血漿miR-127-3p及miR-129-5p分子與狼瘡性腎炎微觀血瘀證的相關(guān)性探討

張紹杰， 湯水福， 涂曉， 錢(qián)飛婷， 胡芳玉

（1.杭州市丁橋醫(yī)院腎病科，浙江杭州 310021；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎病科，廣東廣州 510405；3.杭州市中醫(yī)院，浙江杭州 310007；4.紹興市中醫(yī)院腎病科，浙江紹興 312000）

狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）是系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）的腎臟損害，腎活檢顯示腎臟受累幾乎為100%。LN是繼發(fā)性腎小球腎炎的最常見(jiàn)原因，約占60%[1]。本病治療較為困難，且易復(fù)發(fā)。LN 除引起腎小球的病變外，尚可引起腎小管間質(zhì)病變。有報(bào)道LN 中腎小管間質(zhì)病變可達(dá)6.9%～86.5%[2]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，Ⅳ型LN 患者合并腎間質(zhì)病變達(dá)62.5%，且與血瘀證密切相關(guān)[3]。

腎小管萎縮及腎間質(zhì)纖維化等病理改變符合中醫(yī)學(xué)的血瘀證表現(xiàn)，王永鈞教授提出對(duì)腎臟疾病血瘀證的辨證應(yīng)宏觀與微觀、臨床與病理相結(jié)合，認(rèn)為腎小球毛細(xì)血管微血栓形成、腎小球硬化、腎小管萎縮及間質(zhì)纖維化等均屬于微觀意義上的血瘀證[4]。這其中很大一部分患者并無(wú)肌膚甲錯(cuò)、舌質(zhì)紫暗等外在瘀血征象。出現(xiàn)上述病理表現(xiàn)后則治療較為棘手，且效果欠佳。若能早期診斷微觀血瘀證，及時(shí)加以干預(yù)，則可在一定程度上延緩病情進(jìn)展。故在此圍繞LN 微觀血瘀證，選取miR-127-3p、miR-129-5p及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)進(jìn)行對(duì)照研究，以期能對(duì)微觀血瘀證的辨證提供簡(jiǎn)便客觀的指標(biāo)，以利于臨床上的早期診斷及干預(yù)。現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象及分組收集2018年6月至2020年1月在杭州市中醫(yī)院住院治療的LN患者，共60例，其中微觀血瘀證組與非血瘀證組各30例。所有患者均已于本院或外院行腎穿刺活檢，具有明確的病理結(jié)果。同時(shí)，選取15例健康志愿者作為健康對(duì)照組。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照1997年美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)制定的SLE 診斷標(biāo)準(zhǔn)，符合4 項(xiàng)或4 項(xiàng)以上者即可診斷為SLE，其中包含第7 項(xiàng)者即可診斷為L(zhǎng)N。中醫(yī)微觀血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照王永鈞教授《IgAN 腎病理的中醫(yī)微觀辨證》[4]中的瘀痹證標(biāo)準(zhǔn)制定。①死血凝著：腎小球毛細(xì)血管內(nèi)微血栓形成，毛細(xì)血管內(nèi)血栓樣物質(zhì)沉積，腎小靜脈血栓，毛細(xì)血管閉塞、淤血。②腎內(nèi)微癥積：腎小球局灶、節(jié)段硬化，腎小管萎縮，間質(zhì)纖維化，纖維性新月體，球周纖維化。符合上述病理表現(xiàn)任意一項(xiàng)者即可辨為微觀血瘀證。

1.2.2 納入標(biāo)準(zhǔn) ①符合上述西醫(yī)LN 的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②符合上述中醫(yī)微觀血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)；③臨床資料完善的患者。

1.2.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①合并有高血壓、糖尿病等其他能引起腎臟損傷的疾病患者；②患有混合性結(jié)締組織病的患者；③患有尿路感染等感染性疾病的患者；④合并有心、腦、肝和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾病的患者；⑤臨床資料不完善的患者。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 miR-127-3p、miR-129-5p分子表達(dá)情況 所有受試者均空腹抽取靜脈血8 mL，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，以4 000 r/min（離心半徑為13.5 cm）離心10 min，分離血漿，并于-80 ℃保存。委托廣州維伯鑫生物科技股份有限公司完成血漿miR-127-3p、miR-129-5p 分子的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)。

1.3.2 腎病理指數(shù) 包括活動(dòng)性指數(shù)（AI）和慢性化指數(shù)（CI），均采用Austin 半定量法判定，其中AI為0～24分，CI為0～12分。

1.3.3 腎功能指標(biāo) 檢測(cè)LN患者血尿素氮（BUN）、血尿酸（UA）、血肌酐（Cr）、血清胱抑素（Cys-C）等腎功能指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，符合正態(tài)分布者采用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布者采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率或構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman 秩相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組患者的基線資料比較表1 結(jié)果顯示：2組患者的性別、年齡等基線資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

表1 2組狼瘡性腎炎（LN）患者的性別和年齡比較Table 1 Comparison of the gender and age of LN patients between the two groups（）

表1 2組狼瘡性腎炎（LN）患者的性別和年齡比較Table 1 Comparison of the gender and age of LN patients between the two groups（）

組別微觀血瘀證組非血瘀證組F/t值P值例數(shù)（例）30 30性別[男/女（例）]5/25 1/29 2.963 0.195平均年齡（歲）42.76±15.98 42.50±13.71 0.195 0.846

2.2 2組患者的腎功能指標(biāo)比較表2 結(jié)果顯示：微觀血瘀證組患者的BUN、UA、Cr 和Cys-C 水平均明顯高于非血瘀證組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 2組狼瘡性腎炎（LN）患者腎功能指標(biāo)比較Table 2 Comparison of renal function indexes between the two groups of LN patients （）

表2 2組狼瘡性腎炎（LN）患者腎功能指標(biāo)比較Table 2 Comparison of renal function indexes between the two groups of LN patients （）

①P＜0.05，與非血瘀證組比較

組別微觀血瘀證組非血瘀證組Cys-C（mg·L-1）2.13±1.18①0.99±0.28例數(shù)（例）30 30 BUN（mmol·L-1）12.75±8.56①5.42±4.02 UA（μmol·L-1）403.93±102.43①308.70±94.17 Cr（μmol·L-1）182.97±161.12①58.53±27.29

2.3 2組患者的腎病理指數(shù)比較表3 結(jié)果顯示：微觀血瘀證組患者的AI 和CI 水平均明顯高于非血瘀證組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 2組狼瘡性腎炎（LN）患者腎病理指數(shù)比較Table 3 Comparison of renal pathological indexes of LN patients between the two groups（）

表3 2組狼瘡性腎炎（LN）患者腎病理指數(shù)比較Table 3 Comparison of renal pathological indexes of LN patients between the two groups（）

①P＜0.05，與非血瘀證組比較

組別微觀血瘀證組非血瘀證組慢性化指數(shù)（CI）4.05±2.26①2.53±21.65例數(shù)（例）30 30活動(dòng)性指數(shù)（AI）8.32±4.20①5.53±4.51

2.4 2組患者miRNA 分子表達(dá)量比較表4 結(jié)果顯示：在miR-127-3p 分子的表達(dá)方面，微觀血瘀證組的miR-127-3p 分子表達(dá)量明顯高于非血瘀證組及健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而非血瘀證組與健康對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在miR-129-5p 分子的表達(dá)方面，微觀血瘀證組的miR-129-5p 分子表達(dá)量明顯高于非血瘀證組（P＜0.05）；而微觀血瘀證組、非血瘀證組與健康對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 2組狼瘡性腎炎（LN）患者miR-127-3p、miR-129-5p分子表達(dá)量比較Table 4 Comparison of miR-127-3p and miR-129-5p molecular expression levels between the two groups of LN patients （）

表4 2組狼瘡性腎炎（LN）患者miR-127-3p、miR-129-5p分子表達(dá)量比較Table 4 Comparison of miR-127-3p and miR-129-5p molecular expression levels between the two groups of LN patients （）

①P＜0.05，與非血瘀證組比較；②P＜0.05，與健康對(duì)照組比較

miR-129-5p 1.85±1.09①0.81±0.66 1.53±2.10組別微觀血瘀證組非血瘀證組健康對(duì)照組例數(shù)（例）30 30 15 miR-127-3p 7.38± 3.76①②1.73±2.13 1.27±1.23

2.5 相關(guān)性分析經(jīng)Spearman 秩相關(guān)分析，60例狼瘡性腎炎患者miR-127-3p表達(dá)量與血Cr、BUN、UA、Cys-C 水平呈顯著正相關(guān)（r=0.541，P=0.00；r=0.490，P=0.000；r=0.490，P=0.004；r=0.367，P=0.003）。miR-129-5p表達(dá)量與血Cr、BUN 水平呈顯 著 正 相 關(guān)（r=0.408，P=0.001；r=0.339，P=0.008），而與血UA、Cys-C 水平無(wú)明顯相關(guān)性（r=0.194，P=0.138；r=0.265，P=0.068）。miR-127-3p 表達(dá)量與AI 呈顯著正相關(guān)（r=0.307，P=0.048），而與 CI 無(wú)明顯相關(guān)性（r=0.172，P=0.276）。miR-129-5p 表達(dá)量與AI、CI 均無(wú)明顯相關(guān)性（r=0.267，P=0.087；r=0.145，P=0.359）。

3 討論

狼瘡性腎炎（LN）患者很大一部分合并腎小管間質(zhì)病變，而此病理改變是促使LN 進(jìn)入終末期腎病的最大危險(xiǎn)因素[5]。我們前期研究數(shù)據(jù)證實(shí)此種病理改變與血瘀證密切相關(guān)，也就是說(shuō)出現(xiàn)血瘀證后預(yù)后一般較差，尤其是出現(xiàn)腎小管萎縮及間質(zhì)纖維化等較嚴(yán)重的改變，此時(shí)治療雖有一定效果，但難以逆轉(zhuǎn)，很快便進(jìn)展至終末期腎病，若能早期加以干預(yù)，或可延緩病情進(jìn)展。腎穿刺活檢不能反復(fù)進(jìn)行，故需探索簡(jiǎn)單易行的客觀指標(biāo)來(lái)輔助診斷微觀血瘀證。

本研究結(jié)果顯示，LN 微觀血瘀證患者Cr、BUN、UA、Cys-C 水平均明顯高于非血瘀證患者。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度來(lái)看，Cr、BUN、UA、Cys-C 等指標(biāo)均反映腎功能程度，微觀血瘀證患者病理表現(xiàn)為腎組織硬化、纖維化、萎縮等，這均是病情加重的表現(xiàn)，所以腎功能程度要比非血瘀證組差。從中醫(yī)方面來(lái)講，瘀血痹阻腎絡(luò)，腎失泄?jié)?，久之濁毒?nèi)留，故血肌酐、尿素氮等毒素蓄積體內(nèi)而導(dǎo)致這些腎功能指標(biāo)升高。陳麗貞等[6]研究也證實(shí)，LN 合并血瘀證的患者腎功能指標(biāo)要顯著高于未合并血瘀證患者，這與我們的研究結(jié)果相符合。對(duì)血瘀證患者加以中藥干預(yù)可取得一定的效果。胥曉芳等[7]研究證實(shí)，活血化瘀中藥治療可改善慢性腎臟病患者腎小管間質(zhì)損傷程度，從而能夠起到保護(hù)腎小管功能的作用。

慢性化指數(shù)（CI）能反映腎臟的慢性損害程度，腎小球硬化、纖維性新月體形成、腎小管萎縮、間質(zhì)纖維化等病理表現(xiàn)均屬于微觀血瘀證的范疇，故其CI顯著增高。這與我們前期研究結(jié)果相符合，研究證實(shí)傳統(tǒng)意義上的血瘀證LN 患者CI也顯著增高，并認(rèn)為血瘀證與CI具有一定相關(guān)性[3]?；顒?dòng)性指數(shù)（AI）能反映腎臟活動(dòng)性病變的程度，其水平越高，說(shuō)明微觀血瘀證組患者疾病活動(dòng)性越強(qiáng)，需要更為積極的治療來(lái)控制病情活動(dòng)。若治療不及時(shí)或治療強(qiáng)度不足，活動(dòng)性病變未有效控制，逐漸演變?yōu)橛不⒗w維化等病理改變，進(jìn)而導(dǎo)致CI水平的進(jìn)一步升高。

LN 微觀血瘀證患者miR-127-3p、miR-129-5p 分子表達(dá)量顯著高于非血瘀證患者，且二者與部分腎功能指標(biāo)具有正相關(guān)性。通過(guò)與健康對(duì)照組比較，可以排除LN 疾病本身導(dǎo)致的2 個(gè)分子表達(dá)量改變，說(shuō)明二者與微觀血瘀證具有一定相關(guān)性，并能在一定程度上反映腎功能情況。已有研究證明miR-127 分子能起到保護(hù)腎小管功能的作用[8]；同時(shí)又有研究[9]表明，百令膠囊可能通過(guò)調(diào)控miR-127 的表達(dá)而達(dá)到緩解LN 病情的目的。這說(shuō)明miR-127 分子在腎臟疾病中具有重要作用。Li C 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，miR-129 能參與小鼠腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展。Wang Q 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，miR-129等分子能促進(jìn)糖尿病腎病小鼠腎臟纖維連接蛋白的合成，最終導(dǎo)致纖維化的發(fā)生。腎臟纖維化屬于微觀血瘀證范疇，這也從側(cè)面說(shuō)明miR-129 分子與微觀血瘀證密切相關(guān)。miR-127-3p 表達(dá)量與AI 具有顯著正相關(guān)，說(shuō)明該分子可直接反映腎臟病理活動(dòng)性情況。本研究顯示2 個(gè)分子與CI 并無(wú)直接相關(guān)性，但并不能說(shuō)明二者與腎臟慢性化病變無(wú)關(guān)，畢竟二者在微觀血瘀證組中的表達(dá)是顯著增高的，不排除由于本研究樣本量少，可能存在偏倚等情況，而且并沒(méi)有對(duì)腎臟病理改變情況進(jìn)行細(xì)致的評(píng)估，故確切的結(jié)論有待今后更深入的研究加以證實(shí)。

miRNA 除存在于組織外，也存在于血液、尿液、唾液等體液中，這更方便臨床采集標(biāo)本，實(shí)用性較好。且miRNA 比較穩(wěn)定，有研究發(fā)現(xiàn)標(biāo)本在室溫存放1周或反復(fù)凍融后，miRNA的變化很輕微[12]。由此可見(jiàn)，miRNA 分子是較理想的研究指標(biāo)。本研究的2 個(gè)miRNA 分子已證實(shí)與微觀血瘀證具有一定相關(guān)性，加之檢測(cè)方便、穩(wěn)定，具有作為特異性標(biāo)志物的潛力，但還需后期進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)。