精子發(fā)生調(diào)控因子重組人HSF5的原核表達、活性檢測與結(jié)構(gòu)預(yù)測

鐘洪莉，肖城良，史祥睿，代宇婕，劉 威*，張慶華*

(1.陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院 婦產(chǎn)科，重慶 400042；2.華中科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430065；3.沈陽化工大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院， 遼寧 沈陽 110021； 4.陸軍軍醫(yī)大學(xué) 全軍免疫研究所， 重慶 400038)

熱休克轉(zhuǎn)錄因子(heat shock transcription factors，HSFs)是真核生物中一個重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，在細胞應(yīng)激、分化、組織發(fā)育與機體繁殖中發(fā)揮了重要作用[1]。人類基因組共編碼6種HSFs：HSF1、HSF2、HSF4、HSF5、HSFX和HSFY，均可識別并結(jié)合目的基因啟動子中的熱休克元件(heat shock elements，HSEs)。男性不育是一個全球性的健康問題，精子質(zhì)量下降是男性不育的主要原因，HSF家族與精子發(fā)生關(guān)系密切[2]。最新研究報道hsf5編碼基因缺失的斑馬魚，雄性出現(xiàn)嚴重不育[3]。由于之前HSF5的相關(guān)研究甚少，阻礙了人們對于其活性機制的進一步研究。與其他HSFs類似，HSF5包含多個結(jié)構(gòu)域，其中有一個高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。目前已知，該蛋白僅在睪丸中表達，但具體功能未知。本研究目的在于獲得可溶性重組人源HSF5(recombinant human HSF5,rhHSF5)蛋白的表達，并對其與熱休克元件結(jié)合的結(jié)構(gòu)模型進行預(yù)測，為進一步解析HSF5結(jié)構(gòu)、揭示HSF5的調(diào)控機制提供條件，為不育的治療干預(yù)提供可能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒：質(zhì)粒pET-22b(+)、大腸桿菌菌株DH5α和菌株BL21(DE3)為本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑盒：包含HSEs的寡聚核苷酸(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)；質(zhì)粒抽提試劑盒(Omega公司)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、考馬斯亮藍染色液、Bradford蛋白質(zhì)量濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；蛋白marker、DNA ladder(賽默飛世爾科技有限公司)；鼠抗His-Tag一抗(Cell Signaling公司)、羊抗鼠抗體二抗(Elabscience公司)。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建：通過多序列對比，選取人源HSF5蛋白DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-binding domain, DBD)部分氨基酸序列，交由華大公司進行基因合成并構(gòu)建重組質(zhì)粒。

1.2.2 重組蛋白的小劑量誘導(dǎo)表達：將合成的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到 BL21(DE3)菌株，涂布于含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，挑取單克隆擴大培養(yǎng)過夜。次日，吸取200 μL菌液接種于含有100 μg/mL氨芐青霉素的20 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)4 h。到時間后吸取1 mL菌液于含有100 μg/mL氨芐青霉素的100 mL液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)3 h。到時間后各吸取5 mL菌液到6個小型錐形瓶中，分別加入終濃度0、0.2、0.4、0.6、0.8和1 mmol/L異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，37 ℃、200 r/min誘導(dǎo)表達4 h。

1.2.3 Western blot檢測rhHSF5的表達：將蛋白樣品進行上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，用牛奶封閉后一抗孵育過夜，PBST洗3次后進行二抗孵育1 h，PBST洗膜后ECL顯色，并置于VILBER成像儀中曝光，后定量分析條帶。

1.2.4 rhHSF5的大劑量誘導(dǎo)表達：根據(jù)小劑量表達的結(jié)果，將合成的重組質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化和擴大培養(yǎng)后取40 mL菌液接種于4L LB液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL氨芐青霉素)，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)3 h后加入終濃度0.8 mmol/L IPTG進行誘導(dǎo)，37 ℃、200 r/min再振蕩培養(yǎng)4 h。

1.2.5 rhHSF5的純化

1.2.5.1 Ni離子親和層析純化：收獲誘導(dǎo)表達的菌液，6 000 r/min離心15 min，收集細菌沉淀，重懸于裂解緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4，50 mmol/L Na2HPO4，500 mmol/L NaCl，25 mmol/L咪唑，pH 8.0)中。800 bar(1 bar=100 kPa)高壓破碎后，4 ℃，9 000 r/min離心1 h，取上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾后，上樣于用裂解緩沖液平衡好的HisTrap親和層析柱。使重組蛋白羧基端的His6標簽結(jié)合于固化的Ni樹脂，再用洗滌緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4，50 mmol/L Na2HPO4，40 mmol/L咪唑，5%甘油，pH 8.0)洗掉雜蛋白，最后用洗脫緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4，50 mmol/L Na2HPO4，40 mmol/L咪唑，5%甘油，pH 8.0)洗脫目的蛋白。

1.2.5.2 凝膠過濾層析純化：上一步收得的目的蛋白加入蛋白濃縮管中于4 ℃，5 000 r/min離心至樣品體積濃縮至約1.5 mL，上樣于Hiload 16/60 Superdex75凝膠過濾層析柱，用洗脫緩沖液(150 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris，1 mmol/L DTT，0.2 mmol/L EDTA，5%甘油，pH 8.0)洗1.5個柱體積，收集洗脫峰。

1.2.5.3 純化蛋白的SDS-PAGE檢測：將上一步收集的洗脫峰蛋白取20 μL，同離心后的沉淀、抽濾后得到的上清液、Ni離子親和層析純化的穿過峰部分、洗滌緩沖液沖洗部分、洗脫峰部分，各取20 μL加入5 μL考馬斯亮藍染色液，于沸水中加熱5 min后，各取5 μL加入12% SDS-PAGE上樣孔。

1.2.6 凝膠遷移實驗檢測重組蛋白活性：將純化后收集的蛋白加入蛋白濃縮管中于4 ℃，5 000 r/min離心30 min，隨后測其蛋白濃度以及熱休克元件濃度。準備7支0.2 mL PCR小管，每支按比例依次加入凝膠遷移實驗(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)緩沖液、rhHSF5蛋白、包含HSEs的寡聚核苷酸。使用PCR儀30 ℃孵育20 min后每支加入10×上樣緩沖液2 μL?；靹蚝竺恐Ц魅?0 μL上樣于加入GoldView染料的2%瓊脂糖凝膠上，進行電泳。

1.2.7 HSF5蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測：采用Modeller軟件[4-5]，參考蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank, PDB)，以本實驗室所解析的人源HSF1(PDB ID 5HDG)、HSF2(PDB ID 5HDK)[6]與HSF4(PDB ID 6J6V)[7]結(jié)構(gòu)為模版進行HSF5-DBD的同源建模。使用分子可視化程序(visual molecular dynamics, VMD)對建模后的HSF5模型進行三點式可變換分子間勢能函數(shù)(transferable intermolecular potential 3 points, TIP3P)模型溶劑化處理，再使用并行分子動力學(xué)(NAMD)程序，采用哈佛高分子力學(xué)化學(xué)(chemistry at Harvard macromolecular mechanics, CHARMM)力場、周期性邊界條件與粒子網(wǎng)格埃瓦爾德(particle Mesh Ewald, PME)靜電相互作用算法，對該體系進行能量最小化(100步)與壓力-體積-溫度(pressure-volume-temperature, PVT)平衡(時長500 ps)，提取最后構(gòu)象作為最終模型。

1.2.8 HSF5結(jié)合HSE復(fù)合物的結(jié)構(gòu)預(yù)測：以人源HSF2與HSE(12 bp，含兩個蛋白結(jié)合位點)的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID 5D8K)[8]為模版，將其中的兩個HSF2-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域用上一步所獲得的HSF5模型替換，并使用相同方式對替換后的模型進行分子動力學(xué)模擬，提取最后構(gòu)象作為最終模型。使用VMD與蛋白可視化程序(PyMOL)對模擬結(jié)果進行了可視化處理與分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 重組人源HSF5蛋白的小劑量誘導(dǎo)表達

IPTG濃度為0.2、0.4、0.6、0.8和1 mmol/L時，rhHSF5蛋白均有表達(圖1)。

M.protein marker；1-6.sediment with 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1 mmol/L IPTG induction; 1*-6*.supernatant with 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1 mmol/L IPTG induction圖1 重組人源HSF5(rhHSF5)蛋白小劑量表達(考馬斯亮藍染色)Fig 1 Low dose protein expression of recombinant human HSF5(rhHSF5) (Coomassie brillant blue staining)

2.2 Western blot檢測重組蛋白的表達

IPTG濃度為0.8 mmol/L時，rhHSF5蛋白表達量較多(圖2)。

*P<0. 05 compared with IPTG in 0 mmol/L圖2 rhrhHSF5在不同濃度IPTG的表達Fig 2 Expression of rhHSF5 at different concentrations of

2.3 rhHSF5蛋白的大劑量誘導(dǎo)表達和純化

凝膠過濾柱目標蛋白洗脫峰出現(xiàn)在76.3 mL處,此位置對應(yīng)于HSF5-DBD的單體分子質(zhì)量(圖3A)。SDS-PAGE及Western blot結(jié)果顯示目的蛋白的表觀分子質(zhì)量為14 ku，與根據(jù)氨基酸序列所計算的理論分子質(zhì)量(14.272 ku)相符(圖3B)。每升菌液純化過程中蛋白含量情況如(表1)所示。

表1 每升菌液純化過程中蛋白質(zhì)含量情況Table 1 Protein content per liter of bacterial fluid during purification

M.protein marker；1.sediment；2.solution supernatant；3.through the peak part；4.wash part；5.elution peak protein of nickel ion affinity chromatography；6.elution peak protein of gel filtration chromatography

從電泳及Western blot結(jié)果來看，rhHSF5蛋白的純度在90%以上，已達到蛋白質(zhì)結(jié)晶的條件。

2.4 rhHSF5蛋白與熱休克元件凝膠遷移實驗(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)

在500～750 bp之間有明顯DNA遷移條帶，并且隨著蛋白濃度的增加，條帶有越亮的趨勢 ，尤其以429.6 μg/mL rhHSF5最明顯(圖4)。

M.DNA ladder；1.28.4 μg/mL DNA；2.53.7 μg/mL HSF5+28.4 μg/mL DNA；3.107.4 μg/mL HSF5+28.4 μg/mL DNA；4.214.8 μg/mL HSF5+28.4 μg/mL DNA；5.268.5 μg/mL HSF5+28.4 μg/mL DNA；6.322.2 μg/mL HSF5+28.4 μg/mL DNA；7.429.6 μg/mL HSF5+28.4 μg/mL DNA圖4 EMSA檢測rhHSF5與熱休克元件的結(jié)合Fig 4 Binding activity detection of rhHSF5 protein and heat shock element by EMSA

2.5 HSF5三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測

HSF5與HSF1、2、4之間的序列對比及HSF5三級結(jié)構(gòu)模型(圖5A,B)。

2.6 HSF5與HSE結(jié)合的復(fù)合物結(jié)構(gòu)預(yù)測

HSF5-HSE復(fù)合物的模型(圖5C,D)。

圖5 HSF5與HSF1、HSF2、HSF4序列對比(A)、HSF5蛋白的三級結(jié)構(gòu)特點(B)、HSF5與HSE結(jié)合的模型預(yù)測(C)和HSF5與HSE結(jié)合的部分位點相互作用分析(D)

3 討論

精液質(zhì)量和精子濃度下降是過去幾十年在全世界范圍內(nèi)觀察到的男性不育主要因素，至今仍不清楚睪丸內(nèi)那些分子參與了精子發(fā)生。在HSF的相關(guān)研究中， 目前主要集中在HSF1與HSF2上。例如，Hsf1敲除的雄性小鼠與野生型小鼠相比減少了20%的精子[9-11]， 而Hsf2的敲除會導(dǎo)致雄性小鼠的正常精子水平更低[12-13]。雖然分別敲除了Hsf1或Hsf2的小鼠仍具備生殖能力，但同時敲除了這兩個轉(zhuǎn)錄因子則導(dǎo)致雄性小鼠的完全不育[14]。然而，對于HSF5與HSFY，這兩個僅在睪丸中表達的HSF家族成員的研究卻鮮有報道。最近，通過CRISPR/Cas9技術(shù)，獲得了hsf5缺失的斑馬魚。觀察到在第一次減數(shù)分裂前期精子發(fā)生過程中，細線期和粗線期細胞積累，而減數(shù)分裂完成后細胞凋亡增加，同時相當多參與細胞周期、凋亡，蛋白修飾和信號傳導(dǎo)的基因在生殖器官中表達失調(diào),這些實驗數(shù)據(jù)表明HSF5在精子發(fā)生的早期階段發(fā)揮了至關(guān)關(guān)鍵的作用[3]。從這個意義上來說，深入探討HSF5的作用機制很可能為揭示男性不育病因提供重要依據(jù)，還可為臨床相關(guān)診療提供新思路與新方法。

對于HSF5這個以前研究甚少的HSF家族成員而言，第一步工作是分子特征鑒定，包括對其生化活性、 三維結(jié)構(gòu)與分子功能的測定。本研究通過原核表達系統(tǒng)成功獲得可溶性的、高純度的且具有HSE結(jié)合活性的rhHSF5蛋白，并通過同源建模和分子動力學(xué)模擬的方法預(yù)測了它與熱休克元件結(jié)合的三維模型。由于DBD是HSF家族成員中最保守的一個結(jié)構(gòu)域，HSF5與HSF1、2、4之間的序列同源度均在50%以上，使得同源建模的可靠性得以保證。該模型基本上與HSF1、2、4的晶體結(jié)構(gòu)一致，都呈現(xiàn)典型的winged helix-turn-helix的核心結(jié)構(gòu)。值得關(guān)注的是，在HSF5的結(jié)構(gòu)中，第二個螺旋(α2)被打斷，中間插入了一段較長的自由卷曲。這是由于相比于HSF1、2、4，HSF5序列中，第49-65位殘基間插入了一段富含甘氨酸的序列。由于甘氨酸沒有側(cè)鏈，這一段序列呈現(xiàn)出高柔性的自由卷曲構(gòu)象。雖然位于DNA結(jié)合面的外側(cè)，但有可能通過參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用而影響HSF5對于下游調(diào)控基因的選擇。換而言之，HSF5的調(diào)控對象很可能不同于HSF1、2、4，而其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)就在于這一段高度柔性的插入序列?？傊?，本研究為后續(xù)進一步解析人源HSF5蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，揭示其調(diào)控機制及其在精子發(fā)生過程中的具體功能奠定了堅實基礎(chǔ)。