水稻葉片衰老基因LPS1的克隆與功能研究

褚曉潔 蘆濤 葉涵斐 王盛 林晗 吳先美 何瑞 嚴(yán)鋼 王躍星 李三峰 路梅 胡海濤,* 楊窯龍,* 饒玉春,*

水稻葉片衰老基因的克隆與功能研究

褚曉潔1蘆濤1葉涵斐1王盛1林晗1吳先美2何瑞2嚴(yán)鋼1王躍星2李三峰2路梅1胡海濤1,*楊窯龍2,*饒玉春1,*

(1浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 浙江金華 321004；2中國(guó)水稻研究所國(guó)家水稻改良中心/水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 杭州 310006；*通信聯(lián)系人, E-mail:ryc@zjnu.cn, yangxiao182@126.com, haitao-hu@zjnu.cn)

【目的】早衰突變體是研究早衰機(jī)制的良好載體，對(duì)于探究早衰的遺傳機(jī)理與作用機(jī)制及提高水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要作用?！痉椒ā勘狙芯坷肊MS誘變獲得了一個(gè)早衰突變體，并對(duì)該突變體及其野生型進(jìn)行表型觀(guān)察、細(xì)胞學(xué)及組織化學(xué)分析、生理生化分析、遺傳分析、基因定位和激素處理?！窘Y(jié)果】的葉片從3葉期開(kāi)始發(fā)黃，成熟期株高、有效分蘗數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重等極顯著降低。電鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn)葉表面光滑，硅質(zhì)化突起和葉綠體數(shù)目減少、片層結(jié)構(gòu)紊亂。生理生化分析表明中有大量的活性氧積累，同時(shí)伴有蛋白質(zhì)的降解、細(xì)胞膜的損傷以及大規(guī)模的細(xì)胞死亡。遺傳分析表明該早衰表型受單隱性核基因控制，并且其在第5染色體上編碼了一個(gè)泛素結(jié)合酶。亞細(xì)胞定位結(jié)果證明LPS1蛋白在細(xì)胞質(zhì)與核中均有表達(dá)。外源激素處理發(fā)現(xiàn)，對(duì)外源激素的處理更為敏感，且突變促進(jìn)了ABA合成相關(guān)基因的表達(dá)?！窘Y(jié)論】突變使水稻ABA合成信號(hào)途徑異常，進(jìn)而引發(fā)H2O2等一系列與衰老相關(guān)生理指標(biāo)的異常變動(dòng)，導(dǎo)致過(guò)早衰老，最終造成水稻產(chǎn)量嚴(yán)重降低。

水稻；早衰；遺傳分析；亞細(xì)胞定位；激素

植物的衰老是植株在生長(zhǎng)發(fā)育的最后階段自發(fā)啟動(dòng)的一種程序性細(xì)胞死亡（programmed cell death，PCD）的過(guò)程[1]。這一過(guò)程可以使衰老部位中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物等轉(zhuǎn)移至其他部位繼續(xù)參與植物體的生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育起著不可替代的作用[2]。衰老的有序進(jìn)行在很大程度上保障了作物的產(chǎn)量及品質(zhì)安全。植物衰老的主要表現(xiàn)形式是葉片衰老[3-4]，葉片是水稻進(jìn)行光合作用和呼吸作用最為重要的源器官，直接關(guān)系著水稻的產(chǎn)量和質(zhì)量安全。葉片發(fā)生早衰是影響水稻高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的重要決定因素之一[5]，水稻葉片發(fā)生早衰會(huì)嚴(yán)重影響葉片進(jìn)行光合作用的效率，進(jìn)而制約水稻產(chǎn)量的提高。因此，深入研究水稻葉片早衰的調(diào)控模型和分子機(jī)制具有重要意義。

目前對(duì)水稻葉片衰老的研究主要是利用衰老突變體鑒定葉片衰老相關(guān)基因（senescence- associated genes, SAGs）來(lái)解析水稻衰老的分子機(jī)制，在植物葉片衰老數(shù)據(jù)庫(kù)LSD 3.0（https:// bigd.big.ac.cn/lsd/index.php）中共收集了5853個(gè)與衰老相關(guān)的基因[6]，其中有188個(gè)是在水稻中鑒定的，這表明調(diào)控植物葉片衰老的基因涉及復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)SAGs所屬功能的不同，水稻葉片衰老相關(guān)基因主要分為轉(zhuǎn)錄因子基因（[7]、[8]、[9]、[10]、[11]等）、葉綠體發(fā)育及葉綠素降解相關(guān)基因（[12]、[13]、[14]、[15]等）、激素代謝相關(guān)基因（[16]、[16]、[17]、[18]、[19]、[20]等）和蛋白酶或物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)代謝相關(guān)基因（[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、與[26]等）五類(lèi)。

水稻生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程是一個(gè)不斷對(duì)抗和適應(yīng)生物脅迫與非生物脅迫等不利環(huán)境的過(guò)程，這一過(guò)程由基因控制，并受內(nèi)外部環(huán)境因素的影響和誘導(dǎo)。植物激素在調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育、參與植物抗逆性方面有著不可缺少的作用[27]。一般來(lái)說(shuō)，脫落酸（abscisic acid，ABA）[28]、乙烯（ethylene，ETH）[29]和茉莉酸類(lèi)物質(zhì)（jasmonates，JAs）[30]等激素可加快葉片衰老，細(xì)胞分裂素（cytokinin，CTK）[31]、生長(zhǎng)素（auxins，IAA）[32]和赤霉素(gibberellins，GAs)[33]等激素可以延緩葉片衰老[34]。ABA是植物生長(zhǎng)發(fā)育、抵抗逆境的重要激素，具有調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)、抑制種子萌發(fā)以及加快衰老等效應(yīng)[35-36]。研究發(fā)現(xiàn)，ABA可以有效抑制水稻幼苗地上部的生長(zhǎng)[37]。低濃度的ABA可以促進(jìn)初生根的生長(zhǎng)，而高濃度的ABA則抑制初生根的生長(zhǎng)[38-39]。Hung等[40]研究發(fā)現(xiàn)，ABA可以通過(guò)誘導(dǎo)H2O2的產(chǎn)生，引起植物葉片的衰老。水稻離體葉片進(jìn)行ABA處理后，引起離體葉片中H2O2和MDA含量顯著升高，葉綠素含量下降，進(jìn)而加速葉片衰老[41]。然而現(xiàn)有研究中，水稻ABA信號(hào)途徑中僅有少數(shù)基因的功能被清晰闡釋?zhuān)P(guān)于控制ABA合成和代謝相關(guān)基因尚缺乏充分研究。

為進(jìn)一步研究水稻葉片衰老的分子機(jī)制，同時(shí)探究激素參與水稻衰老的調(diào)控機(jī)理，本研究利用EMS誘變獲取一個(gè)葉片早衰突變體，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行表型考查、生理生化分析、組織學(xué)及細(xì)胞學(xué)分析、基因精細(xì)定位以及表達(dá)分析等，以期進(jìn)一步解析的功能，為今后建立水稻葉片衰老的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

利用甲基磺酸乙酯（EMS）誘變龍粳31，從其突變體庫(kù)中篩選出一個(gè)葉片早衰突變體，通過(guò)多代自交發(fā)現(xiàn)其早衰表型可穩(wěn)定遺傳，將其命名為（）。將與秈稻品種浙輻802雜交，利用F1與F2群體進(jìn)行遺傳分析與基因定位。2016–2020年，將材料種植于浙江省金華市浙江師范大學(xué)試驗(yàn)田、中國(guó)水稻研究所杭州試驗(yàn)基地以及海南陵水試驗(yàn)基地，常規(guī)水肥管理。

1.2 農(nóng)藝性狀的觀(guān)察統(tǒng)計(jì)

在水稻成熟期選取野生型和各10株，對(duì)株高、分蘗、結(jié)實(shí)率、粒長(zhǎng)、粒寬、粒厚、千粒重等農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查，并利用GraphPad Prism 6軟件及Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 葉綠素含量測(cè)定

取分蘗期長(zhǎng)勢(shì)一致的野生型和葉片，去除葉脈，分別稱(chēng)取野生型和倒一、倒二、倒三葉0.3 g，每組3份樣品。置于10 mL離心管中，并加入5 mL 95%乙醇，4℃下避光處理24 h，期間輕微上下顛倒數(shù)次，使光合色素充分浸提在溶液中。取上清，分別測(cè)定其在波長(zhǎng)為665 nm、649 nm和470 nm處的吸光值，然后參照Lichtenthaler[42]的方法計(jì)算葉綠素a、葉綠素b以及類(lèi)胡蘿卜素的含量。

1.4 水稻葉片電鏡觀(guān)察

1.4.1 水稻葉片掃描電鏡觀(guān)察

取分蘗期野生型和倒2葉葉片，去除葉脈，剪成0.5 cm的小段，立即置于裝有2.5%戊二醛固定液的2 mL離心管中，抽真空1～2 h使樣品沉于管底，4℃下保存過(guò)夜。二次固定、脫水、臨界點(diǎn)干燥、鍍膜及電鏡觀(guān)察交由浙江大學(xué)電鏡中心完成。

1.4.2 水稻葉片透射電鏡觀(guān)察

取樣及固定方法同1.4.1，4℃下過(guò)夜固定后，委托浙江大學(xué)電鏡中心完成漂洗、脫水、包埋、切片、染色及電鏡觀(guān)察等工作。

1.5 組織化學(xué)分析

1.5.1 H2O2積累檢測(cè)

使用二氨基聯(lián)苯（Diamino benzidine, DAB）可以直接觀(guān)察水稻葉片組織中H2O2積累。參考游均等[43]進(jìn)行DAB染色，取分蘗期野生型和倒2葉葉片完全浸泡在0.5 mg/mL DAB染液中，抽真空15～30 min，室溫孵育過(guò)夜。倒掉染液，用清水沖洗干凈，將葉片移入含有95%乙醇的管中，沸水浴煮至完全脫色后拍照。

1.5.2 氧自由基含量檢測(cè)

使用氮藍(lán)四唑（nitrotetrazolium blue chloride, NBT）染液可以直接反映水稻葉片中細(xì)胞內(nèi)的氧自由基含量。參考游均等[43]進(jìn)行NBT染色，取分蘗期野生型和倒2葉葉片完全浸泡在1 mg/mL NBT染液中，抽真空15～30 min，室溫孵育過(guò)夜。倒掉染液，用清水沖洗干凈，將葉片移入含有95%乙醇的管中，沸水浴煮至完全脫色后拍照。

1.5.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

取分蘗期的野生型和相同部位的葉片，放入裝有2 mL FAA固定液的離心管中[44]。抽真空至樣本沉淀，然后按照Promega公司的TUNEL（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 生理指標(biāo)測(cè)定

取分蘗期野生型和倒2葉葉片，采用蘇州格銳思生物科技有限公司試劑盒，測(cè)定過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性，以及過(guò)氧化氫（H2O2）和丙二醛（MDA）的含量等與衰老相關(guān)的生理指標(biāo)，每個(gè)樣品3次重復(fù)。

1.7 遺傳分析與基因定位

將與秈稻品種浙輻802進(jìn)行正反交，獲得F1代，F(xiàn)1代自交獲得F2代，觀(guān)察F1和F2表型，并統(tǒng)計(jì)F2代正常表型與早衰表型分離比，進(jìn)行遺傳分析。采用TPS法提取水稻葉片DNA。利用本實(shí)驗(yàn)室已有的平均分布于12條染色體上的268對(duì)SSR標(biāo)記引物，對(duì)親本以及F1進(jìn)行多態(tài)性分析。選取多態(tài)性較好的分子標(biāo)記，利用F2群體中與突變體表型一致的植株的DNA，對(duì)目的基因進(jìn)行連鎖分析。將目的基因初步定位到染色體的某一個(gè)區(qū)域內(nèi)，并繼續(xù)設(shè)計(jì)新的分子標(biāo)記，用于精細(xì)定位。通過(guò)對(duì)已公布的日本晴序列與秈稻9311序列的差異比對(duì)，利用Primer 3網(wǎng)站(https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)在線(xiàn)設(shè)計(jì)引物，進(jìn)一步對(duì)目的基因進(jìn)行基因定位。相關(guān)引物序列見(jiàn)表1。

1.8 候選基因分析及測(cè)序

精細(xì)定位將目的基因縮小在一個(gè)小區(qū)間內(nèi)，根據(jù)水稻基因注釋網(wǎng)站RGAP（Rice Genome Annotation Project, http://rice.plantbiology.msu.edu/），分析該區(qū)段內(nèi)所有的開(kāi)放閱讀（ORF, open reading frame），找到候選基因，設(shè)計(jì)測(cè)序引物對(duì)野生型和的候選基因序列進(jìn)行測(cè)序，利用SeqMan軟件進(jìn)行序列比，找到突變位點(diǎn)，構(gòu)建遺傳圖譜。

1.9 亞細(xì)胞定位

為了檢測(cè)蛋白表達(dá)的位置，我們利用-F和-R引物對(duì)擴(kuò)增的基因的CDS為模板，進(jìn)一步運(yùn)用帶有相關(guān)接頭的引物擴(kuò)增目的片段，通過(guò)In-fusion酶連接Ⅰ和Ⅰ線(xiàn)性化的載體，獲得載體。通過(guò)農(nóng)桿菌（EHA105）介導(dǎo)煙草的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，利用激光掃描共聚焦顯微鏡觀(guān)察綠色熒光蛋白。引物序列參見(jiàn)表1。

1.10 外源激素處理

將野生型與突變體成熟的種子去殼后，用70%的酒精消毒2 min，再用30%的次氯酸鈉溶液消毒30 min，然后用蒸餾水沖洗干凈，分別接種于含有0、0.2 μmol/L和0.25 μmol/L ABA的1/2 MS培養(yǎng)基上，放在人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d后統(tǒng)計(jì)根長(zhǎng)和株高并拍照。培養(yǎng)箱光周期為光照14 h/黑暗10 h，溫度為30℃，相對(duì)濕度為70%。

1.11 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

利用AXYGEN試劑盒提取水稻植株總RNA，使用TOYOBO試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用qRT-PCR檢測(cè)野生型與突變體中葉綠體相關(guān)基因與ABA代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平，以水稻為內(nèi)參基因。反應(yīng)體系包括1 μL cDNA模板，5 μL 2×SYBR混合液，上下游引物各1 μL，ddH2O補(bǔ)至10 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃下30 s，95℃下5 s，55℃下10 s，72℃下5 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)3次重復(fù)，以2計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)水平。運(yùn)用GraphPad Prism 6軟件和Excel 2010軟件分析數(shù)據(jù)，通過(guò)測(cè)驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。qRT-PCR所用引物見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 早衰突變體lps1的表型鑒定及農(nóng)藝性狀統(tǒng)計(jì)

無(wú)論是在浙江金華、杭州還是在海南種植，早衰表型都非常穩(wěn)定。自然生長(zhǎng)條件下，3葉期時(shí)，野生型與的株高無(wú)顯著差異（圖1-A），但開(kāi)始出現(xiàn)葉片發(fā)黃表型（圖1-B）。隨著植株的生長(zhǎng)發(fā)育，葉片發(fā)黃的面積逐漸變大，葉尖開(kāi)始枯死，但基部持綠。分蘗期，的株高變矮，這種表型一直持續(xù)到成熟期（圖1-C、D）。

此外，在成熟期的株高、有效分蘗、結(jié)實(shí)率、千粒重等均極顯著降低（圖1-F～I(xiàn)）；在粒型方面，的粒長(zhǎng)和粒厚也顯著低于野生型（圖1-E、J～L），這也是導(dǎo)致其千粒重顯著下降的重要原因。

表1 本研究所用引物及序列

2.2 lps1的葉綠素含量及相關(guān)基因表達(dá)分析

葉綠素在光合作用中起著核心作用。為了探究的葉黃表型是否與葉綠素水平相關(guān)，我們測(cè)定了分蘗期在未出現(xiàn)黃葉表型的倒1葉（L1），剛出現(xiàn)黃葉表型的倒2葉（L2）和明顯出現(xiàn)黃葉表型的倒3葉（L3）葉綠素含量（圖2-A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除類(lèi)胡蘿卜素的含量明顯增加外，的葉綠素a和葉綠素b含量均極顯著降低，并隨著葉片的衰老下降。而野生型中葉綠素含量無(wú)明顯變化（圖2-B～D）?？偟膩?lái)講，的葉綠素含量顯著降低。

A?3葉期植株表型(標(biāo)尺=3 cm)；B?3葉期葉片表型(標(biāo)尺=1 cm)；C?分蘗期表型(標(biāo)尺=6 cm)；D?成熟期表型(標(biāo)尺=8 cm)；E?籽粒表型(標(biāo)尺=10 cm); F～I(xiàn)?野生型與lps1的農(nóng)藝性狀(株高、分蘗、結(jié)實(shí)率、千粒重)；J～L, 粒厚、粒長(zhǎng)和粒寬。*和**分別表示野生型與lps1在0.05和0.01水平上差異顯著。

Fig.1.Phenotype and agronomic traits of the wild type and.

為了進(jìn)一步探索中葉綠素水平降低的原因，我們對(duì)分蘗期野生型和倒2葉葉綠素代謝相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)中與葉綠素合成相關(guān)的基因的表達(dá)水平均極顯著下調(diào)，而與葉綠素降解相關(guān)的基因僅的表達(dá)水平顯著下調(diào)，的表達(dá)沒(méi)有顯著差異（圖2-E）。說(shuō)明基因突變可以影響水稻葉片中葉綠素的合成與降解，進(jìn)而誘導(dǎo)葉片發(fā)生衰老。

A?分蘗期野生型與lps1不同部位葉表型，標(biāo)尺為2 cm；B～D?野生型與lps1葉綠素a、葉綠素b和類(lèi)胡蘿卜素含量測(cè)定；E?葉綠素合成與代謝相關(guān)基因表達(dá)水平。L1―倒1葉；L2―倒2葉；L3―倒3葉。*和**分別表示野生型與lps1在0.05和0.01水平上差異顯著

Fig.2.Chlorophyll contents and related gene expression analysis at the tillering stage.

2.3 水稻早衰突變體lps1的電鏡分析

為了觀(guān)察葉片表面的微觀(guān)特征，我們對(duì)野生型和分蘗期的葉片進(jìn)行了掃描電鏡觀(guān)察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于缺少針狀突起，葉表面較野生型光滑；的硅質(zhì)化突起排列雜亂，且氣孔周?chē)墓栀|(zhì)化突起顯著減少，氣孔孔徑也明顯大于野生型（圖3）。

圖3 水稻野生型（A～C）和早衰突變體lps1（D～F）葉片下表皮的掃描電鏡（SEM）觀(guān)察

Fig.3.Scanning electron microscope (SEM) observations of the epidermis of the wild type (A?C) and(D?F).

為了進(jìn)一步探討衰老期間中葉綠素水平降低的原因，我們通過(guò)透射電鏡（TEM），比較了分蘗期和野生型中相同部位葉片的葉綠體超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)的葉綠體數(shù)目明顯減少，同時(shí)葉綠體中的嗜鋨顆粒數(shù)明顯增多變大，且淀粉顆粒明顯增多，葉綠體內(nèi)部的片層結(jié)構(gòu)紊亂。這些特征表明，突變可能導(dǎo)致葉綠體發(fā)育不良（圖4）。

N?細(xì)胞核; C?葉綠體; Thy?類(lèi)囊體; S?淀粉顆粒; Og?嗜鋨顆粒。

Fig.4.Transmission electron microscopy (TEM) observation of the wild type (A-C) and(D-F) leaves.

2.4 lps1的衰老生理指標(biāo)分析

活性氧與植物的衰老密切相關(guān)，其過(guò)多積累會(huì)直接殺死細(xì)胞。為了進(jìn)一步探索過(guò)早衰老的原因，我對(duì)分蘗期相同部位的葉片進(jìn)行了DAB和NBT染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在葉片中確實(shí)有大量的棕色和藍(lán)色沉積物（圖5-A、B）。

A?DAB染色; 標(biāo)尺為2 cm；B?NBT染色, 標(biāo)尺為2 cm；C?衰老相關(guān)生理指標(biāo)（過(guò)氧化氫、丙二醛、可溶性蛋白含量、過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶活性）的測(cè)定。*和**分別表示野生型與lps1在0.05和0.01水平上差異顯著。

Fig.5.Physiological and biochemical detection of the wild type and.

同時(shí)，我們也檢測(cè)了野生型與中與衰老相關(guān)的生理指標(biāo)，結(jié)果表明，中H2O2和MDA含量顯著升高，可溶性蛋白質(zhì)含量下降，活性氧清除酶CAT、POD、SOD的活性均顯著下降（圖5-C～H）。這些說(shuō)明中確實(shí)有大量的活性氧積累，同時(shí)可能伴有蛋白質(zhì)的降解和細(xì)胞膜的損傷。

2.5 lps1中的細(xì)胞死亡信號(hào)分析

為了檢測(cè)和野生型葉片中的細(xì)胞凋亡情況，我們利用TUNEL檢測(cè)了分蘗期倒2葉中的細(xì)胞死亡水平。若植物體細(xì)胞出現(xiàn)衰老，基因組DNA會(huì)出現(xiàn)斷裂，通過(guò)染色可以將這些片段染成綠色。檢測(cè)結(jié)果顯示在野生型的葉片細(xì)胞中，極少數(shù)呈現(xiàn)陽(yáng)性，少數(shù)呈現(xiàn)陽(yáng)性的細(xì)胞較小信號(hào)較弱（圖6-A、B），而在中，TUNEL信號(hào)增強(qiáng)且隨機(jī)分布（圖6-C、D），這表明水稻突變誘發(fā)大規(guī)模的細(xì)胞死亡。

2.6 lps1的早衰表型受單隱性核基因控制

通過(guò)觀(guān)察和浙輻802正反交后得到的F1代植株，發(fā)現(xiàn)F1代植株的表型均與野生型一致。F1代植株自交后產(chǎn)生的F2代植株出現(xiàn)早衰表型，進(jìn)一步的觀(guān)察統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，正常表型與早衰表型的比例接近3∶1（表2）。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，證明確實(shí)受一對(duì)隱性單基因控制。

A-D，標(biāo)尺為100 μm。藍(lán)色熒光代表正常細(xì)胞，綠色熒光代表凋亡細(xì)胞。

Fig.6.TUNEL treatment results of the wild type (A and B) and(C and D) leaves.

表2 F2代分離群體統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.7 LPS1編碼一個(gè)泛素結(jié)合酶

我們運(yùn)用F2分離群體對(duì)基因進(jìn)行初步定位，并將其定位到第5染色體長(zhǎng)臂上的2個(gè)分子標(biāo)記（B5-18與B5-19）之間（圖7-A）。通過(guò)開(kāi)發(fā)新的多態(tài)性標(biāo)記，我們最終將其限定在M4與M5之間的77.5 kb的區(qū)間內(nèi)（圖7-B），該區(qū)域包含15個(gè)ORF（圖7-C）。通過(guò)測(cè)序比對(duì)，發(fā)現(xiàn)基因的第1外顯子的566 bp處G突變成A，導(dǎo)致其編碼的氨基酸序列提前終止（圖7-D～F）。研究發(fā)現(xiàn)編碼一個(gè)泛素結(jié)合酶基因（），說(shuō)明是已克隆的一個(gè)新的等位基因。

圖7 LPS1基因的圖位克隆

Fig.7.Map-based cloning ofgene.

2.8 LPS1蛋白的亞細(xì)胞定位

將構(gòu)建好的-GFP載體與空載轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，侵染煙草。通過(guò)激光共聚焦掃描顯微鏡觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)LPS1在細(xì)胞質(zhì)和核中表現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光信號(hào)。由此推測(cè)LPS1蛋白在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中均有表達(dá)（圖8）。

圖8 LPS1蛋白的亞細(xì)胞定位

Fig.8.Subcellular localization ofprotein.

2.9 LPS1對(duì)外源激素的響應(yīng)情況

葉衰老是一種基因控制的發(fā)育過(guò)程，可由各種激素和環(huán)境因子調(diào)節(jié)。為了探究突變后對(duì)外源激素的響應(yīng)情況，我們將野生型和接種在含有不同濃度外源激素的1/2 MS 培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10 d 后分別統(tǒng)計(jì)株高和根長(zhǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在0.2 μmol/L ABA處理下野生型的株高和根長(zhǎng)為無(wú)ABA處理的52%和90%，而的株高和根長(zhǎng)分別為無(wú)ABA處理的41%和160%；在0.25 μmol/L ABA處理下野生型的株高和根長(zhǎng)為無(wú)ABA處理的47%和76%，而的株高和根長(zhǎng)分別為無(wú)ABA處理的34%和93%；不同濃度的ABA處理極大地抑制了的株高，但是在0.2 μmol/L ABA處理下，的根長(zhǎng)明顯伸長(zhǎng)；隨著ABA處理濃度的升高，其根長(zhǎng)又被顯著抑制（圖9）。

A?外源激素處理對(duì)野生型WT(左)和lps1(右)表型的影響，標(biāo)尺為3 cm；B?激素處理后地上部分長(zhǎng)度；C?激素處理后地下部分長(zhǎng)度。*和**分別表示野生型與lps1在0.05和0.01水平上差異顯著。

Fig.9.Effect of exogenous hormone treatment on the wild type andseedlings.

2.10 LPS1影響ABA的代謝

在ABA處理前，與野生型相比，中與ABA合成相關(guān)基因和的表達(dá)量顯著下調(diào)，與ABA降解相關(guān)基因和的表達(dá)水平顯著下調(diào)（圖10-A）；在ABA處理后，中與ABA合成相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)，而的表達(dá)水平下調(diào)，同時(shí)與ABA降解相關(guān)基因顯著下調(diào)（圖10-B）。結(jié)果證實(shí)，在ABA處理前，中與ABA合成和代謝相關(guān)基因的表達(dá)受到抑制，而在ABA處理后，與ABA合成相關(guān)基因（）的表達(dá)水平被顯著上調(diào)，說(shuō)明可以通過(guò)影響ABA的合成途徑響應(yīng)外源ABA的處理。

A?處理前野生型（WT）和lps1中ABA相關(guān)基因表達(dá)水平；B?處理后野生型（WT）和lps1中ABA相關(guān)基因表達(dá)水平；*和**分別表示野生型與lps1在0.05和0.01水平上差異顯著。

Fig.10.ABA synthesis and degradation related gene expression levels.

3 討論

植物衰老是一個(gè)受基因調(diào)控的高度復(fù)雜和有序的過(guò)程，具有多層次、多途徑的特點(diǎn)，葉片衰老是水稻衰老的主要表現(xiàn)形式。在3葉期就出現(xiàn)黃葉表型，并且隨著植株的生長(zhǎng)，其黃化的面積逐漸增大，葉尖出現(xiàn)枯死現(xiàn)象（圖1）。伴隨著葉色的改變，結(jié)構(gòu)與生理生化方面亦發(fā)生諸多變化。電鏡結(jié)果顯示，的硅質(zhì)化突起與葉綠體的數(shù)量明顯減少，一般認(rèn)為水稻表皮硅質(zhì)化特性具有屏障保護(hù)作用，并與葉片機(jī)動(dòng)細(xì)胞的開(kāi)閉有關(guān)，從而影響水稻的蒸騰作用[45]。早有研究表明，葉片表面硅質(zhì)化突起數(shù)目的減少不僅使植株變矮，而且還影響根系生長(zhǎng)，導(dǎo)致結(jié)實(shí)率下降[46-48]。葉綠體是光合作用的主要器官，也是ROS產(chǎn)生的重要部位。葉綠體結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致H2O2、O2?和MDA大量積累[49]。細(xì)胞內(nèi)大量的MDA可以破壞蛋白質(zhì)、脂類(lèi)和葉綠素等的活性，使細(xì)胞喪失多種生理功能引起細(xì)胞過(guò)氧化，導(dǎo)致細(xì)胞死亡信號(hào)增強(qiáng)，加劇水稻葉片的衰老進(jìn)程[50]。

本研究利用圖位克隆的手段將該基因定位到第5染色體上，并通過(guò)測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)是的一個(gè)等位基因。但是由于其突變方式以及突變位點(diǎn)的差異，導(dǎo)致其編碼產(chǎn)物產(chǎn)生較大差異。同時(shí)，它們的衰老表型亦有所不同。在成熟期表現(xiàn)出葉尖枯死表型[51]，而從3葉期就表現(xiàn)出黃葉與葉尖枯死，并且一直持續(xù)到成熟期。Hu等[48]研究發(fā)現(xiàn)是miR399下游的一個(gè)關(guān)鍵的Pi饑餓信號(hào)成分，參與水稻多種Pi饑餓反應(yīng)的調(diào)節(jié)。突變導(dǎo)致Pi的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)異常，Pi在嫩葉中的過(guò)度積累，最終導(dǎo)致葉尖枯死。

ABA一直被認(rèn)為是促進(jìn)植物衰老的正向調(diào)節(jié)物質(zhì)[52]。本研究發(fā)現(xiàn)的早衰表型可能是由于突變，體內(nèi)ABA代謝信號(hào)異常所致。早有研究表明，ABA可以通過(guò)誘導(dǎo)H2O2的產(chǎn)生，引起植物葉片的衰老。對(duì)玉米、水稻的離體葉片進(jìn)行ABA處理后，顯著引起離體葉片中H2O2和MDA含量升高，葉綠素含量下降，進(jìn)而加速葉片衰老[40-41]。本研究通過(guò)不同濃度的ABA處理水稻幼苗，發(fā)現(xiàn)對(duì)ABA異常敏感，并且ABA處理后，中的表達(dá)水平顯著上調(diào)，說(shuō)明突變可以促進(jìn)ABA的合成。與此同時(shí)，研究表明中類(lèi)胡蘿卜素含量極顯著升高，而類(lèi)胡蘿卜素為ABA合成的前體物質(zhì)。因此我們推測(cè)，突變導(dǎo)致體內(nèi)類(lèi)胡蘿卜素含量異常升高，促使內(nèi)源ABA合成增多，進(jìn)而引發(fā)H2O2、MDA等一系列與衰老相關(guān)生理指標(biāo)的升高和降低，最終導(dǎo)致過(guò)早衰老。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)EMS誘變得到一份早衰突變體，發(fā)現(xiàn)從3葉期開(kāi)始衰老，葉表面硅質(zhì)化突起及葉綠體數(shù)目減少、片層結(jié)構(gòu)紊亂，最終導(dǎo)致植株結(jié)實(shí)率降低、產(chǎn)量減少。生理實(shí)驗(yàn)表明，中葉綠素水平下降，ROS過(guò)量積累，細(xì)胞死亡加重。遺傳分析與圖位克隆發(fā)現(xiàn)，位于第5染色體，是泛素結(jié)合酶基因的新等位基因，其編碼的蛋白在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中均有表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，可能參與ABA的代謝途徑，最終導(dǎo)致產(chǎn)生早衰表型。本研究為激素介導(dǎo)水稻葉片衰老提供了新思路，并進(jìn)一步豐富了調(diào)控水稻葉片早衰的網(wǎng)絡(luò)機(jī)制。

[1] Cao J, Jiang F, Sodmergen, Cui K M.Time-course of programmed cell death during leaf senescence in[J]., 2003, 116(1): 7-12.

[2] Vicky B W.The molecular biology of leaf senescence[J]., 1997, 48(2): 181-199.

[3] Lim P O, Kim H J, Nam H G.Leaf senescence[J]., 2007, 58(1): 115-136.

[4] Zhang H S, Zhou C J.Signal transduction in leaf senescence[J]., 2013, 82(6): 539-545.

[5] Panda D, Sarkar R K.Natural leaf senescence: Probed by chlorophyll fluorescence, CO2photosynthetic rate and antioxidant enzyme activities during grain filling in different rice cultivars[J]., 2013, 19(3): 43-51.

[6] Li Z H, Zhang Y, Zou D, Zhao Y, Wang H L, Zhang Y, Xia X L, Luo J C, Zhang Z.LSD 3.0: A comprehensive resource for the leaf senescence research community[J]., 2020, 48(D1): D1069-D1075.

[7] Mao C J, Lu S C, Lü B, Zhang B, Shen J B, He J M, Luo L Q, Xi D D, Chen X, Ming F.A rice NAC transcription factor promotes leaf senescence via ABA biosynthesis[J]., 2017, 174(3): 1747-1763.

[8] Liang C Z, Wang Y Q, Zhu Y N, Tang J Y, Hu B, Liu L C, Ou S J, Sun X H, Chu J F, Chu C C.connects abscisic acid and leaf senescence by fine-tuning abscisic acid biosynthesis and directly targeting senescence- associated genes in rice[J]., 2014, 111(27): 10013-10018.

[9] Han M, Kim C Y, Lee J, Lee S K, Jeon J S.represses OsMT1d and induces reactive oxygen species and leaf senescence in rice[J]., 2014, 37(7): 532-539.

[10] Uji Y, Akimitsu K, Gomi K.Identification of-regulated senescence-associated genes in rice[J]., 2017, 245(6): 1241-1246.

[11] Lu G W, Casaretto J A, Ying S, Mahmood K, Liu F, Bi Y M, Rothstein S J.Overexpression ofregulates chlorophyll content, delays plant senescence and improves rice yield under high density planting[J]., 2017, 94(1): 215-227.

[12] Liu W Z, Fu Y P, Hu G C, Si H M, Wu C, Sun Z X.Identification and fine mapping of a thermo-sensitive chlorophyll deficient mutant in rice (L.)[J]., 2007, 226(3): 785-795.

[13] Liu C H, Zhu H T, Xing Y, Tan J J, Chen X H, Zhang J J, Peng H F, Xie Q J, Zhang Z M.is involved in the splicing of chloroplast group I and II introns in rice[J]., 2016, 67(18): 5339-5347.

[14] Kusaba M, Ito H, Morita R, Iida S, Sato Y, Fujimoto M, Kawasaki S, Tanaka,R, Hirochika H, Nishimura M, Tanaka A.Riceis involved in light-harvesting complex II and grana degradation during leaf senescence[J]., 2007, 19(4): 1362-1375.

[15] Rong H, Tang Y Y, Zhang H, Wu P Z, Chen Y P, Li M R, Wu G J, Jiang H W.The() gene regulates chlorophyll degradation in rice[J]., 2013, 170(15): 1367-1373.

[16] Fang C Y, Zhang H, Wan J, Wu Y Y, Chen W, Wang S C, Wang W S, Zhang H W, Zhang F, Qu L H, Liu X Q, Zhou D X, Luo J.Control of leaf senescence by an MeOH-jasmonates cascade that is epigenetically regulated byin rice[J]., 2016, 9(10): 1366-1378.

[17] Xu W Y, Kong Z S, Li M N, Yang W Q, Xue Y B.A novel nuclear-localized CCCH-type ainc finger protein,, is involved in delaying leaf senescence in rice[J]., 2006, 141(4): 1376-1388.

[18] Chen Y, Xu Y Y, Luo W, Li W X, Chen N, Zhang D J, Chong K.The F-Box protein OsFBK12 targets OsSAMS1 for degradation and affects pleiotropic phenotypes, including leaf senescence, in rice[J]., 2013, 163(4): 1673-1685.

[19] Zhao Y, Chan Z L, Gao J H, Xing L, Cao M J, Yu C M, Hu Y L, You J, Shi H T, Zhu Y F, Gong Y H, Mu Z X, Wang H Q, Deng X, Wang P C, Bressan R A, Zhu J K.ABA receptor PYL9 promotes drought resistance and leaf senescence[J]., 2016, 113(7): 1949-1954.

[20] Yang X, Gong P, Li K Y, Huang F D, Cheng F M, Pan G.A single cytosine deletion in thegene encoding vacuolar-type H+-ATPase subunit A1 leads to premature leaf senescence and seed dormancy in rice[J]., 2016, 67(9): 2761-2776.

[21] Zhou Y, Liu L, Huang W F, Yuan M, Zhou F, Li X H, Lin Y J.Overexpression ofin rice causes growth retardation and precocious senescence[J]., 2014, 9(4): e94210.

[22] Singh S, Singh A, Nandi A K.The ricegene codes for a functional protease that negatively regulates stress-induced cell death[J]., 2016, 41(3): 445-453.

[23] Wu L W, Ren D Y, Hu S K, Li G M, Dong G J, Jiang L, Hu X M, Ye W J, Cui Y T, Zhu J, Zhang G H, Gao, Z Y, Zeng, D L, Qian Q, Guo L B.Down-regulation of a nicotinate phosphoribosyltransferase geneleads to withered leaf tips[J]., 2016, 171(2): 1085-1098.

[24] Lee R H, Hsu J H, Huang H J, Lo S F, Grace S C.Alkaline α-galactosidase degrades thylakoid membranes in the chloroplast during leaf senescence in rice[J]., 2009, 184(3): 596-606.

[25] Kang K, Kim Y S, Park S, Back K.Senescence-induced serotonin biosynthesis and its role in delaying senescence in rice leaves[J]., 2009, 150(3): 1380-1393.

[26] Kudo T, Makita N, Kojima M, Tokunaga H, Sakakibara H.Cytokinin activity of-zeatin and phenotypic alterations induced by overexpression of putative-zeatin glucosyltransferase in rice[J]., 2012, 160(1): 319-331.

[27] Wiseman B R.Plant-resistance to insects in integrated pest-management[J]., 1994, 78(9): 927-932.

[28] Liang C Z, Chu C C.Towards understanding abscisic acid-mediated leaf senescence[J]., 2015, 58(5): 506-508.

[29] Pan H R, Liu S M, Tang D Z., a component of the THO/TREX complex, plays an important role in disease resistance and senescence in[J]., 2012, 69(5): 831-843.

[30] Hu Y N, Jiang Y J, Han X, Wang H P, Pan J J, Yu D Q.Jasmonate regulates leaf senescence and tolerance to cold stress: Crosstalk with other phytohormones[J]., 2017, 68(6): 1361-1369.

[31] Dani K G S, Fineschi S, Michelozzi M, Loreto F.Do cytokinins, volatile isoprenoids and carotenoids synergically delay leaf senescence[J]., 2016, 39(5): 1103-1111.

[32] Kim J I, Murphy A S, Baek D, Lee S W, Yun D J, Bressan R A, Narasimhan M L.over-expression demonstrates auxin function in delaying leaf senescence in[J]., 2011, 62(11): 3981-3992.

[33] Chen L G, Xiang S Y, Chen Y L, Li D B, Yu D Q.interacts with the DELLA protein RGL1 to positively regulate age-triggered leaf senescence[J]., 2017, 10, 1174-1189.

[34] Riefler M, Novak O, Strnad M, Schmülling T.cytokinin receptor mutants reveal functions in shoot growth, leaf senescence, seed size, germination, root development, and cytokinin metabolism[J]., 2006, 18(1): 40-54.

[35] Wang T, Li C X, Wu Z H, Jia Y C, Wang H, Sun S Y, Mao C Z, Wang X L.Abscisic acid regulates auxin homeostasis in rice root tips to promote root hair elongation[J]., 2017, 8: 1121-1138.

[36] Xu N, Chu Y L, Chen H L, Li X X, Wu Q, Jin L, Wang G X, Huang J L.Rice transcription factormodulates root growth and confers salinity tolerance via the ABA-mediated regulatory pathway and ROS scavenging[J]., 2018, 14(10): e1007662.

[37] Chang Y, Nguyen B H, Xie Y J, Xiao B Z, Tang N, Zhu W L, Mou T M, Xiong L Z.Co-overexpression of the constitutively active form ofand ABA-activated protein kinaseimproves drought and temperature stress resistance in rice[J]., 2017, 8: 1102-1117.

[38] Promchuea S, Zhu Y J, Chen Z Z, Zhang J, Gong Z Z.coordinates with PLETHORAs and PINs to orchestrate ABA-mediated root meristem activity in[J]., 2017, 59(1): 30-43.

[39] Sun L R, Wang Y B, He S B, Hao F S.Mechanisms for abscisic acid inhibition of primary root growth[J]., 2018, 13(9): e1500069.

[40] Hung K T, Yi T H, Kao C H.Hydrogen peroxide is involved in methyl jasmonate-induced senescence of rice leaves[J]., 2006, 127(2): 293-303.

[41] 李兆偉.水稻葉片早衰突變體的糖代謝基因表達(dá)與抗氧化生理調(diào)控[D].杭州: 浙江大學(xué), 2014.

Li Z W.The expression alteration of various genes related to sugar metabolism in senescing leaves and its antioxidation modulation formutant[D].Hangzhou: Zhejiang University, 2014.

[42] Lichtenthaler H K.Chlorophylls and carotenoids: Pigments of photosynthetic biomembranes[J]., 1987, 148: 350-382.

[43] 游均, 方玉潔, 熊立仲.活性氧檢測(cè)[J/OL]., 2018: e1010170.

You J, Fang Y J, Xiong L Z.Reactive oxygen detection [J/OL]., 2018: e1010170.(in Chinese)

[44] Rao Y C, Jiao R, Wang S, Wu X M, Ye H F, Pan C Y, Li S F, Xin D D, Zhou W Y, Dai G X, Hu J, Ren D Y, Wang Y X.encodes a receptor-like protein kinase that regulates programmed cell death and defense responses in rice[J]., 2021, 14(1): 34-47.

[45] 沈恒勝, 陳君琛, 黃進(jìn)華, 湯葆莎.水稻葉表皮硅體顯微結(jié)構(gòu)及其分布[J].福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 34(2): 137-140.

Shen H S, Chen J C, Huang J H, Tang B S.Microtructure and distribution of silica bodies rice epidermis[J]., 2005, 34(2): 137-140.(in Chinese with English abstract)

[46] 楊秉耀, 陳新芳, 劉向東, 郭海濱.水稻不同品種葉表面硅質(zhì)細(xì)胞的掃描電鏡觀(guān)察[J].電子顯微學(xué)報(bào), 2006, 25(2): 68-72.

Yang B Y, Chen X F, Liu X D, Guo H B.Scanning electron microscopic observation of silicon cells on the leaf surface of different rice varieties [J]., 2005, 25(2): 68-72.

[47] Christopher E.A possible mechanism of biological silicification in plants[J]., 2015, 6: 853-859.

[48] Yang L, Han Y Q, Li P, Li F, Ali S, Hou M L.Silicon amendment is involved in the induction of plant defense responses to a phloem feeder[J]., 2017, 7(1): 4232-4240.

[49] Hideg E, Kálai T, Kós P B, Asada K, Hideg K.Singletoxygen in plants: Its significance and possible detection with double (fluorescent and spin) indicator reagents[J]., 2006, 82(5): 1211-1218.

[50] 華春, 王仁雷.雜交稻及其三系葉片衰老過(guò)程中SOD、CAT活性和MDA含量的變化[J].西北植物學(xué)報(bào), 2003, 23(3): 406-409.

Hua C, Wang R L.Changes of SOD and CAT activities and MDA content during senescence of hybrid rice and three lines leaves[J]., 2003, 23(3): 406-409.

[51] Hu B, Zhu C G, Li F, Tang J Y, Wang Y Q, Liu L C, Che R H, Chu C C.plays a pivotal role in the regulation of multiple phosphate starvation responses in rice[J]., 2011, 156(3): 1101-1115.

[52] Lee I C, Hong S W, Whang S S, Lim P O, Nam H G, Koo J C.Age-dependent action of an ABA-inducible receptor kinase, RPK1, as a positive regulator of senescence inleaves[J]., 2011, 52(4): 651-662.

Cloning and Functional Analysis of Leaf Senescence Genein

CHU Xiaojie1, LU Tao1, YE Hanfei1, WANG Sheng1, LIN Han1, WU Xianmei2, HE Rui2, YAN Gang1,WANG Yuexing2, LI Sanfeng2, LU Mei1, HU Haitao1, *, YANG Yaolong2, *, RAO Yuchun1, *

(1College of Chemistry and Life Sciences, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, China;2China National Center for Rice Improvement / State Key Laboratory of Rice Biology, China National Rice Research Institute, Hangzhou 310006, China;*Corresponding author, E-mail: ryc@zjnu.cn, yangxiao182@126.com, haitao-hu@zjnu.cn)

【Objective】As a good carrier, the premature aging mutant plays an important role in exploring the genetic mechanism and mechanism of action on premature aging, as well as improving grain yield and quality of rice.【Method】In this study, a prematuresenescence mutantwas obtained by EMS mutagenesis, and phenotypic observation, cytological and histochemical analysis, physiological and biochemical analysis, genetic analysis, gene localization and hormone treatment were performed on wild-type and mutants.【Result】The leaves ofbegan to turn yellow during the three-leaf stage, and the plant height, effective tiller number, seed-setting rate, and thousand-grain weight were extremely significantly reduced in the maturing stage.Electron microscopy observation found that the surface ofleaves was smooth, the numbers of silicified protrusions and chloroplasts decreased, and the lamella structure was disordered.Physiological and biochemical analysis showed that a large amount of reactive oxygen species accumulated in mutant, accompanied by protein degradation, cell membrane damage and large-scale cell death.Genetic analysis showed that the progeria phenotype was controlled by a single recessive nuclear gene, which encodes an ubiquitin conjugating enzyme on chromosome 5.The subcellular localization results prove that LPS1 protein is expressed in both the cytoplasm and the nucleus.Exogenous hormone treatment demonstrated that thewas more sensitive to exogenous hormone treatment, and themutation promoted the expression of genes related to ABA synthesis.【Conclusion】mutation makes the rice ABA synthesis signal pathway abnormal, which in turn triggers abnormal changes in a series of aging-related physiological indicators such as H2O2, leading to premature senescence of, and ultimately resulting in a serious decrease in rice yield.

rice; premature senescence; genetic analysis; subcellular localization; hormone

10.16819/j.1001-7216.2021.210303

2021-03-04；

2021-04-12。

國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)(2016ZX08009003-003-008)；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31971921)；廣西水稻遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金資助項(xiàng)目；中國(guó)水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放項(xiàng)目(20200102)。