和SF總產(chǎn)量的影響順序?yàn)锳B＞BC＞AC。利用該回歸方程確定最佳培養(yǎng)條件：毛狀根接種量為0.15g，培養(yǎng)溫度為25.44℃，pH為5.56，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次，西蘭花毛狀根中GRA和SF總產(chǎn)量為2.08 mg/flask，回歸模型預(yù)測理論總產(chǎn)量為2.44 mg/flask，驗(yàn)證值低于預(yù)測值，其相對誤差為1.8%，因此該回歸方程具有可行性。

2.2.3 各元素交互作用 回歸方程顯示，各因素之間存在交互作用，圖6-8響應(yīng)面圖反映了各因素在西蘭花毛狀根培養(yǎng)過程中對響應(yīng)值的影響，投影為等高線圖，響應(yīng)面的坡度陡峭程度直觀反映了各因素對響應(yīng)值的影響。從表4中可得，二次項(xiàng)A2、B2和C2對總產(chǎn)量均具顯著性影響（P＜0.01）。

圖6 Y=f（A，B）的響應(yīng)面Fig. 6 Responsive surface plot of Y=f（A，B）

表4 響應(yīng)面方差分析Table 4 Analysis of variance response surface

3 討論

MeJA是誘導(dǎo)子的一種，會(huì)刺激植物并影響植物體內(nèi)次生代謝物的合成與積累［17］。王瑜等［18］研究發(fā)現(xiàn)MeJA處理王不留行毛狀根能顯著促進(jìn)黃酮苷產(chǎn)生。孫際薇［19］研究發(fā)現(xiàn)MeJA能有效刺激曼陀羅毛狀根中東茛菪堿、茛菪堿成分迅速積累并向培養(yǎng)基中釋放。Cacho等［20］研究發(fā)現(xiàn)在水飛薊懸浮培養(yǎng)體系中添加MeJA后水飛薊素在液體培養(yǎng)基中的量提高了2倍。在本研究中，通過外源添加MeJA，不僅顯著促進(jìn)了西蘭花毛狀根中GRA和SF的積累，而且使GRA和SF大量釋放至液體培養(yǎng)基中，為GRA和SF的提取提供便利，極大降低了整個(gè)提取過程的成本。在植物細(xì)胞受到損傷或破壞時(shí)，存在于液泡中的GRA與存在于芥子素細(xì)胞的MYR發(fā)生酶解反應(yīng)，得到酶解產(chǎn)物SF，在毛狀根中GRA的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于SF，液體培養(yǎng)基中SF的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于GRA，說明SF可能是一個(gè)積累的過程，SF對GRA合成的反饋抑制效應(yīng)較GRA本身強(qiáng)，加速了SF的釋放，從而促進(jìn)毛狀根中GRA的大量合成［21］。

接種量影響離體植物器官的生長發(fā)育，接種量過多或過少都不利于毛狀根的生長［22］。本研究結(jié)果表明，隨著接種量的增大，毛狀根SF釋放量呈先增后降的趨勢，推斷這是由于SF對GRA的合成反饋抑制效應(yīng)比GRA強(qiáng)，加速了SF的釋放。此外，毛狀根群體效應(yīng)也是影響SF和GRA釋放的因素，伴隨接種量的增大，群體效應(yīng)導(dǎo)致西蘭花毛狀根中GRA和SF釋放量增大，但接種量過大，會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)體系中營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，影響毛狀根的正常生長［23］。

圖7 Y=f（A，C）的響應(yīng)面Fig. 7 Responsive surface plot of Y=f（A，C）

圖8 Y=f（B，C）的響應(yīng)面Fig. 8 Responsive surface plot of Y=f（B，C）

培養(yǎng)基的體積決定培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分以及容器中的含氧量。韓昱姝［24］研究擴(kuò)大培養(yǎng)基體積對金鐵鎖毛狀根次生代謝物的影響，發(fā)現(xiàn)2 L生物反應(yīng)器相較于1 L三角瓶生物量和皂苷含量增加卻不多的原因是通氣量不足等因素造成。袁金玲等［25］在進(jìn)行孝順竹愈傷組織懸浮培養(yǎng)條件優(yōu)化時(shí)得出在200 mL三角瓶中培養(yǎng)基體積為50 mL時(shí)，懸浮細(xì)胞有較好的增殖能力以及優(yōu)良的增殖狀態(tài)。本研究結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)基體積為100 mL時(shí)，SF向培養(yǎng)基中的釋放量達(dá)到最大；當(dāng)培養(yǎng)基體積為110 mL時(shí)，GRA向培養(yǎng)基中釋放量達(dá)到最大，這可能是由于培養(yǎng)基體積增加導(dǎo)致培養(yǎng)基中含氧量減少，使得毛狀根中次生代謝物釋放到培養(yǎng)基中，當(dāng)培養(yǎng)基體積過少時(shí)，培養(yǎng)基中溶氧量增加，但不能為毛狀根提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)。Cai等［12］的研究結(jié)果也表明葡萄懸浮培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基體積增大，釋放到培養(yǎng)基中白藜蘆醇的量增大。

剪切力也是液體培養(yǎng)中一個(gè)不可忽視的影響因素。毛狀根懸浮培養(yǎng)是在恒溫振蕩器中進(jìn)行的，當(dāng)毛狀根與玻璃器皿瓶壁長時(shí)間摩擦導(dǎo)致細(xì)胞破碎后，GRA與MYR在液體環(huán)境下接觸發(fā)生水解反應(yīng)［26］。隨著轉(zhuǎn)速增加，剪切力增強(qiáng)，毛狀根受損增大，使得SF的釋放量提高。本研究結(jié)果表明，當(dāng)轉(zhuǎn)速為110 r/min時(shí)，SF和GRA向培養(yǎng)基中的釋放量達(dá)到最大。

伴隨毛狀根的生長，培養(yǎng)基中的微環(huán)境發(fā)生了變化，隨之pH也發(fā)生變化，研究結(jié)果表明毛狀根在偏酸性環(huán)境中生長更好，這與趙生琴［27］研究結(jié)果相似。葉國洪等［28］的研究表明，煙草細(xì)胞在培養(yǎng)基原始pH 4.0-8.0下均能生長，但在pH 6.0時(shí)細(xì)胞生長最好，CoQ10含量最高。GRA酶解后形成的糖苷配基中間體在pH 5-8范圍內(nèi)可重排得到SF等異硫氰酸鹽［29］。本研究結(jié)果表明，當(dāng)pH為5.5時(shí)，SF和GRA向培養(yǎng)基中釋放量達(dá)到最大。

溫度的變化不僅對植物光合生態(tài)生理的進(jìn)行及有機(jī)化合物的生物合成有影響，還對植物內(nèi)部因素（酶活性大小、呼吸作用）有較大的影響［30］。毛狀根最適生長溫度為20℃-28℃，李翠芳等［31］研究了新疆紫草毛狀根在26℃條件下生長狀況較好，低于或高于26℃，紫草毛狀根的生長均受到不同程度的抑制；李春玲［32］研究了溫度對水飛薊毛狀根增值的影響，當(dāng)溫度為26℃時(shí)，毛狀根生長旺盛，其增值倍數(shù)相較于對照最高達(dá)31.67倍。而在本研究中，當(dāng)培養(yǎng)溫度為25℃時(shí)，GRA和SF總產(chǎn)量均達(dá)到最大且釋放到培養(yǎng)基中的量也達(dá)到最大。

4 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，接種量、pH以及培養(yǎng)溫度對GRA和SF總產(chǎn)量影響顯著，以西蘭花毛狀根培養(yǎng)體系GRA和SF總產(chǎn)量為響應(yīng)值，利用Designexpert8.0.6得出最佳培養(yǎng)條件：毛狀根接種量為0.15 g，培養(yǎng)溫度為25.44℃，pH為5.56，在此條件驗(yàn)證得出：西蘭花毛狀根中GRA和SF總產(chǎn)量為2.08 mg/flask，與回歸模型預(yù)測理論總產(chǎn)量2.44 mg/flask接近，其相對誤差為1.8%。