黃梁木維管組織細(xì)胞激光顯微切割技術(shù)體系建立

王雪 龍健梅 董甜甜 鄭丹菁 張立定 彭昌操

摘 要：黃梁木是華南地區(qū)重要的速生用材樹種，其快速的次生生長主要取決于包括形成層細(xì)胞在內(nèi)的維管組織細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)程。為了精準(zhǔn)獲取維管組織形成層細(xì)胞與高質(zhì)量RNA，該研究以黃梁木幼苗為材料，通過石蠟切片與激光顯微切割（LMD）結(jié)合的方法，成功獲得形成層、木質(zhì)部和韌皮部細(xì)胞。結(jié)果表明：優(yōu)化石蠟切片流程，以卡諾/丙酮作為固定劑（丙酮濃度10%～50%），100%正丁醇作為脫水劑和透明劑，之后經(jīng)過梯度滲蠟、包埋、切片、脫蠟后可獲得形態(tài)完整的組織切片且保證了組織細(xì)胞RNA的完整性。調(diào)試LMD參數(shù)，放大倍數(shù)為10×～20×;激光能量為42～44;切割孔徑為4～13;切割速度為16～25;最終獲得的這3種細(xì)胞的RNA完整性（RIN）均大于5.0，即形成層細(xì)胞RIN=5.0，韌皮部細(xì)胞RIN=6.6和木質(zhì)部細(xì)胞RIN=7.9，滿足后續(xù)RNA-seq分析。該研究通過優(yōu)化石蠟切片和LMD參數(shù)，成功建立了黃梁木幼苗莖段維管組織細(xì)胞的激光顯微切割技術(shù)體系，為進(jìn)一步揭示林木樹種維管組織分裂與分化的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：黃梁木，激光顯微切割（LMD），石蠟切片，維管組織，RNA完整性

中圖分類號(hào)：Q944.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2021）08-1226-11

Abstract： Neolamarckia cadamba is one of the most important fast-growing trees for wood production in South China， and its secondary growth depends on the development process of vascular tissue cells including formative cells. In order to obtain the vascular tissue accurately and high quality RNA of N. cadamba， we presented an optimal method to provide high-quality paraffin section for vascular tissues， in which carnoy/acetone was used as fixative （acetone concentration was 10%-50%） and 100% n-Butanol was used as the dehydrating and infiltration agent， followed by gradient infiltration paraffin， embedding， sectioning and dewaxing. Meanwhile， LMD parameters were set with magnification between 10× and 20×， power between 42 and 44， aperture between 4 and 13 and speed between 16 and 25 for acquisition of vascular cells in N. cadamba. Utilizing this protocol， high quality of RNAs were extracted， with RIN （RNA integrity number） value of 5.0， 6.6 and 7.9 in cambium cells， phloem cells and xylem cells， respectively. These RNAs can be used for subsequent RNA-seq analysis. Accordingly， the vascular tissue cells capture system by LMD was established in N. cadamba， which would be of value for revealing the regulatory mechanism of vascular tissue division and differentiation in N. cadamba， and provide a reference for capturing vascular cell in other forest tree species.

Key words： Neolamarckia cadamba， laser microdissection （LMD）， paraffin section， vascular tissue， RNA integrity

維管組織由木質(zhì)部和韌皮部組成，它們?cè)诔跎L期間從原形成層產(chǎn)生，在次生生長期間從形成層中不斷產(chǎn)生（Campbell & Turner，2016）。維管系統(tǒng)延伸到整個(gè)植物體，提供機(jī)械支撐和資源運(yùn)輸（Zhu et al.，2019）。增殖的形成層細(xì)胞是分化木質(zhì)部（木材）和韌皮部細(xì)胞的來源，形成層活性導(dǎo)致莖的增粗和生物量的增加（Elo et al.，2009）。因?yàn)榇蠖鄶?shù)植物生物量由形成層產(chǎn)生，所以對(duì)形成層的獲得和研究可望進(jìn)一步了解林木樹種的發(fā)育機(jī)制并進(jìn)行生物量遺傳改良。黃梁木（Neolamarckia cadamba）是一種大型落葉速生熱帶樹種，分布在南亞和東南亞。在9 a內(nèi)平均高度達(dá)到17 m，胸徑25 cm（Zayed et al.，2014）。它也是膠合板工業(yè)、紙漿和紙張生產(chǎn)的最佳原材料之一。因?yàn)辄S梁木具有快速增長的特點(diǎn)，所以在1972年的世界林業(yè)大會(huì)被稱為“奇跡之樹”（Ouyang et al.，2013）。目前對(duì)林木速生性狀機(jī)理尚不清楚。如何獲得高質(zhì)量的維管組織特異細(xì)胞是了解林木發(fā)育機(jī)制的前提。因?yàn)轫g皮部、形成層與木質(zhì)部組織緊密相連，難以用肉眼精細(xì)分離這3種組織，所以需要尋找一種能夠精確分離組織細(xì)胞的方法獲得這3種不同類型的維管組織，為林木快速生長機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

激光顯微切割技術(shù)（laser microdissection，LMD）是一種從異質(zhì)細(xì)胞群中分離目標(biāo)細(xì)胞的有效技術(shù)。在顯微可視化下利用激光直接從組織切片獲得感興趣的細(xì)胞，用于隨后對(duì)其DNA、RNA和蛋白質(zhì)的研究（Gousset et al.，2019）。LMD技術(shù)最初是為動(dòng)物組織開發(fā)的，但目前通過體系優(yōu)化在植物應(yīng)用也較多。LMD常與冷凍切片和石蠟切片相結(jié)合，收獲的細(xì)胞可以提取DNA、RNA和蛋白質(zhì)，用于分析來自各種細(xì)胞類型的基因組特征、基因表達(dá)和蛋白質(zhì)譜。冷凍切片由于制片流程簡單，可減少RNA損失并提高質(zhì)量，其與LMD結(jié)合已成為一種分離植物細(xì)胞并用于RNA-seq分析的常用手段。利用該組合方式已成功分離柑橘表皮組織、挪威云杉韌皮部與木質(zhì)部不同類型細(xì)胞、大麥胚乳細(xì)胞等，并獲得適合高通量測序分析的高質(zhì)量RNA（Matas et al.，2010; Blokhina et al.，2017;Brandt et al.，2018）。然而，冷凍切片因?yàn)殡y以穩(wěn)定植物組織細(xì)胞中的液泡，以及冷凍、解凍可引起組織完整性的喪失，所以使得靶細(xì)胞的鑒定變得比較困難（Kerk et al.，2003; Nelson et al.，2006）。石蠟切片能更好地保留細(xì)胞結(jié)構(gòu)，故與LMD結(jié)合被廣泛應(yīng)用于草本植物細(xì)胞材料分離，如玉米籽粒早期胚乳細(xì)胞、擬南芥胚胎表皮細(xì)胞、大麥谷粒胚乳傳遞細(xì)胞和珠心突起、水稻根部不同類型細(xì)胞等的分離（Kaspar et al.，2010;Shiono et al.，2014; Sakai et al.，2018; Zhang et al.，2018）?；贚MD植物組織RNA分離過程的困難一般是植物細(xì)胞細(xì)胞壁的存在，次生細(xì)胞壁的木質(zhì)化，完全分化的細(xì)胞存在大的液泡以及大的細(xì)胞間隙（Nakazono et al.，2003; Jyske et al.，2015）。因此，需要保持收獲的組織及細(xì)胞具有結(jié)構(gòu)完整性和穩(wěn)定的細(xì)胞內(nèi)容物，這使得LMD應(yīng)用于植物細(xì)胞，特別是木本植物成為挑戰(zhàn)。目前，LMD結(jié)合石蠟切片應(yīng)用在木本植物的相關(guān)報(bào)道較少，主要是木本植物的非木質(zhì)化組織，例如柑橘珠心胚起始細(xì)胞、蘋果芽分生組織等（賈慧慧，2016;Verma et al.，2019）。不同物種、同一物種不同組織的LMD體系存在一定的差別，主要體現(xiàn)在切片方式（冷凍切片或石蠟切片）及LMD參數(shù)上。因此，為了獲得黃梁木3種不同類型的維管組織（形成層、韌皮部和木質(zhì)部）及其高質(zhì)量RNA供后續(xù)分析，需要在前人建立的不同植物L(fēng)MD體系基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化。

本研究主要從固定劑、脫水劑和透明劑等方面優(yōu)化了黃梁木石蠟切片流程，對(duì)LMD的放大倍數(shù)、激光能量、切割孔徑和切割速度等參數(shù)進(jìn)行調(diào)試，以期獲得黃梁木維管組織3種不同類型的細(xì)胞（形成層細(xì)胞、韌皮部細(xì)胞和木質(zhì)部細(xì)胞）與高質(zhì)量RNA，建立適合黃梁木維管組織的LMD體系，為后續(xù)進(jìn)行3種不同類型細(xì)胞發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組分析提供材料，也為進(jìn)一步挖掘參與黃梁木維管組織發(fā)育的關(guān)鍵基因，探究林木樹種速生性狀和木材品質(zhì)遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試材料黃梁木種子采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)10年生黃梁木母樹，成熟種子經(jīng)無菌水浸泡，于120 r·min-1 的恒溫?fù)u床上40 ℃溫育過夜，之后經(jīng)75%乙醇中浸泡30 s進(jìn)行表面滅菌，無菌水沖洗3次后用5%次氯酸鈉浸泡15 min，無菌水中沖洗3次。將經(jīng)過滅菌處理的種子在無菌濾紙上吸干，并植入MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Li et al.，2019）。40 d后可獲得第一代小植株，選出其中1棵小植株接種于增殖培養(yǎng)基（MS+0.1 mg·L-1 NAA+1 mg·L-1 6-BA）培養(yǎng)，以獲得遺傳背景一致的植物作為實(shí)驗(yàn)材料。30 d后，切取無性擴(kuò)繁的幼嫩側(cè)芽（含莖段）接種于生根培養(yǎng)基（MS+0.1 mg·L-1 NAA），誘導(dǎo)生根，從而形成完整植株。經(jīng)過煉苗處理后的植株移栽到浸潤的泥炭土中。待苗高50 cm左右（約4個(gè)月），取其第二莖節(jié)作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 石蠟切片

1.2.1 固定 取生長旺盛的黃梁木第2莖節(jié)，剪除葉片，用鋒利的單面刀片切成2～3 mm的小莖段，單面刀片提前高壓滅菌并用RNaseZap（購自Thermo Fisher Scientific公司）擦拭，去除RNases污染，立即投入含有固定液的15 mL RNA-free 離心管中，固定劑提前預(yù)冷備用。固定劑處理見表1。固定后，將每種處理取3個(gè)小莖段在通風(fēng)櫥風(fēng)干10 min，放入1.5 mL RNA-free離心管，液氮速凍，進(jìn)行磨樣和RNA提取，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。

1.2.2 脫水 固定后，進(jìn)行組織脫水處理。脫水劑選用乙醇和正丁醇。根據(jù)脫水劑不同所選擇的脫水梯度、脫水溫度以及脫水時(shí)間也不同（表2）。根據(jù)脫水效果來選用最優(yōu)的脫水劑及脫水步驟。

1.2.3 透明 脫水后，進(jìn)行組織透明處理。透明劑種類、透明梯度、透明溫度以及透明時(shí)間如表3所示。透明后，將每種處理取3個(gè)小莖段在通風(fēng)櫥風(fēng)干10 min，放入1.5 mL RNA-free離心管，液氮速凍，進(jìn)行磨樣和RNA提取，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。

1.2.4 滲蠟 滲蠟是石蠟逐步替代透明劑的過程，通過梯度處理和溫度及時(shí)間控制，最終石蠟滲透整個(gè)組織，為石蠟包埋和后續(xù)切片奠定基礎(chǔ)。滲蠟步驟如下：（1）透明劑與石蠟按照1∶1的比例（50%正丁醇/50%石蠟或50%異丙醇/50%石蠟）65 ℃處理1 h;（2）100%的純蠟65 ℃處理1～1.5 h;（3）100%的純蠟65 ℃處理2～2.5 h，2次。

1.2.5 包埋、切片與脫蠟 將含有樣品的石蠟迅速倒入用牛皮紙折疊好的包埋盒內(nèi)，牛皮紙?zhí)崆案邏簻缇矣肦NaseZap擦拭，去除RNases污染;用干凈且高溫的鑷子將樣品在包埋盒里定位，待石蠟冷卻凝固后，放入4 ℃冰箱保存。用單面刀片將包埋好的蠟塊修成規(guī)整的矩形，粘在小木塊上，上機(jī)切片，切片厚度14 μm。切片使用到的毛刷、鑷子、刀片等均經(jīng)過高壓滅菌和RNaseZap擦拭，去除RNases污染;石蠟切片機(jī)，烤片機(jī)等先用70%乙醇滅菌，再用RNaseZap擦拭。切好的蠟帶放在42 ℃ DEPC水（1%焦炭酸二乙酯）上伸展，用載玻片將蠟帶從DEPC水中取出，平展在玻片上，并放在烤片機(jī)42 ℃烘烤，直到水分蒸發(fā)完全。將烘干后的組織玻片經(jīng)過2次二甲苯脫蠟，每次10 min;脫蠟完成后，將組織玻片于通風(fēng)櫥中至二甲苯完全揮發(fā)，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.3 激光顯微切割

使用Leica AS LMD 7000對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行切割收集，在激光顯微切割前用RNaseZap對(duì)承載玻片和收集管的載物臺(tái)進(jìn)行擦拭。對(duì)放大倍數(shù)（magnification）、激光能量（power）、切割速度（speed）、激光切割孔徑（aperture）、脈沖頻率（pulse frequency）和發(fā)射強(qiáng)度（head current）等參數(shù)進(jìn)行調(diào)試，建立黃梁木幼苗莖段維管組織細(xì)胞最佳切割參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同固定劑處理結(jié)果

固定劑的選擇是目標(biāo)產(chǎn)物獲得的關(guān)鍵。本研究選擇3種固定劑對(duì)材料進(jìn)行固定處理，丙酮固定劑處理后的RNA凝膠電泳圖見圖1。由圖1：A可知，RNA有28S、18S兩條帶且無雜帶;而卡諾和FAA處理，RNA無帶，RNA可能完全降解或該處理不能提取出RNA。由圖1：B可知，丙酮固定劑處理后莖段組織形態(tài)，組織細(xì)胞皺縮嚴(yán)重，中間髓部向內(nèi)凹陷;卡諾處理后邊緣細(xì)胞稍微向內(nèi)皺縮，細(xì)胞整體形態(tài)較好;FAA處理后，細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組相似。保證固定后組織細(xì)胞形態(tài)和RNA完整性，是石蠟切片最關(guān)鍵的步驟。因此，選擇丙酮為固定劑，分別用70%乙醇和70%卡諾稀釋丙酮，進(jìn)行后續(xù)脫水和透明。

2.2 不同脫水、透明劑組合處理結(jié)果

脫水劑是與水能在任何比例下均勻混合的有機(jī)溶劑。由于有機(jī)溶劑用于交換植物組織中的水，化學(xué)脫水也可能損害LMD樣品（Polster et al.，2006）。透明是脫水和浸蠟的橋梁，其作用是使透明劑置換組織中的脫水劑，透明劑是石蠟的溶媒，為后續(xù)浸蠟做準(zhǔn)備。本研究分別用70%乙醇和70%卡諾稀釋丙酮作為固定劑，乙醇/異丙醇和正丁醇作為2種脫水、透明劑，共4種組合處理（表4）。瓊脂糖凝膠電泳圖結(jié)果見圖2。4種組合處理均得到較好質(zhì)量的RNA。

將4種處理進(jìn)行后續(xù)浸蠟、包埋、切片（14 μm）、漂片、烤片、脫蠟等步驟后，觀察其顯微結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，以乙醇/異丙醇作為脫水、透明劑，細(xì)胞皺縮較嚴(yán)重，髓部出現(xiàn)空洞，且不能清晰識(shí)別維管束各細(xì)胞，嚴(yán)重影響后續(xù)激光顯微切割目標(biāo)細(xì)胞的識(shí)別與獲?。▓D3：A，B）;以正丁醇作為脫水、透明劑，組織細(xì)胞相對(duì)完整，可清晰識(shí)別各細(xì)胞類型（圖3：C，D）;其中乙醇/丙酮為固定劑時(shí)，髓部出現(xiàn)空洞，不能保證形態(tài)學(xué)完整 （圖3：C）。

因此，選擇以70%卡諾稀釋丙酮作為固定劑，正丁醇作為脫水、透明劑能得到較好的成片效果，且脫水透明后RNA質(zhì)量較好，達(dá)到激光顯微切割上機(jī)前的要求。

2.3 卡諾/丙酮不同配比處理結(jié)果

為進(jìn)一步確定卡諾稀釋丙酮的最適濃度，建立黃梁木幼苗莖段石蠟切片體系，本研究分別用90%、80%、70%、60%、50%、40%的卡諾稀釋丙酮，正丁醇脫水、透明后進(jìn)行RNA提取及凝膠電泳（圖4），石蠟包埋切片后進(jìn)行顯微結(jié)構(gòu)觀察（圖5）。

凝膠電泳結(jié)果表明，被稀釋后的丙酮（濃度10%～60%）作為固定劑，組織經(jīng)過脫水、透明后均得到質(zhì)量較好的RNA（圖4）。由圖5可知，當(dāng)丙酮體積占比大于卡諾時(shí)，切片不完整，髓部出現(xiàn)空洞，細(xì)胞皺縮嚴(yán)重，不能清晰識(shí)別維管束各細(xì)胞。因此，丙酮濃度為10%～50%時(shí)，經(jīng)正丁醇脫水、透明后提取RNA質(zhì)量較好，石蠟切片后細(xì)胞形態(tài)完整，滿足激光顯微切割上機(jī)前的要求。

2.4 激光顯微切割參數(shù)調(diào)試

根據(jù)切片厚度和收集的靶細(xì)胞不同，對(duì)應(yīng)的激光參數(shù)有較大的改變。經(jīng)過參數(shù)調(diào)試，摸索出適合黃梁木形成層、韌皮部和木質(zhì)部的LMD最佳參數(shù)，結(jié)果見表5。圖6展示了形成層、韌皮部和木質(zhì)部切割前，切割路徑和收集管蓋中的細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)圖，說明不同類型細(xì)胞切割參數(shù)不同，其中放大倍數(shù)、激光能量和切割孔徑影響最大。特別是形成層細(xì)胞壁薄，需在更大物鏡倍數(shù)下且嚴(yán)格控制激光能量完成切割。

用Rneasy Micro kit（Qiagen）提取微量RNA，用Agilent RNA 6000 Pico Kit檢測RNA的完整性（圖7）。由圖7可知，形成層RIN=5.0，韌皮部RIN=6.6，木質(zhì)部RIN=7.9。RNA完整性指數(shù) （RNA integrity number）高于5.0的適度降解樣品仍能產(chǎn)生與基因表達(dá)譜相匹配的RNA（Romero et al.，2014）。因此，所建立的黃梁木幼苗莖段維管組織細(xì)胞激光顯微切割體系得到的目標(biāo)產(chǎn)物可用于RNA-seq。

3 討論與結(jié)論

LMD不需要細(xì)胞壁的分解，允許從切片異質(zhì)組織中分離單個(gè)細(xì)胞類型，因此特別適合植物加工。該方法允許精確分離少量細(xì)胞，可用于研究不同組織或細(xì)胞中的基因表達(dá)譜。該技術(shù)不需要通過任何類型的酶消化分離細(xì)胞，不需要細(xì)胞特異性報(bào)告基因，并且允許在切割前數(shù)月存儲(chǔ)固定和包埋組織（Chavan et al.，2018）。根據(jù)感興趣的植物組織性質(zhì)，LMD的樣品制備程序可能會(huì)有很大差異?；贚MD的RNA 分離的成功在很大程度上取決于該方法的上游部分，包括組織固定、脫水、浸蠟等（Gautam & Sarkar，2015）。為了盡量減少RNA的降解，在整個(gè)過程中盡可能縮短時(shí)間，并盡可能保持較低的溫度是至關(guān)重要的（Santi，2019）。LMD的整個(gè)過程包括3個(gè)步驟：（1）樣品處理;（2）顯微切割程序;（3）DNA，RNA或蛋白質(zhì)提取，測序后進(jìn)行后續(xù)分析。

在進(jìn)行LMD之前，樣品處理是獲得DNA，RNA或蛋白質(zhì)良好產(chǎn)量和質(zhì)量的關(guān)鍵步驟。對(duì)于樣品處理要注意以下幾點(diǎn)：（1）進(jìn)行組織切片時(shí)，應(yīng)使用特定試劑清潔所有表面和器械，以去除DNase和RNases。本實(shí)驗(yàn)所用到的特定清潔試劑為RNaseZap，可有效抑制RNases活性。（2）如果使用玻璃容器進(jìn)行染色或脫蠟，則應(yīng)在180 ℃下烘烤至少8 h（Santi，2019）。（3）固定是確保高質(zhì)量RNA產(chǎn)量的最關(guān)鍵步驟。真空是一個(gè)必要的步驟，以促進(jìn)固定劑在組織中的滲透;固定劑的體積應(yīng)至少為樣品體積的五倍（Santi，2019）。（4）完全脫蠟是DNA和RNA提取的必要條件。由于石蠟的去除不充分，可能降低產(chǎn)率。在顯微切割程序過程中還應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：（1）LMD程序不應(yīng)超過1.5 h，更長的時(shí)間會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)分子的產(chǎn)率降低（Aguilar-Bravo & Sancho-Bru，2019）。（2）當(dāng)顯微切割的細(xì)胞移出收集平臺(tái)時(shí)，要非常小心地進(jìn)行，如果收集管帽受到碰撞，樣品可能會(huì)丟失。（3）樣品聚焦不當(dāng)不僅會(huì)干擾靶細(xì)胞的準(zhǔn)確識(shí)別，還會(huì)妨礙切割過程中激光束聚焦，使靶細(xì)胞不能成功捕獲。（4）在低放大率下，激光不夠強(qiáng)大，甚至不夠精確，而高放大率（例如40×）顯著減慢了收集效率。因此，需要對(duì)目標(biāo)組織或細(xì)胞進(jìn)行激光參數(shù)調(diào)試，不同物種不同組織對(duì)應(yīng)的切割參數(shù)不同。（5）可以將含有LMD組織的多個(gè)管合并提取RNA，但應(yīng)在-80 ℃的裂解液中穩(wěn)定≤1個(gè)月（Chavan et al.，2018）。

特別注意的是，固定是確保獲得高質(zhì)量產(chǎn)量的最關(guān)鍵步驟，這取決于固定劑的選擇、滲透時(shí)間的長短、溫度和組織大小。材料的固定一方面是使細(xì)胞的新陳代謝瞬時(shí)停止，保持組織或細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性;另一方面穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)容物及組織中核酸和蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性（Chavan et al.，2018）。固定劑還能達(dá)到使組織變硬從而便于切片，令細(xì)胞易于著色的目的，同時(shí)具有防腐作用等。然而，固定這個(gè)過程會(huì)致命地?fù)p害用于分析小分子的LMD樣品。因?yàn)榈头肿哟x物可溶于固定的化學(xué)試劑中，所以它們可能會(huì)在該過程中發(fā)生離域并丟失（Schad et al.，2005; Schneider & Hoelscher，2007;Li et al.，2012）。由于普遍存在的RNA酶和蛋白酶，固定劑穿透組織所用的時(shí)間越長，RNA或蛋白質(zhì)降解的可能性就越大。福爾馬林（FAA）可以較好地保持細(xì)胞形態(tài)，已被廣泛用于組織固定。然而，分子的完整性可能受核酸和蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)的影響（Aguilar-Bravo & Sancho-Bru，2019）。滲透和固定方法的選擇應(yīng)該是保持組織細(xì)節(jié)和細(xì)胞內(nèi)容物最大恢復(fù)之間的平衡。Kerk et al.（2003）比較了植物組織沉淀和交聯(lián)固定方法對(duì)來自幾個(gè)物種的不同細(xì)胞和組織類型中的RNA回收影響。然而，用沉淀固定劑乙醇-乙酸處理的組織中回收到的RNA比用交聯(lián)固定劑甲醛-乙酸-乙醇（FAA）處理的細(xì)胞中回收到的RNA多2至3倍。這表明大部分細(xì)胞RNA通過FAA處理進(jìn)行交聯(lián)或以其他方式可阻礙提取。以卡諾為固定劑的組織細(xì)胞大多含有中央大液泡，組織含水量高等特點(diǎn)，例如玉米胚乳細(xì)胞、擬南芥胚胎表皮細(xì)胞、葡萄葉韌皮部細(xì)胞等（Sakai et al.，2018;Zhang et al.，2018; Santi，2019）。分生組織細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞體積小，細(xì)胞壁薄，細(xì)胞質(zhì)較濃，沒有中央大液泡，適用于丙酮急劇脫水和滲透處理。以丙酮作為固定劑的主要是植物分生組織，例如蘋果芽分生組織、玉米莖尖分生組織（Verma et al.，2019;Gautam et al.，2019）。本文使用丙酮、卡諾（乙醇∶冰乙酸=3∶1，V/V）、FAA（甲醛∶冰乙酸∶70%乙醇=5∶5∶90，V/V/V） 3種固定劑對(duì)材料進(jìn)行處理，根據(jù)RNA提取和瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，只有丙酮作為固定劑得到了較好質(zhì)量的RNA?？ㄖZ和FAA均無條帶，RNA完全降解或處理后的材料不易提取出RNA。由于丙酮對(duì)組織的脫水性和穿透性較強(qiáng)，經(jīng)過100%丙酮處理后的組織細(xì)胞皺縮嚴(yán)重，破壞了組織完整性，影響后續(xù)LMD可視化，以及對(duì)靶細(xì)胞的識(shí)別。因此，需要對(duì)丙酮加以稀釋，經(jīng)過乙醇和卡諾稀釋后的丙酮作為固定劑均得到較好質(zhì)量的RNA。乙醇也是強(qiáng)力脫水劑，可以快速替換出組織中的水分，直接用100%乙醇處理也會(huì)使細(xì)胞驟然失水發(fā)生皺縮。因此，用100%乙醇稀釋丙酮，在相同處理下，卡諾稀釋丙酮會(huì)得到更好的形態(tài)組織。

關(guān)于脫水與透明劑的選擇，正丁醇能與水、乙醇和二甲苯等溶劑混合，是石蠟的溶媒，兼有脫水和透明的作用。相比乙醇梯度脫水和異丙醇再置換出脫水劑，步驟簡單，節(jié)約了處理時(shí)間。Zhang et al.（2018）研究發(fā)現(xiàn)玉米?？梢栽?00%正丁醇中，4 ℃儲(chǔ)存長達(dá)9個(gè)月而不會(huì)損失組織完整性或RNA質(zhì)量。同時(shí)，在65 ℃下進(jìn)行脫水、透明，高溫促進(jìn)了試劑更快滲入組織，可為下一步浸蠟做好預(yù)熱處理。

LMD精確分離靶細(xì)胞，可用于后續(xù)高通量數(shù)據(jù)采集和生物信息學(xué)分析。目前基因表達(dá)分析通常通過基于微陣列或下一代測序（NGS）技術(shù)的全基因組表達(dá)譜（全基因組測序、靶向基因組測序、RNA測序和核糖體圖譜分析）進(jìn)行。LMD與NGS技術(shù)的結(jié)合是研究細(xì)胞和組織特異性過程的有效方法（Abbott et al.，2010;Jyske et al.，2015）。此外，除了轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究外，代謝物分析正在成為表征特異組織（主要是在植物中）的重要過程（Yi et al.，2012;Fang & Schneider，2014;李勝男等，2020）。目前，對(duì)于木本植物維管形成層發(fā)生，維管細(xì)胞分裂與分化的調(diào)控機(jī)制有了一定的研究進(jìn)展（Elo et al.，2009;Campbell & Turner，2016），而LMD應(yīng)用于木本植物維管組織細(xì)胞的研究，可望進(jìn)一步揭示植物生長發(fā)育的調(diào)控機(jī)制。

本文通過優(yōu)化石蠟切片流程，調(diào)試LMD參數(shù)，建立了黃梁木幼苗莖段維管組織細(xì)胞的激光顯微切割技術(shù)體系，分別獲得形成層、韌皮部和木質(zhì)部細(xì)胞并得到高質(zhì)量RNA，滿足后續(xù)RNA-seq分析。該技術(shù)保留了足夠的視覺效果識(shí)別感興趣的特定組織或細(xì)胞，同時(shí)從獲得的靶細(xì)胞中最大限度回收到RNA，為LMD結(jié)合石蠟切片在其他木本植物上的應(yīng)用提供了技術(shù)參考。

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（責(zé)任編輯 何永艷）